Name: analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door national institutes of health (NIH) subsidie R01 HL144777 (MVW).

Studies uitgevoerd op knaagdieren volgden het public health service policy on humane care and use of laboratory animals en werden goedgekeurd door de University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Voor deze studie werden myocyten geïsoleerd uit 3-34 maanden oude Sprague-Dawley en F344BN ratten met een gewicht van ≥ 200 g5. Zowel mannelijke als vrouwelijke tarieven werden gebruikt.
1. Myocytenpacing voor contractiele functiestudies<...

<ol>
	<li>Reihle, C., Bauersachs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+of+heart+failure.">Small animal models of heart failure.</a> Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).</li><li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease.">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li><li>Rossman, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+frequency-dependent+responses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+in+human+myocardium.">Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).</li><li>McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+myofilament+contractile+function+in+human+donor+and+failing+hearts.">Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).</li><li>Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+contractile+dysfunction+and+protein+kinase+C-mediated+myofilament+phosphorylation+in+disease+and+aging.">Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging.</a> The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).</li><li>Chaudhary, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+myocardial+Ca2++cycling+after+left+ventricular+assist+device+support+in+failing+human+heart.">Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).</li><li>Walker, C. A., Spinale, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+the+cardiac+myocyte:+A+review+of+fundamental+concepts.">The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).</li><li>Lang, S. E., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cardiac+myocytes.">Gene transfer into cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+heart+performance+by+gene+transfer.">Designing heart performance by gene transfer.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).</li><li>Sweitzer, N. K., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+loaded+shortening+velocity+in+single+cardiac+myocytes+permeabilized+with+a-hemolysin.">Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin.</a> Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).</li><li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloaded+shortening+increases+peak+of+Ca2++transients+but+accelerates+their+decay+in+rat+single+cardiac+myocytes.">Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).</li><li>Racca, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+developing+human+fetal+cardiac+muscle.">Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle.</a> The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+expression+and+basal+lamina+remodeling+in+human+heart+failure.">Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure.</a> Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).</li><li>Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody+effects+on+cellular+function+of+isolated+cardiomyocytes.">Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).</li><li>Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+future+of+probenecid.">The history and future of probenecid.</a> Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).</li><li>Sakthivel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+analysis+of+cardiac+troponin+I+phosphorylation.">In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2+-ATPase+during+progression+of+left+ventricular+hypertrophy.">Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy.</a> The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).</li><li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+basis+of+Starling's+law+of+the+heart:+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume.">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li><li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart.">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li><li>Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shortening+and+[Ca2+]+dynamics+of+left+ventricular+myocytes+isolated+from+exercise-trained+rats.">Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).</li></ol>

Het chronische pacingprotocol dat in stap 1 wordt beschreven, verlengt de nuttige tijd voor het bestuderen van geïsoleerde myocyten en het beoordelen van de impact van langere behandelingen. In ons laboratorium werden consistente resultaten verkregen tot 4 dagen na isolatie bij het meten van de contractiele functie met behulp van sarcomeerlengte op chronisch getemporiseerde myocyten. De contractiele functie van myocyten verslechtert echter snel bij gebruik van media ouder dan 1 week om myocyten te versnellen.
<p cla...

De analyse van de hartpompfunctie vereist vaak een reeks benaderingen om voldoende inzicht te krijgen, vooral voor diermodellen van hartfalen (HF). Echocardiografie of hemodynamische metingen geven inzicht in in vivo cardiale disfunctie1, terwijl in vitro benaderingen vaak worden gebruikt om te identificeren of disfunctie ontstaat door veranderingen in het myofilament en/of de Ca2+ transiënt die verantwoordelijk is voor het koppelen van excitatie, of het actiepotentiaal, met contractiele functie (bijv. Excitatie-contractie [E-C] koppeling). In vitro benaderingen bieden ook de mogelijkheid om de functionele respons op neurohormonen, vector-geïnduceerde genetische veranderingen en potentiële therapeutische middelen2 te screenen voordat dure en / of moeizame in vivo behandelingsstrategieën worden nagestreefd.
Er zijn verschillende benaderingen beschikbaar om de in vitro contractiele functie te onderzoeken, waaronder krachtmetingen in intacte trabeculae3 of gepermeabiliseerde myocyten4, evenals onbelaste verkorting en Ca2+ transiënten in intacte myocyten in de aan- en afwezigheid van HF 5,6. Elk van deze benaderingen richt zich op de cardiale myocytencontractiele functie, die direct verantwoordelijk is voor de hartpompfunctie 2,7. De analyse van zowel contractie als E-C-koppeling samen wordt echter meestal uitgevoerd door verkorting van de spierlengte en Ca2+ transiënten in geïsoleerde, Ca2+ tolerante volwassen myocyten te meten. Het laboratorium maakt gebruik van een gedetailleerd gepubliceerd protocol om myocyten uit rattenharten te isoleren voor deze stap8.
Zowel de Ca2+ transiënten als myofilamenten dragen bij aan verkorting en herverlenging in intacte myocyten en kunnen bijdragen aan contractiele disfunctie 2,7. Deze aanpak wordt dus aanbevolen wanneer in vitro functionele analyse een intacte myocyt vereist die de Ca2+ fietsmachines plus de myofilamenten bevat. Intacte geïsoleerde myocyten zijn bijvoorbeeld wenselijk voor het bestuderen van de contractiele functie na het wijzigen van de myofilament- of Ca2+ fietsfunctie via genoverdracht9. Daarnaast wordt een intacte myocytenbenadering voorgesteld voor het analyseren van de functionele impact van neurohormonen bij het bestuderen van de impact van downstream tweede boodschapper signaleringsroutes en /of respons op therapeutische middelen2. Een alternatieve meting van belastingsafhankelijke kracht in enkele myocyten wordt meestal uitgevoerd na membraanpermeabilisatie (of skinning) bij lage temperaturen (≤15 °C) om de Ca2+ voorbijgaande bijdrage te verwijderen en zich te concentreren op myofilamentfunctie10. De meting van belastingsafhankelijke kracht plus Ca2+ transiënten in intacte myocyten is zeldzaam, grotendeels vanwege de complexe en technische uitdaging van de aanpak11, vooral wanneer een hogere doorvoer nodig is, zoals voor het meten van reacties op neurohormone signalering of als een scherm voor therapeutische middelen. De analyse van cardiale trabeculae overwint deze technische uitdagingen, maar kan ook worden beïnvloed door niet-myocyten, fibrose en / of extracellulaire matrixremodellering2. Elk van de hierboven beschreven benaderingen vereist een preparaat dat volwassen myocyten bevat, omdat neonatale myocyten en myocyten afgeleid van induceerbare pluripotente stamcellen (iPSC's) nog niet het volledige complement van volwassen myofilamenteiwitten tot expressie brengen en meestal het niveau van myofilamentorganisatie missen dat aanwezig is in de volwassen staafvormige myocyt2. Tot op heden wijst bewijs in iPSC's erop dat de volledige overgang naar volwassen isovormen meer dan 134 dagen in cultuur12 overschrijdt.
Gezien de focus van deze collectie op HF, omvatten de protocollen benaderingen en analyse om contractiele functie te onderscheiden in falende versus niet-falende intacte myocyten. Representatieve voorbeelden worden gegeven van rattenmyocyten die 18-20 weken na een supra-renale coarctatie zijn bestudeerd, eerder beschreven 5,13. Vervolgens worden vergelijkingen gemaakt met myocyten van met sham behandelde ratten.
Het hier beschreven protocol en beeldvormingsplatform worden gebruikt om veranderingen in verkorting en Ca2+ transiënten in staafvormige hartmyocyten tijdens de ontwikkeling van HF te analyseren en te monitoren. Voor deze analyse worden 2 x 104 Ca2+-tolerante, staafvormige myocyten verguld op 22 mm2 laminine-gecoate glazen coverslips (CSs) en 's nachts gekweekt, zoals eerder beschreven8. De componenten die voor dit beeldvormingsplatform zijn geassembleerd, samen met de media en buffers die worden gebruikt voor optimale beeldvorming, zijn opgenomen in de materiaaltabel. Een gids voor data-analyse met behulp van een software en de representatieve resultaten worden hier ook gegeven. Het algemene protocol is onderverdeeld in afzonderlijke subsecties, waarbij de eerste drie secties zich richten op geïsoleerde rattenmyocyten en gegevensanalyse, gevolgd door cellulaire Ca2 + voorbijgaande experimenten en gegevensanalyse in myocyten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEDIA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma (Roche)</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Final concentration = 0.2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-6529</td>
			<td>Final concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-7006</td>
			<td>Final concentration = 15 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-2520</td>
			<td>1 bottle makes 1 L; pH 7.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8875</td>
			<td>Final concentration = 4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>F1221</td>
			<td>50 &#956;g/vial;&#160; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;&#160; Final Fura2-AM concentration in media is&#160; 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenicid</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>P36400</td>
			<td>Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 22&#160; mm2 glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2845-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 36 inch cables with banana jacks</td>
			<td>Pomona Electronics</td>
			<td>B-36-2</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37oC Incubator&#160; with 95% O2:5% CO2&#160;</td>
			<td>Forma</td>
			<td>3110</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel E.&#160; Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp</td>
			<td>Forma</td>
			<td>1286</td>
			<td>Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 5/45</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1800-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low magnification inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM-IL&#160;</td>
			<td>Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; &#160;4X and 10X objectives recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing chamber</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ID in Supplemental Figure 2 &#38; Alternatives/Recommended Options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional components for Ca2+ imaging analysis</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Essential system components: -- Photon counting system&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Xenon power supply with dual excitation light source&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Fluorescence interface</td>
			<td>&#160;- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera&#160; (panel A #4).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm&#160; excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The fluorescence interface between the computer and&#160; light source is shown in panel B, #12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera with image acquisition&#160; hardware and software (240 frames/s)</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myocam with CCD controller&#160;</td>
			<td>Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4&#160; and&#160; panel A #5 &#38; panel C #5 (right), respectively.&#160; The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Chamber stimulator</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Panel B, #13; Alternative:&#160; Grass model S48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip mounted perfusion chamber</td>
			<td>Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws&#160; (arrow, panel F)</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #10 &#38; panel F;&#160;&#160; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).&#160; Commercial alternatives:&#160; Ionoptix FHD or C-stim cell&#160; chambers; Cell MicroControls culture stimulation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dedicated computer &#38; software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>PC with Ionwizard PC board and software</td>
			<td>Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric&#160; Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. 
			- A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.&#160; The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 TI</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Panel F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated tube holder for media</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam &#38; a pre-heated gel pack to keep media warm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted brightfield microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-2000S</td>
			<td>Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.&#160; &#160;A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolator Table</td>
			<td>TMC Vibration Control</td>
			<td>30 x 36 inches</td>
			<td>Panel A, #1; Desirable:&#160; elevated shelving, Faraday shielding&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope eyepieces &#38; objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective</td>
			<td>Panel A #3; 40X objective:&#160; n.a. 0.08; w.d. 2 mm.&#160; A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;NOTE:&#160; water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>Panel A #8 and panel E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small weigh boat</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Cell MicroControls</td>
			<td>TC2BIP</td>
			<td>Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.&#160;&#160;&#160; A preheater and objective heater are recommended for this platform.&#160; A Cell MicroControls HPRE2 preheater and&#160; HLS-1 objective heater are controlled&#160; by the TC2BIP temperature controller for our studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Under cabinet LED light with motion sensor&#160;</td>
			<td>Sylvania</td>
			<td>#72423 LED light</td>
			<td>Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..&#160; Alternative:&#160; A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask &#38; protective filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Tygon tubing - E363;&#160; polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90</td>
			<td>Panel A #11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes

Contractiele disfunctie en Ca2+ transiënten worden vaak geanalyseerd op cellulair niveau als onderdeel van een uitgebreide beoordeling van cardiale letsels en / of remodellering. Een benadering voor het beoordelen van deze functionele veranderingen maakt gebruik van onbelaste verkorting en Ca2 + voorbijgaande analyses in primaire volwassen cardiale myocyten. Voor deze aanpak worden volwassen myocyten geïsoleerd door collagenasevertering, Ca2 + tolerant gemaakt en vervolgens gehecht aan laminine-gecoate coverslips, gevolgd door elektrische pacing in serumvrije media. Het algemene protocol maakt gebruik van volwassen cardiale myocyten bij ratten, maar kan gemakkelijk worden aangepast voor primaire myocyten van andere soorten. Functionele veranderingen in myocyten van gewonde harten kunnen worden vergeleken met sham myocyten en/of met in vitro therapeutische behandelingen. De methodologie omvat de essentiële elementen die nodig zijn voor myocytenpacing, samen met de celkamer en platformcomponenten. Het gedetailleerde protocol voor deze aanpak omvat de stappen voor het meten van onbelaste verkorting door sarcomeerlengtedetectie en cellulaire Ca2 + transiënten gemeten met de ratiometrische indicator Fura-2 AM, evenals voor ruwe gegevensanalyse.

Contractiele functiestudies worden uitgevoerd op myocyten van ratten vanaf de dag na isolatie (dag 2) tot 4 dagen na isolatie. Hoewel myocyten de dag na isolatie (d.w.z. dag 2) kunnen worden geregistreerd, zijn vaak langere kweektijden nodig na genoverdracht of behandelingen om de contractiele functie te wijzigen8. Voor myocyten die langer dan 18 uur na isolatie zijn gekweekt, helpt het in sectie 1 beschreven pacingprotocol t-tubuli en consistente verkortings- en verlengingsresultaten te behouden....

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Er wordt een reeks protocollen gepresenteerd die de meting van de contractiele functie beschrijven via sarcomeerlengtedetectie samen met calcium (Ca2+) voorbijgaande meting in geïsoleerde rattenmyocyten. De toepassing van deze aanpak voor studies in diermodellen van hartfalen is ook inbegrepen.

Analyse van cardiale contractiele disfunctie en Ca2+ transiënten in knaagdiermyocyten

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Deze aanpak detecteert veranderingen in contractiele functie tijdens de ontwikkeling van hartfalen. De functionele respons in myocyten op neurohormonen en potentiële therapeutische middelen kan ook worden gescreend. Het positioneren van de myocyt kan oefening vergen, maar is essentieel voor het verkrijgen van consistente beeldvorming van de sarcomeerlengte.De procedure wordt gedemonstreerd door Margaret Westfall, universitair hoofddocent en hoofdonderzoeker van het laboratorium. Voordat u met het experiment begint, verwarmt u een gelpakket en media in een incubator gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius. Schakel de componenten van het contractiele functieplatform in zoals vermeld in het manuscript en monteer buizen in de peristaltische pomp.Breng vervolgens het voorverwarmde gelpakket over in de buishouder en schakel het vacuüm in de stroom naar de celstimulator in. Plaats een buis van 50 milliliter met media in de geïsoleerde buishouder om de perfusie met 0,5 milliliter per minuut door de peristaltische pompbuis te starten. Voeg vervolgens twee milliliter voorverwarmde media toe aan een kleine weegboot en breng een afdekslip met myocyten over van de stimulatiekamer naar de weegboot.Breng de stimulatiekamer terug naar de couveuse bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verwijder de afdekslip van de weegboot en veeg de onderkant voorzichtig af voordat u deze overbrengt naar een vers ingevette afdeksleuf en een druppel media op de afdekslip toevoegt. Plaats een platina elektrodebevestiging over de afdekslip, leg vervolgens een nieuwe afdekslip over de bovenkant met een tang en plaats een topbevestiging over de sandwich van de afdekslip.Installeer twee of vier nummer nul panhead-schroeven om de montage van de kamer te voltooien. In de peristaltische pomp wanneer de media aanwezig is in de hele buis, bevestigt u de slang aan de voorverwarmer en de voorverwarmer aan de afdekslipkamer. Begin vervolgens met de perfusie met 0,5 milliliter per minuut en plaats een doekje onder de kamer om ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn.Nadat u de afdekkamer in de podiumadapter van de microscoop hebt geplaatst, schakelt u het verwarmingssysteem in en brengt u de assemblage gedurende vijf tot 10 minuten in evenwicht om een constante mediatemperatuur van 37 graden Celsius in het midden van de kamer te bereiken. Observeer de doordrenkte media die aan het andere uiteinde van de kamer worden verzameld met buizen die zijn aangesloten op een vacuümsysteem. Visualiseer tijdens de equilibratietijd myocyten met het 40x waterdompelingsobjectief op de microscoop.Om de pacingstimulator te activeren, stelt u de spanning in op 35 tot 40 volt en past u de stimulatiefrequentie aan op 0,2 hertz om de contractiele functie en myocytenoverleving te optimaliseren. Om sarcomeerverkortingssporen te verzamelen, opent u de software op de computer en selecteert u OK, bestand en nieuwe tabbladen. Bereid een schermsjabloon voor door traceringen te selecteren, gebruikerslimieten en sarcomeerlengte te bewerken.Neem sporen van de sarcomeerlengte op met het bestand en nieuwe tabbladen, identificeer een samentrekkende myocyt en plaats de myocyt langs de lengteas van de camera, zodat het strepenpatroon verticaal is. Gebruik de computermuis om het interessante gebied of het vak ROI over de myocyt te plaatsen. Selecteer verzamelen en begin met het opnemen van de contractiele functie.Neem verkorting gedurende 60 seconden op van elke myocyt bij lage stimulatiefrequenties van 0,5 hertz. Registreer sarcomeer verkorting van vijf tot 10 cellen per cover slip. Om verkorting over een frequentiebereik te meten, plaatst u de myocyten op elke frequentie om steady state verkorting te verkrijgen voorafgaand aan de opname.Verdubbel de perfusiesnelheid en begin met het opnemen van 15 tot 20 seconden na stimulatie op een nieuwe frequentie in het bereik van 0,2 tot twee hertz en registreer niet meer dan twee myocyten per coverslip voor verkorting over het gegeven bereik van stimulatiefrequenties. Registreer ten minste zeven contracties per cel om betrouwbare signaalgemiddelde gegevens te verkrijgen. Selecteer het bestand, kies een opgenomen tracering en selecteer vervolgens openen.Selecteer tab een van de basistracering en stel vervolgens het gele paneel boven aan de trace in om de sarclengte te verkrijgen. Bereid een analysesjabloon voor met monotone transiënte analyseopties voor bewerkingen en TTL-gebeurtenismarkering in het vak T Nul in de benodigde opties in het menu. Sla deze analyseopties op door sjablonen te selecteren en sla de analysesjabloon op met een id.Laad de analysesjabloon voordat u elke tracering analyseert. Als u de gegevens wilt analyseren, selecteert u markeringen, gate, voegt u transiënt toe en converteert u vervolgens van gebeurtenismarkering en analysebereik. Stel het tijdsbereik in van min 0,01 tot 1,20 seconden voor myocyten met een tempo van 0,2 hertz.Selecteer een korter tijdsbereik voor myocyten gestimuleerd op hogere frequenties. Selecteer bewerkingen en gemiddelde gebeurtenissen om een signaalgemiddelde opname onder de oorspronkelijke basistracering te produceren. Selecteer vervolgens tab een van de signaalgemiddelde tracering en ga vervolgens naar markeringen in het bovenste menu, gevolgd door transiënt toevoegen, operaties en monotone transiënte analyse kiezen om de signaalgemiddelde waarden voor baseline-sarcomeerparameters weer te geven in het signaalgemiddelde weergavepaneel.Selecteer monotone transiënte analyse en klembordstroom exporteren en transiënte sarcomeeranalyse overbrengen naar een spreadsheet voor de samengestelde analyse van meerdere myocyten. Als u de signaalgemiddelde tracering wilt kopiëren, selecteert u export, huidige tracering en vervolgens klembord- en optietabbladen in volgorde en stelt u de decimalen in op vijf. Kies het scheidingsteken voor tabbladen en klik op OK.Breng de signaalgemiddelde sporen voor elke myocytopname in een tweede spreadsheet. De studie toonde aan dat de drukoverbelasting of PO de contractiele functie van de myocyten verminderde in vergelijking met de schijngroep. Vier dagen na de genoverdracht van cardiale troponine IT 144D of cTnIT144D keerde het contractiele vermogen in de PO-myocyten echter terug naar schijnniveaus, wat aangeeft dat de myocytenfunctie kon worden hersteld.In de eerste studies verbeterde de genoverdracht van cTnIT144D de piekverkorting en verhoogde diastolische calciumspiegels in vergelijking met CTnI. Fijne aanpassingen in de positionering van de cardiale myocyt zijn vaak nodig om duidelijke verkortingssporen te verkrijgen. Dit protocol kan ook worden uitgevoerd op cardiale myocyten geladen met calciumgevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals Fura-2 AM om calciumtransiënten te detecteren naast verkorting.

Research

JoVE Journal

Medicine

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

Vroege opsporing van drugs geïnduceerde renale hemodynamische Dysfunction Met behulp van echografische Technologie in Ratten

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intra-uteriene Telemetrie naar Mouse Contractiele druk te meten<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

voorbereiding en<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolatie van atriale Myocyten van volwassen muizen

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

On-Site bemonstering en extractie van hersentumoren voor metabolomics en lipidomics analyse

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

In vitro beoordeling van myocardbescherming na hypothermie-conditionering in een humaan cardiale myocytenmodel

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

Fertility Preservation in Patients with Severe Ovarian Dysfunction

Vruchtbaarheidsbehoud bij patiënten met ernstige ovariële disfunctie

Ovarian function progressively declines during aging and in some pathophysiological conditions including karyotype abnormality, autoimmune diseases, ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

Een intact pericardium ischemisch knaagdiermodel

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Rodent Model of The Ross Operation: Syngeneic Pulmonary Artery Graft Implantation in A Systemic Position

Een knaagdiermodel van de Ross-operatie: syngenetische longslagadertransplantatie in een systemische positie

The Ross operation for aortic valve disease has regained new interest due to its outstanding long-term results. Nonetheless, when employed as freestanding ...