Name: analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01 HL144777(MVW)によってサポートされています。

げっ歯類で行われた研究は、実験動物の人道的ケアと使用に関する公衆衛生サービスの方針に従い、ミシガン大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。この研究のために、筋細胞を、体重200g5≥3〜34ヶ月齢のSprague-DawleyおよびF344BNラットから単離した。男性と女性の両方の料金が使用されました。
1. 収縮機能研究のための筋細胞?...

<ol>
	<li>Reihle, C., Bauersachs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+of+heart+failure.">Small animal models of heart failure.</a> Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).</li><li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease.">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li><li>Rossman, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+frequency-dependent+responses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+in+human+myocardium.">Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).</li><li>McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+myofilament+contractile+function+in+human+donor+and+failing+hearts.">Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).</li><li>Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+contractile+dysfunction+and+protein+kinase+C-mediated+myofilament+phosphorylation+in+disease+and+aging.">Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging.</a> The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).</li><li>Chaudhary, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+myocardial+Ca2++cycling+after+left+ventricular+assist+device+support+in+failing+human+heart.">Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).</li><li>Walker, C. A., Spinale, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+the+cardiac+myocyte:+A+review+of+fundamental+concepts.">The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).</li><li>Lang, S. E., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cardiac+myocytes.">Gene transfer into cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+heart+performance+by+gene+transfer.">Designing heart performance by gene transfer.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).</li><li>Sweitzer, N. K., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+loaded+shortening+velocity+in+single+cardiac+myocytes+permeabilized+with+a-hemolysin.">Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin.</a> Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).</li><li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloaded+shortening+increases+peak+of+Ca2++transients+but+accelerates+their+decay+in+rat+single+cardiac+myocytes.">Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).</li><li>Racca, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+developing+human+fetal+cardiac+muscle.">Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle.</a> The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+expression+and+basal+lamina+remodeling+in+human+heart+failure.">Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure.</a> Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).</li><li>Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody+effects+on+cellular+function+of+isolated+cardiomyocytes.">Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).</li><li>Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+future+of+probenecid.">The history and future of probenecid.</a> Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).</li><li>Sakthivel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+analysis+of+cardiac+troponin+I+phosphorylation.">In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2+-ATPase+during+progression+of+left+ventricular+hypertrophy.">Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy.</a> The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).</li><li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+basis+of+Starling's+law+of+the+heart:+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume.">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li><li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart.">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li><li>Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shortening+and+[Ca2+]+dynamics+of+left+ventricular+myocytes+isolated+from+exercise-trained+rats.">Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).</li></ol>

ステップ1で概説した慢性ペーシングプロトコルは、単離された筋細胞を研究し、より長い治療の影響を評価するための有用な時間を延長します。私たちの研究室では、慢性ペースの筋細胞のサルコメア長を使用して収縮機能を測定すると、分離後4日まで一貫した結果が得られました。しかし、筋細胞の収縮機能は、筋細胞のペースを合わせるために1週間以上経過した培地を使用すると急速?...

心臓ポンプ機能の解析には、特に心不全(HF)の動物モデルについて、適切な洞察を得るためにさまざまなアプローチが必要になることがよくあります。心エコー検査または血行動態測定は、in vivo心機能障害1への洞察を提供しますが、in vitroアプローチは、機能障害が筋フィラメントおよび/または結合興奮に関与するCa2+過渡性の変化、または収縮機能(例えば、興奮収縮[E-C]結合)に起因するかどうかを特定するためにしばしば採用されます。in vitroアプローチはまた、費用のかかるおよび/または面倒なin vivo治療戦略を追求する前に、神経ホルモン、ベクター誘発性遺伝子変化、および潜在的な治療薬2に対する機能的応答をスクリーニングする機会を提供します。
インビトロ収縮機能を調査するために、無傷の小柱3または透過処理された筋細胞4での力測定、ならびにHF 5,6の存在下および非存在下での無傷の筋細胞における無負荷短縮およびCa2+過渡現象を含むいくつかのアプローチが利用可能です。これらのアプローチのそれぞれは、心臓ポンプ機能に直接関与する心筋細胞収縮機能に焦点を当てています2,7。しかしながら、収縮およびE−C結合の両方を一緒に分析することは、単離されたCa2+耐性成体筋細胞における筋肉長の短縮およびCa2+過渡性を測定することによって最も頻繁に行われる。実験室は、このステップ8のためにラット心臓から筋細胞を単離するために詳細に公開されたプロトコルを利用します。
Ca2+一過性および筋フィラメントの両方が、無傷の筋細胞の短縮および再延長に寄与し、収縮機能障害に寄与する可能性がある2,7。したがって、このアプローチは、in vitro機能解析で、Ca2+サイクリング機構と筋フィラメントを含む無傷の筋細胞が必要な場合に推奨されます。例えば、無傷の単離された筋細胞は、遺伝子導入9を介して筋フィラメントまたはCa2+サイクリング機能を改変した後の収縮機能を研究するために望ましい。さらに、下流のセカンドメッセンジャーシグナル伝達経路および/または治療薬への応答の影響を研究する際に、神経ホルモンの機能的影響を分析するために、無傷の筋細胞アプローチが提案されています2。単一筋細胞における負荷依存力の代替測定は、ほとんどの場合、低温(≤15°C)での膜透過処理(またはスキニング)後に行われ、Ca2+過渡寄与を除去し、筋フィラメント機能に焦点を当てます10。無傷の筋細胞における負荷依存力とCa2+過渡現象の測定は、特に神経ホルモンシグナル伝達に対する応答の測定や治療薬のスクリーニングなど、より高いスループットが必要な場合に、アプローチ11の複雑で技術的な課題のために主にまれです。心臓小柱の解析は、これらの技術的課題を克服しますが、非筋細胞、線維症、および/または細胞外マトリックスリモデリングの影響を受ける可能性があります2。新生児筋細胞および誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋細胞は、成体筋フィラメントタンパク質の完全な補体をまだ発現しておらず、通常、成体桿体状筋細胞に存在する筋フィラメント組織のレベルを欠いているため、上記の各アプローチは成体筋細胞を含む調製物を必要とする2。現在までに、iPS細胞における証拠は、成体アイソフォームへの完全な移行が培養で134日以上を超えることを示しています12。
このコレクションの焦点がHFであることを考えると、プロトコルには、障害のある無傷の筋細胞と失敗していない無傷の筋細胞における収縮機能を区別するためのアプローチと分析が含まれています。代表的な例は、腎上縮窄の18〜20週後に研究されたラット筋細胞から提供され、5、13に記載される。次に、偽処理ラットの筋細胞と比較します。
ここで説明するプロトコルとイメージングプラットフォームは、HFの発生中の桿体状心筋細胞における短縮およびCa2+過渡現象の変化を分析および監視するために使用されます。この解析では、前述のように、2 x 104 Ca2+耐性の棒状筋細胞を22 mm2ラミニンコーティングガラスカバースリップ(CS)に播種し、一晩培養します8。このイメージングプラットフォーム用に組み立てられたコンポーネントは、最適なイメージングに使用されるメディアとバッファーとともに、材料の表に記載されています。ソフトウェアを使用したデータ分析のガイドと代表的な結果もここに提供されています。全体的なプロトコルは別々のサブセクションに分割され、最初の3つのセクションでは単離されたラット筋細胞とデータ分析に焦点を当て、続いて細胞Ca2+一過性実験と筋細胞におけるデータ分析が続きます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEDIA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma (Roche)</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Final concentration = 0.2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-6529</td>
			<td>Final concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-7006</td>
			<td>Final concentration = 15 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-2520</td>
			<td>1 bottle makes 1 L; pH 7.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8875</td>
			<td>Final concentration = 4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>F1221</td>
			<td>50 &#956;g/vial;&#160; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;&#160; Final Fura2-AM concentration in media is&#160; 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenicid</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>P36400</td>
			<td>Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 22&#160; mm2 glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2845-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 36 inch cables with banana jacks</td>
			<td>Pomona Electronics</td>
			<td>B-36-2</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37oC Incubator&#160; with 95% O2:5% CO2&#160;</td>
			<td>Forma</td>
			<td>3110</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel E.&#160; Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp</td>
			<td>Forma</td>
			<td>1286</td>
			<td>Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 5/45</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1800-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low magnification inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM-IL&#160;</td>
			<td>Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; &#160;4X and 10X objectives recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing chamber</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ID in Supplemental Figure 2 &#38; Alternatives/Recommended Options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional components for Ca2+ imaging analysis</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Essential system components: -- Photon counting system&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Xenon power supply with dual excitation light source&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Fluorescence interface</td>
			<td>&#160;- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera&#160; (panel A #4).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm&#160; excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The fluorescence interface between the computer and&#160; light source is shown in panel B, #12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera with image acquisition&#160; hardware and software (240 frames/s)</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myocam with CCD controller&#160;</td>
			<td>Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4&#160; and&#160; panel A #5 &#38; panel C #5 (right), respectively.&#160; The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Chamber stimulator</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Panel B, #13; Alternative:&#160; Grass model S48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip mounted perfusion chamber</td>
			<td>Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws&#160; (arrow, panel F)</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #10 &#38; panel F;&#160;&#160; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).&#160; Commercial alternatives:&#160; Ionoptix FHD or C-stim cell&#160; chambers; Cell MicroControls culture stimulation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dedicated computer &#38; software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>PC with Ionwizard PC board and software</td>
			<td>Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric&#160; Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. 
			- A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.&#160; The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 TI</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Panel F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated tube holder for media</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam &#38; a pre-heated gel pack to keep media warm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted brightfield microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-2000S</td>
			<td>Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.&#160; &#160;A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolator Table</td>
			<td>TMC Vibration Control</td>
			<td>30 x 36 inches</td>
			<td>Panel A, #1; Desirable:&#160; elevated shelving, Faraday shielding&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope eyepieces &#38; objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective</td>
			<td>Panel A #3; 40X objective:&#160; n.a. 0.08; w.d. 2 mm.&#160; A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;NOTE:&#160; water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>Panel A #8 and panel E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small weigh boat</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Cell MicroControls</td>
			<td>TC2BIP</td>
			<td>Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.&#160;&#160;&#160; A preheater and objective heater are recommended for this platform.&#160; A Cell MicroControls HPRE2 preheater and&#160; HLS-1 objective heater are controlled&#160; by the TC2BIP temperature controller for our studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Under cabinet LED light with motion sensor&#160;</td>
			<td>Sylvania</td>
			<td>#72423 LED light</td>
			<td>Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..&#160; Alternative:&#160; A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask &#38; protective filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Tygon tubing - E363;&#160; polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90</td>
			<td>Panel A #11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes

収縮性機能障害およびCa2+ 過渡性は、心臓誘発性損傷および/またはリモデリングの包括的な評価の一環として、細胞レベルで分析されることがよくあります。これらの機能的変化を評価するための1つのアプローチは、初代成人心筋細胞におけるアンロード短縮およびCa2+ 過渡分析を利用する。このアプローチでは、成体筋細胞をコラゲナーゼ消化によって単離し、Ca2+ 耐性にしてから、ラミニンコーティングされたカバーガラスに接着し、続いて無血清培地で電気ペーシングを行います。一般的なプロトコルは、成体ラット心筋細胞を利用しますが、他の種からの初代筋細胞に対して容易に調整することができます。損傷した心臓からの筋細胞の機能的変化は、偽の筋細胞および/または in vitro 治療と比較することができます。この方法論には、筋細胞のペーシングに必要な重要な要素と、細胞室およびプラットフォームコンポーネントが含まれています。このアプローチの詳細なプロトコルには、サルコメア長検出による無負荷短縮の測定、およびレシオメトリックインジケータFura-2 AMで測定されたセルラーCa2+ 過渡現象の測定、および生データ分析の手順が組み込まれています。

収縮機能研究は、単離の翌日(2日目)から分離後4日までラット筋細胞に対して行われます。筋細胞は単離の翌日(すなわち、2日目)に記録することができるが、遺伝子導入または収縮機能を変更するための処理の後、より長い培養時間が必要になることが多い8。単離後18時間以上培養された筋細胞の場合、セクション1に記載されているペーシングプロトコルは、T尿細管を維持?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

単離されたラット筋細胞におけるカルシウム(Ca2+)過渡測定とともに、サルコメア長検出による収縮機能の測定を説明する一連のプロトコルが提示されています。心不全の動物モデルでの研究へのこのアプローチの適用も含まれています。

げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とCa2+ 一過性の解析

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

このアプローチは、心不全の発症中の収縮機能の変化を検出します。神経ホルモンおよび潜在的な治療薬に対する筋細胞における機能的応答もスクリーニングすることができる。筋細胞の位置決めには練習が必要ですが、一貫したサルコメア長イメージングを得るために不可欠です。手順を実演するのは、研究所の准教授兼主任研究者であるマーガレットウェストフォールです。実験を開始する前に、ゲルパックと培地をインキュベーター内で摂氏37度で30分間予熱します。原稿に記載されているように収縮機能プラットフォームコンポーネントの電源を入れ、チューブを蠕動ポンプに組み立てます。次に、予熱したゲルパックをチューブホルダーに移し、細胞刺激装置の電源を入れて真空にします。メディアの入った50ミリリットルのチューブを断熱チューブホルダーに入れて、蠕動ポンプチューブを通して毎分0.5ミリリットルで灌流を開始します。次に、2ミリリットルの予熱培地を小さな計量ボートに加え、筋細胞を含むカバースリップ1枚を刺激チャンバーから計量ボートに移します。刺激室を摂氏37度と5%二酸化炭素でインキュベーターに戻します。計量ボートからカバースリップを取り外し、下側をそっと拭いてから、グリースを塗りたてのカバースリップチャンバーに移し、カバースリップにメディアを一滴加えます。プラチナ電極マウントをカバースリップの上に置き、次に新しいカバースリップを鉗子で上部に置き、カバースリップサンドイッチの上にトップマウントを置きます。2つまたは4つのゼロなべネジを取り付けて、チャンバーの組み立てを完了します。蠕動ポンプで、チューブ全体に媒体が存在する場合は、チューブを予熱器に取り付け、予熱器をカバースリップチャンバーに取り付けます。次に、毎分0.5ミリリットルで灌流を開始し、漏れがないことを確認するためにチャンバーの下にティッシュワイプを置きます。カバースリップチャンバーを顕微鏡のステージアダプターに配置した後、加熱システムをオンにし、アセンブリを5〜10分間平衡化して、チャンバーの中央で摂氏37度の一定の媒体温度を達成します。真空システムに接続されたチューブを使用して、チャンバーの反対側の端に灌流された媒体が収集されるのを観察します。平衡化時間中に、40倍の水浸対物レンズで筋細胞を顕微鏡で可視化します。ペーシング刺激装置をアクティブにするには、電圧を35〜40ボルトに設定し、刺激周波数を0.2ヘルツに調整して、収縮機能と筋細胞の生存を最適化します。サルコメア短縮トレースを収集するには、コンピューターでソフトウェアを開き、[OK]、[ファイル]、および[新しい]タブを選択します。トレースを選択して画面テンプレートを準備し、ユーザー制限とサルコメアの長さを編集します。ファイルと新しいタブでサルコメアの長さのトレースを記録し、収縮筋細胞を特定し、筋細胞をカメラの縦軸に沿って配置して、線条パターンが垂直になるようにします。コンピューターのマウスを使用して、関心領域またはROIボックスを筋細胞の上に配置します。収集を選択して収縮機能の記録を開始します。0.5ヘルツの低刺激周波数で各筋細胞から60秒間の短縮を記録します。カバースリップごとに5セルから10セルに短縮するサルコメアを記録します。周波数範囲の短縮を測定するには、各周波数に筋細胞を配置して、記録前に定常状態の短縮を取得します。灌流速度を2倍にし、刺激後15〜20秒で0.2〜2ヘルツの範囲の新しい周波数で記録を開始し、所定の範囲の刺激周波数にわたって短縮するためにカバースリップごとに2つ以下の筋細胞を記録します。セルごとに少なくとも7つの収縮を記録して、信頼性の高い信号平均データを取得します。ファイルを選択し、記録されたトレースを選択して、[開く] を選択します。基本トレースのタブ 1 を選択し、トレースの上部にある黄色のパネルを設定して、sarc の長さを取得します。操作単調過渡解析オプションとTTLイベントマークを含む解析テンプレートを、メニューから必要なオプションの[T Zeroの定義]ボックスに用意します。テンプレートを選択してこれらの解析オプションを保存し、解析テンプレートを識別子とともに保存します。各トレースを分析する前に、分析テンプレートをロードします。データを解析するには、マークを選択し、ゲートし、過渡値を追加してから、イベントマークと解析範囲から変換します。0.2ヘルツでペースを合わせた筋細胞の時間範囲をマイナス0.01秒から1.20秒に設定します。より高い周波数で刺激された筋細胞については、より短い時間範囲を選択します。操作と平均イベントを選択して、元のベーストレースの下に平均化された信号記録を生成します。次に、信号平均トレースのタブ1を選択し、上部メニューのマークに移動してから過渡を追加し、操作と単調過渡解析を選択して、ベースラインサルコメアパラメータの信号平均値を信号平均表示パネルに表示します。単調過渡解析とクリップボード電流をエクスポートし、複数の筋細胞の複合解析のために非定常サルコメア解析をスプレッドシートに転送します。信号平均トレースをコピーするには、エクスポート、現在のトレース、クリップボード、オプションの順に選択し、小数点以下の桁数を5に設定します。タブ区切り文字を選択し、[OK]をクリックします。各筋細胞のシグナル平均トレースを2番目のスプレッドシートに記録します。この研究は、圧力過負荷またはPOが、偽群と比較して筋細胞の収縮機能を低下させることを示した。しかし、心筋トロポニンIT144DまたはcTnIT144Dの遺伝子導入から4日後、PO筋細胞の収縮能力は偽レベルに戻り、筋細胞の機能が回復する可能性があることを示しました。初期の研究では、cTnIT144Dの遺伝子導入は、CTnIと比較してピーク短縮と拡張期カルシウムレベルの上昇を促進しました。心筋細胞の位置の微調整は、明確な短縮痕跡を得るためにしばしば必要とされる。このプロトコルは、Fura-2 AMなどのカルシウム感受性蛍光色素を負荷した心筋細胞に対して実行して、短縮に加えてカルシウム過渡現象を検出することもできます。

Research

JoVE Journal

Medicine

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

ラットにおける超音波検査技術を用いた薬剤誘発性腎血行動態機能障害の早期発見

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

マウス収縮圧力を測定するために子宮内テレメトリ<em&gt;インビボ</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフロー フローサイトメトリーを用いたアッセイ

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

成体マウスからの心房筋細胞の単離

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

メタボロミクス解析とリピドミクス解析のための脳腫瘍の現場でのサンプリングと抽出

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

ヒト心臓筋細胞モデルにおける低体温症前処理に対する心筋保護のインビトロ評価

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

Fertility Preservation in Patients with Severe Ovarian Dysfunction

重度卵巣機能障害患者における不妊治療の保存

Ovarian function progressively declines during aging and in some pathophysiological conditions including karyotype abnormality, autoimmune diseases, ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

無傷心膜虚血性げっ歯類モデル

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Rodent Model of The Ross Operation: Syngeneic Pulmonary Artery Graft Implantation in A Systemic Position

ロス手術のげっ歯類モデル:全身位置における同系肺動脈移植移植

The Ross operation for aortic valve disease has regained new interest due to its outstanding long-term results. Nonetheless, when employed as freestanding ...