Name: analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

Dette arbejde støttes af National Institutes of Health (NIH) tilskud R01 HL144777 (MVW).

Undersøgelser udført på gnavere fulgte Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og blev godkendt af University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Til denne undersøgelse blev myocytter isoleret fra 3-34 måneder gamle Sprague-Dawley og F344BN rotter, der vejer ≥ 200 g5. Både mandlige og kvindelige satser blev brugt.
1. Myocyttempo til kontraktile funktionsundersøgelser
<ol><li>Lav friske M1...

<ol>
	<li>Reihle, C., Bauersachs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+of+heart+failure.">Small animal models of heart failure.</a> Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).</li><li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease.">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li><li>Rossman, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+frequency-dependent+responses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+in+human+myocardium.">Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).</li><li>McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+myofilament+contractile+function+in+human+donor+and+failing+hearts.">Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).</li><li>Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+contractile+dysfunction+and+protein+kinase+C-mediated+myofilament+phosphorylation+in+disease+and+aging.">Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging.</a> The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).</li><li>Chaudhary, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+myocardial+Ca2++cycling+after+left+ventricular+assist+device+support+in+failing+human+heart.">Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).</li><li>Walker, C. A., Spinale, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+the+cardiac+myocyte:+A+review+of+fundamental+concepts.">The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).</li><li>Lang, S. E., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cardiac+myocytes.">Gene transfer into cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+heart+performance+by+gene+transfer.">Designing heart performance by gene transfer.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).</li><li>Sweitzer, N. K., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+loaded+shortening+velocity+in+single+cardiac+myocytes+permeabilized+with+a-hemolysin.">Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin.</a> Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).</li><li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloaded+shortening+increases+peak+of+Ca2++transients+but+accelerates+their+decay+in+rat+single+cardiac+myocytes.">Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).</li><li>Racca, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+developing+human+fetal+cardiac+muscle.">Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle.</a> The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+expression+and+basal+lamina+remodeling+in+human+heart+failure.">Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure.</a> Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).</li><li>Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody+effects+on+cellular+function+of+isolated+cardiomyocytes.">Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).</li><li>Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+future+of+probenecid.">The history and future of probenecid.</a> Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).</li><li>Sakthivel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+analysis+of+cardiac+troponin+I+phosphorylation.">In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2+-ATPase+during+progression+of+left+ventricular+hypertrophy.">Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy.</a> The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).</li><li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+basis+of+Starling's+law+of+the+heart:+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume.">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li><li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart.">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li><li>Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shortening+and+[Ca2+]+dynamics+of+left+ventricular+myocytes+isolated+from+exercise-trained+rats.">Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).</li></ol>

Den kroniske tempoprotokol, der er skitseret i trin 1, forlænger den nyttige tid til at studere isolerede myocytter og vurdere virkningen af længere behandlinger. I vores laboratorium blev der opnået konsistente resultater op til 4 dage efter isolering ved måling af kontraktil funktion ved hjælp af sarkomerlængde på kronisk pacede myocytter. Myocytkontraktil funktion forværres dog hurtigt, når du bruger medier, der er ældre end 1 uge til at pace myocytter.
For kontraktile funktionsun...

Analysen af hjertepumpefunktionen kræver ofte en række tilgange for at få tilstrækkelig indsigt, især for dyremodeller af hjertesvigt (HF). Ekkokardiografi eller hæmodynamiske målinger giver indsigt i in vivo hjertedysfunktion1, mens in vitro-tilgange ofte anvendes til at identificere, om dysfunktion opstår som følge af ændringer i myofilamentet og / eller Ca2+ forbigående, der er ansvarlig for kobling af excitation eller handlingspotentialet med kontraktil funktion (f.eks. excitation-sammentrækning [E-C] kobling). In vitro-tilgange giver også mulighed for at screene det funktionelle respons på neurohormoner, vektorinducerede genetiske ændringer samt potentielle terapeutiske midler2 , inden der forfølges dyre og / eller besværlige in vivo-behandlingsstrategier .
Der findes flere metoder til at undersøge in vitro kontraktil funktion, herunder kraftmålinger i intakt trabeculae3 eller permeabiliserede myocytter4, samt losset forkortelse og Ca2+ transienter i intakte myocytter i nærvær og fravær af HF 5,6. Hver af disse tilgange fokuserer på hjertemyocytkontraktil funktion, som er direkte ansvarlig for hjertepumpefunktion 2,7. Analysen af både sammentrækning og E-C-kobling udføres dog oftest ved at måle forkortelse af muskellængden og Ca 2+ transienter i isolerede, Ca2+ tolerante voksne myocytter. Laboratoriet bruger en detaljeret offentliggjort protokol til at isolere myocytter fra rottehjerter til dette trin8.
Både Ca2+ forbigående og myofilamenter bidrager til forkortelse og forlængelse i intakte myocytter og kan bidrage til kontraktil dysfunktion 2,7. Således anbefales denne fremgangsmåde, når in vitro funktionel analyse kræver en intakt myocyt indeholdende Ca2+ cykelmaskiner plus myofilamenterne. For eksempel er intakte isolerede myocytter ønskelige til undersøgelse af kontraktil funktion efter ændring af myofilamentet eller Ca2+ cykelfunktionen via genoverførsel9. Derudover foreslås en intakt myocyttilgang til analyse af neurohormonernes funktionelle virkning, når man studerer virkningen af nedstrøms anden messenger-signalveje og / eller respons på terapeutiske midler2. En alternativ måling af belastningsafhængig kraft i enkelte myocytter udføres oftest efter membranpermeabilisering (eller flåning) ved lave temperaturer (≤15 °C) for at fjerne Ca2+ forbigående bidrag og fokusere på myofilamentfunktion10. Måling af belastningsafhængig kraft plus Ca2+ transienter i intakte myocytter er sjælden på grund af den komplekse og tekniske udfordring ved tilgang11, især når der er behov for højere gennemstrømning, såsom til måling af reaktioner på neurohormonsignalering eller som en skærm for terapeutiske midler. Analysen af hjertetrabeculae overvinder disse tekniske udfordringer, men kan også påvirkes af ikke-myocytter, fibrose og / eller ekstracellulær matrixombygning2. Hver af de ovenfor beskrevne tilgange kræver et præparat indeholdende voksne myocytter, fordi neonatale myocytter og myocytter afledt af inducerbare pluripotente stamceller (iPSC'er) endnu ikke udtrykker det fulde komplement af voksne myofilamentproteiner og normalt mangler niveauet af myofilamentorganisation, der er til stede i den voksne stavformede myocyt2. Til dato tyder beviser i iPSC'er på, at den fulde overgang til voksne isoformer overstiger mere end 134 dage i kultur12.
I betragtning af denne samlings fokus på HF inkluderer protokollerne tilgange og analyse til at differentiere kontraktil funktion i svigtende versus ikke-svigtende intakte myocytter. Repræsentative eksempler er givet fra rottemyocytter undersøgt 18-20 uger efter en supra-renal coarctation, beskrevet tidligere 5,13. Der foretages derefter sammenligninger med myocytter fra shambehandlede rotter.
Protokollen og billeddannelsesplatformen beskrevet her bruges til at analysere og overvåge ændringer i forkortelse og Ca2+ transienter i stavformede hjertemyocytter under udviklingen af HF. Til denne analyse belægges 2 x 104 Ca 2+-tolerante, stavformede myocytter på22 mm2 lamininbelagte glasdæksler (CS'er) og dyrkes natten over, som beskrevet tidligere8. De komponenter, der er samlet til denne billeddannelsesplatform, sammen med de medier og buffere, der bruges til optimal billeddannelse, findes i materialetabellen. En guide til dataanalyse ved hjælp af en software og de repræsentative resultater findes også her. Den overordnede protokol er opdelt i separate underafsnit, hvor de første tre sektioner fokuserer på isolerede rottemyocytter og dataanalyse efterfulgt af cellulære Ca2+ forbigående eksperimenter og dataanalyse i myocytter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEDIA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma (Roche)</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Final concentration = 0.2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-6529</td>
			<td>Final concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-7006</td>
			<td>Final concentration = 15 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-2520</td>
			<td>1 bottle makes 1 L; pH 7.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8875</td>
			<td>Final concentration = 4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>F1221</td>
			<td>50 &#956;g/vial;&#160; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;&#160; Final Fura2-AM concentration in media is&#160; 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenicid</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>P36400</td>
			<td>Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 22&#160; mm2 glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2845-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 36 inch cables with banana jacks</td>
			<td>Pomona Electronics</td>
			<td>B-36-2</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37oC Incubator&#160; with 95% O2:5% CO2&#160;</td>
			<td>Forma</td>
			<td>3110</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel E.&#160; Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp</td>
			<td>Forma</td>
			<td>1286</td>
			<td>Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 5/45</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1800-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low magnification inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM-IL&#160;</td>
			<td>Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; &#160;4X and 10X objectives recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing chamber</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ID in Supplemental Figure 2 &#38; Alternatives/Recommended Options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional components for Ca2+ imaging analysis</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Essential system components: -- Photon counting system&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Xenon power supply with dual excitation light source&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Fluorescence interface</td>
			<td>&#160;- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera&#160; (panel A #4).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm&#160; excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The fluorescence interface between the computer and&#160; light source is shown in panel B, #12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera with image acquisition&#160; hardware and software (240 frames/s)</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myocam with CCD controller&#160;</td>
			<td>Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4&#160; and&#160; panel A #5 &#38; panel C #5 (right), respectively.&#160; The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Chamber stimulator</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Panel B, #13; Alternative:&#160; Grass model S48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip mounted perfusion chamber</td>
			<td>Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws&#160; (arrow, panel F)</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #10 &#38; panel F;&#160;&#160; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).&#160; Commercial alternatives:&#160; Ionoptix FHD or C-stim cell&#160; chambers; Cell MicroControls culture stimulation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dedicated computer &#38; software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>PC with Ionwizard PC board and software</td>
			<td>Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric&#160; Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. 
			- A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.&#160; The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 TI</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Panel F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated tube holder for media</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam &#38; a pre-heated gel pack to keep media warm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted brightfield microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-2000S</td>
			<td>Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.&#160; &#160;A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolator Table</td>
			<td>TMC Vibration Control</td>
			<td>30 x 36 inches</td>
			<td>Panel A, #1; Desirable:&#160; elevated shelving, Faraday shielding&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope eyepieces &#38; objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective</td>
			<td>Panel A #3; 40X objective:&#160; n.a. 0.08; w.d. 2 mm.&#160; A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;NOTE:&#160; water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>Panel A #8 and panel E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small weigh boat</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Cell MicroControls</td>
			<td>TC2BIP</td>
			<td>Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.&#160;&#160;&#160; A preheater and objective heater are recommended for this platform.&#160; A Cell MicroControls HPRE2 preheater and&#160; HLS-1 objective heater are controlled&#160; by the TC2BIP temperature controller for our studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Under cabinet LED light with motion sensor&#160;</td>
			<td>Sylvania</td>
			<td>#72423 LED light</td>
			<td>Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..&#160; Alternative:&#160; A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask &#38; protective filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Tygon tubing - E363;&#160; polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90</td>
			<td>Panel A #11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes

Kontraktil dysfunktion og Ca2+ transienter analyseres ofte på celleniveau som en del af en omfattende vurdering af hjerteinduceret skade og / eller ombygning. En tilgang til vurdering af disse funktionelle ændringer anvender ubelastet forkortelse og Ca2+ forbigående analyser i primære voksne hjertemyocytter. Til denne fremgangsmåde isoleres voksne myocytter ved kollagenasefordøjelse, gøres Ca2+ tolerant og klæbes derefter til lamininbelagte dæksler efterfulgt af elektrisk tempo i serumfrie medier. Den generelle protokol anvender voksne rotte hjertemyocytter, men kan let justeres til primære myocytter fra andre arter. Funktionelle ændringer i myocytter fra skadede hjerter kan sammenlignes med falske myocytter og / eller med in vitro terapeutiske behandlinger. Metoden inkluderer de væsentlige elementer, der er nødvendige for myocyttempo, sammen med cellekammeret og platformkomponenterne. Den detaljerede protokol for denne tilgang inkorporerer trinene til måling af ubelastet forkortelse ved sarkomerlængdedetektion og cellulære Ca2+ transienter målt med den ratiometriske indikator Fura-2 AM samt til rådataanalyse.

Kontraktile funktionsundersøgelser udføres på rottemyocytter fra dagen efter isolering (dag 2) op til 4 dage efter isolation. Selvom myocytter kan registreres dagen efter isolering (dvs. dag 2), kræves der ofte længere kulturtider efter genoverførsel eller behandlinger for at ændre kontraktil funktion8. For myocytter, der dyrkes i mere end 18 timer efter isolering, hjælper pacingprotokollen beskrevet i punkt 1 med at opretholde t-tubuli og konsekvente afkortnings- og forlængelsesresultate...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Et sæt protokoller præsenteres, der beskriver måling af kontraktil funktion via sarkomerlængdedetektion sammen med calcium (Ca2+) forbigående måling i isolerede rottemyocytter. Anvendelsen af denne tilgang til undersøgelser i dyremodeller af hjertesvigt er også inkluderet.

Analyse af hjertekontraktil dysfunktion og Ca2+ forbigående i gnavermyocytter

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Denne tilgang registrerer ændringer i kontraktil funktion under udviklingen af hjertesvigt. Det funktionelle respons i myocytter på neurohormoner og potentielle terapeutiske midler kan også screenes. Positionering af myocytten kan tage øvelse, men er afgørende for at opnå ensartet sarkomerlængdebilleddannelse.Margaret Westfall, lektor og hovedforsker ved laboratoriet, demonstrerer proceduren. Før eksperimentet påbegyndes, forvarmes en gelpakke og medier i en inkubator ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Tænd for de kontraktile funktionsplatformskomponenter som nævnt i manuskriptet, og saml slanger i den peristaltiske pumpe.Overfør derefter den forvarmede gelpakke til rørholderen, og tænd for vakuumet i strømmen til cellestimulatoren. Placer et 50 ml rør med medier i den isolerede rørholder for at begynde perfusion ved 0,5 ml i minuttet gennem peristaltisk pumpeslange. Tilsæt derefter to milliliter forvarmede medier til en lille vejebåd og overfør en dækslip indeholdende myocytter fra stimuleringskammeret til vejebåden.Returner stimuleringskammeret til inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Fjern dækselsedlen fra vejebåden, og tør forsigtigt undersiden af, før du overfører den til et nysmurt dæksletkammer og tilføjer en dråbe medier på dækslip. Placer en platinelektrodemontering over dækslip, læg derefter en ny dækseddel over toppen med tang, og placer en topmontering over dækslipsandwichen.Installer to eller fire nummer nul panhead skruer for at afslutte samlingen af kammeret. I den peristaltiske pumpe, når mediet er til stede i hele slangen, skal du fastgøre slangen til forvarmeren og forvarmeren til dækslipkammeret. Begynd derefter perfusion ved 0,5 ml i minuttet, og læg en vævsserviet under kammeret for at sikre, at der ikke lækker noget.Når dækselsslipkammeret er placeret i mikroskopets trinadapter, skal du tænde for varmesystemet og ligestille samlingen i fem til 10 minutter for at opnå en konstant medietemperatur på 37 grader Celsius i midten af kammeret. Overhold de perfunderede medier, der opsamles i den modsatte ende af kammeret med slanger forbundet til et vakuumsystem. I løbet af ækvilibreringstiden visualiseres myocytter med 40x vandnedsænkningsmålet på mikroskopet.For at aktivere tempostimulatoren skal du indstille spændingen til 35 til 40 volt og justere stimuleringsfrekvensen til 0,2 hertz for at optimere kontraktil funktion og myocytoverlevelse. For at indsamle sarcomereforkortelsesspor skal du åbne softwaren på computeren og vælge okay, fil og nye faner. Forbered en skærmskabelon ved at vælge spor, redigere brugergrænser og sarkomerlængde.Optag sarkomerlængdespor med filen og nye faner, identificer en kontraherende myocyt og placer myocytten langs kameraets længdeakse, så striationsmønsteret er lodret. Brug computermusen til at placere interesseområdet eller ROI-boksen over myocytten. Vælg indsamle og begynde at optage kontraktil funktion.Optag forkortelse i 60 sekunder fra hver myocyt ved lave stimuleringsfrekvenser på 0,5 hertz. Optag sarkomerforkortelse fra fem til 10 celler pr. Dækslip. For at måle forkortelse over en række frekvenser skal du placere myocytterne ved hver frekvens for at opnå steady state-forkortelse inden optagelse.Fordobling af perfusionshastigheden og begynd at optage 15 til 20 sekunder efter stimulering ved en ny frekvens i området 0,2 til to hertz og optag ikke mere end to myocytter pr. dækslip for at forkorte over det givne spektrum af stimuleringsfrekvenser. Optag mindst syv sammentrækninger pr. celle for at opnå pålidelige signalgennemsnitsdata. Vælg filen, vælg en optaget sporing, og vælg derefter Åbn.Vælg fane en af basissporingen, og indstil derefter det gule panel øverst på sporingen for at opnå sarklængde. Forbered en analyseskabelon med operationer monotone forbigående analyseindstillinger og TTL-hændelsesmærke i definitionen af T Zero-boksen i de nødvendige indstillinger fra menuen. Gem disse analyseindstillinger ved at vælge skabeloner og gemme analyseskabelon med et id.Indlæs analyseskabelonen, før du analyserer hver sporing. For at analysere dataene skal du vælge mærker, gate, tilføje forbigående og derefter konvertere fra begivenhedsmærke og analyseområde. Indstil tidsintervallet fra minus 0,01 til 1,20 sekunder for myocytter paced på 0,2 hertz.Vælg et kortere tidsinterval for myocytter stimuleret ved højere frekvenser. Vælg operationer og gennemsnitlige hændelser for at producere en gennemsnitlig signaloptagelse under det oprindelige basisspor. Vælg derefter fanen en af signalgennemsnitssporingen, og gå derefter til mærker i den øverste menu efterfulgt af tilføj forbigående, vælg operationer og monoton forbigående analyse for at få vist signalgennemsnitsværdierne for baseline sarcomereparametre i signalgennemsnittet.Vælg eksporter monoton transient analyse og udklipsholderstrøm og overfør forbigående sarcomere analyse til et regneark til sammensat analyse af flere myocytter. Hvis du vil kopiere signalgennemsnitssporingen, skal du vælge eksport, aktuel sporing, derefter udklipsholder og fanerne indstillinger i rækkefølge og indstille decimalerne til fem. Vælg faneafgrænser, og klik på okay.Tempo signalets gennemsnitlige spor for hver myocytoptagelse i et andet regneark. Undersøgelsen viste, at trykoverbelastningen eller PO reducerede myocytternes kontraktile funktion sammenlignet med skingruppen. Men fire dage efter genoverførslen af hjertetroponin IT 144D eller cTnIT144D vendte den kontraktile evne i PO-myocytterne tilbage mod falske niveauer, hvilket indikerer myocytfunktion kunne genoprettes.I de indledende undersøgelser forbedrede genoverførslen af cTnIT144D topforkortelsen og forhøjede diastoliske calciumniveauer sammenlignet med CTnI. Finjusteringer i placeringen af hjertemyocytten er ofte nødvendige for at opnå klare afkortningsspor. Denne protokol kan også udføres på hjertemyocytter fyldt med calciumfølsomme fluorescerende farvestoffer såsom Fura-2 AM for at detektere calciumtransienter ud over forkortelse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

Tidlig påvisning af Drug-induceret Renal Hæmodynamisk dysfunktion Brug Sonografisk Technology i rotter

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetri måler Mouse kontraktile Pressure<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

fremstilling og<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering af Magnetized miR-modificerede endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

En Flow flowcytometri-baserede analyse til måling af membran potentiale i hjerte Myocytes efter hypoxi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering af atrial Myocytes fra voksne mus

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Prøveudtagning og udvinding af hjernetumorer til metabolomics og lipidomics-analyse på stedet

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

In vitro vurdering af myokardie beskyttelse efter hypotermi-forkonditionering i en human hjerte myocytter model

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

Fertility Preservation in Patients with Severe Ovarian Dysfunction

Fertilitetsbevarelse hos patienter med svær dysfunktion i æggestokkene

Ovarian function progressively declines during aging and in some pathophysiological conditions including karyotype abnormality, autoimmune diseases, ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

En intakt perikardium iskæmisk gnavermodel

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Rodent Model of The Ross Operation: Syngeneic Pulmonary Artery Graft Implantation in A Systemic Position

En gnavermodel af Ross-operationen: Syngeneisk lungearterietransplantatimplantation i en systemisk position

The Ross operation for aortic valve disease has regained new interest due to its outstanding long-term results. Nonetheless, when employed as freestanding ...