Name: measuring caenorhabditis elegans sensitivity to the acetylcholine receptor agonist levamisole
Uploaded: 2022-06-07T14:00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole at JoVE.com

Vi takker Riya Dattani og Lauren Hogstrom, der indsamlede dataene i figur 2B, C blind for genotype i BISC413 Advanced Genetics Laboratory (forår 2022) ved University of Delaware. Yderligere oplysninger om BISC413 kursusbaseret bachelorforskningserfaring (CURE) samt adgang til laboratoriemanualen designet af J. Tanis er tilgængelig efter anmodning. Nematodestammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som understøttes af NIH-ORIP (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af en P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (til J.E.T.).

1. Forberedelse af plader til levamisolassayet
<ol><li>Forbered nematodevækstmedium (NGM) medier ved at kombinere 3 g NaCl, 2,5 g pepton og 17 g agar med 1 liter deioniseret (DI) vand i en kolbe med en omrøringsstang.</li>
	<li>Efter autoklavering anbringes mediet på en kogeplade indstillet til 70 °C og omrøres ved moderat hastighed i 1 time.</li>
	<li>Tilsæt 1 ml 5 mg / ml kolesterol dråbevis for at forhindre udfældning, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 og 25 ml 1 M pH 6,0 kaliumphosphatbuffer til mediet.</li>
	<li>Overfør 2 ml NGM-medier til hver brønd i en 24-brøndplade med en steril serologisk pipette (figur 1).</li>
	<li>Lad pladerne tørre på bordpladen i 2 dage før såning med bakterier. Ved langtidsopbevaring anbringes de ved 4 °C.</li>
	<li>Strib OP50 E. coli ud på en lysogen bouillon (LB) plade og voks natten over ved 37 °C.</li>
	<li>Vælg en enkelt OP50-koloni i B-bouillon (10 g trypton og 5 g NaCl i 1 liter DI H2O), og indstil kulturrystelsen ved 37 ° C natten over.</li>
	<li>Ved hjælp af en steril pipette skal du slippe 30 μL OP50-suspensionen på agaren i midten af hver brønd (figur 1). BEMÆRK: Sørg for ikke at beskadige agaroverfladen, da dette vil føre til ormgravning.</li>
	<li>Lad pladerne sidde ved stuetemperatur i mindst 2 dage efter såning for at tillade dannelse af en bakteriel græsplæne. BEMÆRK: Hvis bakterierne i midterbrøndene ikke er tørre efter 2 dage, skal pladerne stå åbne i emhætten i 20 minutter (figur 1). Pladerne skal hældes og podes med bakterier 1-2 uger før analysen.</li>
</ol>2. Synkronisering af C. elegans (dag 1)
<ol><li>Dyrk vildtype, unc-63 (x26), lev-10 (x17) og unc-49 (e407) C. elegans til voksenalderen på 6 cm plader, og forbered mindst otte plader pr. Stamme. Bekræft, at der er mange ikke-sultne gravide voksne på pladerne. BEMÆRK: Dette er dobbelt så mange plader som nødvendigt; Det er dog vigtigt at have backupplader, hvis det første parti æg ødelægges under blegning.</li>
	<li>Der fremstilles 10x M9-buffer ved at opløse 59,6 g Na2HPO4 (dibasisk), 29,9 g KH2PO4 (monobasisk), 12,8 g NaCl og 2,5 g MgSO4 i 750 ml DI-vand under omrøring. Når det er opløst, bringes volumenet op til 1 L og filtreres steriliseres. Fortynd 1:10 og autoklave for at gøre 1x M9 buffer. BEMÆRK: 1x M9-bufferen kan laves uger eller måneder i forvejen.</li>
	<li>Forbered blegeopløsning under emhætten på synkroniseringsdagen. Bland 10 ml blegemiddel (materialebord), 2,5 ml 10 N NaOH og 37,5 ml DI-vand i et 50 ml konisk rør. Brug beskyttelsesbriller, handsker og en kittel, når du arbejder med blegeopløsningen.</li>
	<li>Brug et plastoverførselsrør til at vaske gravide voksne orme fra mindst fire plader med 1x M9 buffer og overfør dem til et 15 ml konisk rør.</li>
	<li>Drej ved 716 x g i 1 minut ved stuetemperatur, og fjern derefter supernatanten ved hjælp af et overførselsrør.</li>
	<li>Der tilsættes 10 ml blegeopløsning. Vend eller ryst forsigtigt røret i ~4 minutter, indtil de fleste, men ikke alle, ormekroppe er opløst (figur 1). BEMÆRK: Pas på ikke at overblege ormene, da dette vil ødelægge æggene. Visse mutationer kan øge vanskeligheden ved ægisolering.</li>
	<li>Drej ved 716 x g i 1 min.</li>
	<li>Hæld blegemiddelopløsningen af i en bevægelse; så længe røret ikke rystes på dette tidspunkt, klæber æggene til siden af røret.</li>
	<li>Tilsæt 15 ml 1x M9 buffer og inverter. Drej ved 716 x g i 1 minut, og hæld M9-bufferen af i en jævn bevægelse.</li>
	<li>Udfør i alt tre vaske med 1x M9 buffer, som beskrevet i trin 2.9.</li>
	<li>Efter den sidste vask tilsættes 10 ml frisk 1x M9 og anbringes på en rotator natten over ved 15 °C for at isolere en synkroniseret population af udsultede dyr i første larvestadie (L1). BEMÆRK: Før du sætter rotatoren på, skal du kontrollere, at der er æg i M9-bufferen. Hvis ikke, gentag forberedelsen med backupplader og blegemiddel i kortere tid.</li>
</ol>3. Plettering synkroniseret C. elegans (dag 2)
<ol><li>Udskriv et 24-brønds pladekort, og tildel stammer til randomiserede steder. Hver stamme skal være repræsenteret i 24-brøndpladen mindst seks gange.</li>
	<li>Ca. 24 timer efter blegemiddelforberedelsen spindes udklækkede L1-orme ned i M9-buffer ved 716 x g i 1 minut ved stuetemperatur.</li>
	<li>Fjern ~ 9 ml M9-buffer med et plastoverførselsrør, og bland derefter forsigtigt de udsultede orme i første larvestadium (L1'er) i den resterende M9-buffer.</li>
	<li>Rør straks 3 μL af ormene i M9-bufferen på et mikroskopglas og bestem antallet af L1'er; det ønskede tal er 20-30 L1s i 3 μL. Spin ned og fjern M9, hvis ormkoncentrationen er for lav, og tilsæt M9, hvis koncentrationen er for høj. BEMÆRK: Kontroller antallet af orme pr. 3 μL mindst 2x, og vend røret hver gang.</li>
	<li>Pipet 3 μL L1s (20-30 orme i alt) i hver brønd i henhold til det præfabrikerede pladekort (trin 3.1; Figur 1). BEMÆRK: Vend røret med L1'erne i M9 ofte for at opretholde en jævn fordeling af orme, da de vil slå sig ned til bunden. Hvis dette ikke gøres, vil nogle brønde have for få orme, mens andre vil have for mange. Gennembor heller ikke agaren med pipettespidsen, da dette vil få dyrene til at grave sig.</li>
	<li>Lad ormene vokse til voksenalderen i 3 dage ved 20 °C. BEMÆRK: Brugen af forskellige væksttemperaturer og visse mutationer kan påvirke modningshastigheden, så sørg for at overveje C. elegans livscyklus.</li>
</ol>4. Udførelse af levamisolassayet (dag 5)
<ol><li>Udskriv et tomt datablad, som vil blive brugt til at registrere antallet af orme, der bevæger sig i hver brønd hvert 5. minut i 1 time. BEMÆRK: Eleverne vil kunne tælle ormene i højst 12 brønde hvert 5. minut. De 12 bedste brønde analyseres i den første time, mens de nederste 12 brønde analyseres i den efterfølgende time.</li>
	<li>Kontroller ormene i pladerne med 24 brønde. Brug en markør til at lave et "X" på pladelåget over eventuelle brønde, der har forurening, har sultet eller har for mange orme (>40), hvilket vil gøre tælling vanskelig.</li>
	<li>Der fremstilles 0,4 mM levamisolopløsning ved tilsætning af 200 μL 100 mM levamisolbestand til 50 ml 1x M9. 100 mM levamisolbestand forberedes ved at opløse 240,76 mg levamisolhydrochlorid i 10 mlH2Oog opbevares ved -20 °C. BEMÆRK: Levamisol skal fortyndes i M9; fortynding iH2Ofremskynder lammelse. Studerende skal bære handsker. Indtagelse af høje koncentrationer af levamisol er giftig.</li>
	<li>Start en timer, og tilsæt derefter 1 ml 0,4 ml levamisol til de to første brønde ved hjælp af et overførselsrør, således at dyrene svømmer frit. Fortsæt med at tilføje levamisol til de tilstødende brønde, forskyde tiden i henhold til antallet af brønde, der skal analyseres. BEMÆRK: Hvis der f.eks. analyseres 10 brønde, tilsættes levamisol på følgende måde: brønde 1 og 2 ved tid 0, brønde 3 og 4 efter 1 min, brønde 5 og 6 efter 2 min, brønde 7 og 8 efter 3 min og brønde 9 og 10 efter 4 min.</li>
	<li>Efter 5 minutter skal du begynde manuelt kun at tælle antallet af bevægelige orme i hver brønd, begyndende med den første brønd, og registrere dette nummer på databladet (figur 1). Tællere kan bruges, men er ikke forpligtet til nøjagtigt at bestemme antallet af bevægelige orme. BEMÆRK: Studerende skal holde øje med timeren, da de nogle gange kommer bagud i de tidlige tidspunkter, før mange orme lammes. Antallet af tidspunkter kan justeres, eller færre brønde kan analyseres på hvert tidspunkt, hvis det er nødvendigt.</li>
	<li>Fortsæt med at tælle antallet af bevægelige orme i hver brønd hvert 5. minut i 1 time. BEMÆRK: Nedsænkning i M9 inducerer konstant svømmebevægelse i løbet af dette 1 timers assay, hvilket eliminerer behovet for ormens prodding for at vurdere lammelse (figur 2A). Eksponering for 0,4 mM levamisolopløsning inducerer tidsafhængig lammelse som observeret ved ophør af svømning; orme, der lammer, kommer sig ikke.</li>
	<li>Gentag trin 4.4.-4.6. for resten af brøndene i pladen.</li>
	<li>I slutningen af analysen, eller når tiden tillader det, skal du registrere det samlede antal orme i hver brønd.</li>
</ol>5. Analyse af data
<ol><li>Ophent pladekortet (trin 3.1), og registrer, hvilken stamme der svarer til hver brønd. BEMÆRK: På grund af mængden af indsamlede data vil den efterfølgende analyse og diskussion af dataene tage mindst et par timer.</li>
	<li>Indtast dataene i et regneark, der starter med det samlede antal orme i hver brønd og organiserer efter genotype.</li>
	<li>Ved at kombinere data fra brøndene skal du bestemme antallet af orme, der bevæger sig på hvert tidspunkt for hver stamme.</li>
	<li>Brug disse data til at oprette en "overlevelseskurve" i den statistiske software (Table of Materials) for visuelt at vise befolkningens tidsafhængige lammelse (figur 2B).</li>
	<li>Opret en datatabel, så venstre kolonne angiver klokkeslæt, og efterfølgende kolonner indeholder dataene for hver stamme. For hvert dyr, der er lammet inden for de første 5 minutter, skal du oprette en række og indtaste en "1" i 5 min. Gentag dette for hvert tidspunkt. For alle dyr, der ikke lammer ved afslutningen af analysen, skal du indtaste et "0" i 60 min.</li>
	<li>Udfør parvise sammenligninger ved hjælp af log-rank (Mantel-Cox) testen i den statistiske software (Table of Materials) for at afgøre, om der er en statistisk signifikant forskel mellem to forskellige stammer.</li>
	<li>Til yderligere/alternativ analyse i stedet for at udføre trin 5.3. og trin 5.4, bestemmes procentdelen af dyr, der bevæger sig i hver brønd på hvert tidspunkt. Afbild gennemsnittet med standardfejl på hvert tidspunkt for alle stammer, der er analyseret ved hjælp af et regnearksprogram eller den statistiske software (figur 2C).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+myasthenic+syndromes:+Pathogenesis,+diagnosis,+and+treatment.">Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment.</a> The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).</li><li>Mahjneh, I., Lochm&#252;ller, H., Muntoni, F., Abicht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOK7+limb-girdle+myasthenic+syndrome+mimicking+congenital+muscular+dystrophy.">DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).</li><li>Rodr&#237;guez Cruz, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+myopathies+with+secondary+neuromuscular+transmission+defects;+A+case+report+and+review+of+the+literature.">Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).</li><li>Montagnese, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+patients+with+GMPPB+mutation:+The+overlapping+phenotypes+of+limb-girdle+myasthenic+syndrome+and+limb-girdle+muscular+dystrophy+dystroglycanopathy.">Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy.</a> Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).</li><li>Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+structure,+and+maintenance+of+C.+elegans+body+wall+muscle.">Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle.</a> WormBook. , 1-59 (2017).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction.">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).</li><li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li><li>Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmembrane+protein+required+for+acetylcholine+receptor+clustering+in+Caenorhabditis+elegans.">A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).</li><li>Eimer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nicotinic+receptor+trafficking+by+the+transmembrane+Golgi+protein+UNC-50.">Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50.</a> The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).</li><li>Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+complement-control-related+protein+ensures+acetylcholine+receptor+clustering.">A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering.</a> Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).</li><li>Chaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+genome-wide+RNAi+screen+for+altered+levamisole+sensitivity+identifies+genes+required+for+muscle+function.">A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047 (2021).</li><li>Vashlishan, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNAi+screen+identifies+genes+that+regulate+GABA+synapses.">An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses.</a> Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).</li><li>Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FER-1/Dysferlin+promotes+cholinergic+signaling+at+the+neuromuscular+junction+in+C.+elegans+and+mice.">FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice.</a> Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).</li><li>Gottschalk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+nicotinic+receptor-associated+proteins+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).</li><li>Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+postsynaptic+transmembrane+protein+affecting+neuromuscular+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).</li><li>Treinin, M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+transmission+in+C.+elegans:+Functions,+diversity,+and+maturation+of+ACh-activated+ion+channels.">Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels.</a> Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).</li><li>Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+immunoglobulin-domain+protein+required+for+clustering+acetylcholine+receptors+in+C.+elegans.">A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans.</a> The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).</li><li>Kim, S., Sieburth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor+tyrosine+kinase+network+regulates+neuromuscular+function+in+response+to+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).</li><li>Oh, K., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldicarb-induced+paralysis+assay+to+determine+defects+in+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans.">Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-Protocol. 7 (14), 2400 (2017).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikt.

Ændret respons på levamisol kan identificere gener, der kræves til postsynaptisk kolinerg signalering og muskelfunktion. Protokollen beskriver her et flydende levamisolassay, der bruges til at kvantificere tidsafhængig lammelse over en 1 times tidsperiode. Studerende forudsiger virkningerne af visse genetiske mutationer, udfører et eksperiment med stor prøvestørrelse og kvantificerer derefter deres resultater. Dette assay er en enkel, effektiv måde at kvantificere levamisolinduceret lammelse uden at plukke eller stikke dyr, hvilket gør den velegnet til bachelorlaboratorier samt forskere, der studerer neuromuskulær transmission. Diskuteret her er nogle af de mest almindelige faldgruber, begrænsningerne i analysen og en variation til protokollen, der muliggør dens anvendelse med RNAi knockdown-dyr; også diskuteret her er, hvordan dette assay kan indlejres i en kursusbaseret bachelorforskningserfaring.
Korrekt forberedelse af pladerne med 24 brønde er afgørende. For det første skal bakterieplæner være helt tørre, før de spotter L1-dyr i brøndene. Hvis de ikke tørres nok, blandes bakterierne med levamisolopløsningen under analysen, hvilket gør væsken uklar og forhindrer enkeltpersoner i at kunne tælle ormene. For det andet, når de synkroniserer orme gennem blegemiddelforberedelse, må dyrene ikke udsættes for blegemiddelopløsningen for længe, da dette vil få den beskyttende belægning på æggene til at gå i opløsning. For det tredje er det afgørende kun at få øje på 20-30 L1'er pr. Brønd, da for mange orme i brøndene gør det ekstremt vanskeligt at tælle antallet, der bevæger sig nøjagtigt inden for den tildelte tid. Endelig er det vigtigt at opretholde en aseptisk teknik under fremstillingen af pladerne, da forurenede brønde ikke kan analyseres. 
Der er et par begrænsninger, der skal overvejes, når du udfører dette assay. For det første kan det være overvældende at tælle antallet af bevægelige orme i hver brønd hvert 5. minut for personer, der mangler forudgående laboratorieerfaring, og dette kan føre til upræcis dataindsamling. Hvad angår andre assays, der bruges til at bestemme lægemiddelfølsomhed18,19, kan dette eksperiment udføres med færre tidspunkter. For det andet er plettering af sultne L1'er isoleret fra en blegemiddelforberedelse en nem metode til at opnå en synkroniseret population; Der skal dog foretages justeringer, hvis udviklingstidspunktet varierer mellem de stammer, der analyseres. Det er muligt at plukke sene fjerde larvestadiedyr (L4'er) i en 24-brøndplade til dette assay; Men når man forbereder mange plader, er dette for arbejdskrævende. Alternativt bør man bestemme, hvor lang tid det tager for hver stamme at nå L4 og derefter placere L1'erne i brøndene på forskellige tidspunkter for at justere for forskelle i modningshastighed. Endelig, mens dette assay kan bruges til at identificere nye gener, der er vigtige for postsynaptisk muskelfunktion11, kan ændret levamisolrespons også være forårsaget af mutation eller RNAi knockdown af præsynaptiske gener12. Hvis der observeres ændret levamisolfølsomhed, skal der udføres yderligere forsøg for at bestemme årsagen til denne fænotype.
Ved at foretage et par ændringer af pladerne med 24 brønde kan den beskrevne levamisol svømmeassay også udføres på RNAi knockdown dyr11. Gen knockdown gennem RNAi kan opnås ved at fodre C. elegans bakterier, der udtrykker dobbeltstrenget RNA svarende til genet af interesse20. Til fremstilling af RNAi-plader skal der tilsættes 1 ml 1 ml IPTG og 1 ml 25 mg/ml carbenicillin pr. liter medie efter fjernelse fra autoklaven. Bakteriekulturer dyrkes ved at plukke en enkelt koloni i 3 ml LB bouillon plus 3 μL 25 mg/mlcarbenicillin og ryste ved 37 °C natten over, og pladekortet laves, når de forskellige bakterier ses i brøndene. C. elegans synkroniseres ved blegemiddelforberedelse som beskrevet; dog bør den RNAi overfølsomme eri-1 (mg366) stamme anvendes i stedet for vildtypen for at øge gen knockdown. RNAi knockdowns resulterer i de samme levamisolfænotyper observeret for funktionstab mutanter11. 
Protokollen, der præsenteres her, kan bruges i laboratorieforskning, som et selvstændigt eksperiment i bachelorlaboratoriet eller i de første uger af et avanceret bachelorkursus som en introduktion til grundlæggende C. elegans teknikker og neuromuskulær funktion. I et mere avanceret opdagelsesbaseret kursus kan eleverne bruge dette assay til at afgøre, om tabet af C. elegans homologer af gener muteret hos personer med myastheniske syndromer, muskeldystrofier eller myopatier ændrer levamisolfølsomhed. Afslutningsvis giver dette enkle, billige levamisolfølsomhedsassay en praktisk tilgang til at lære om signalering ved NMJ og få erfaring med at arbejde med C. elegans-modelsystemet .

Aktivering af postsynaptiske acetylcholinreceptorer (AChR'er) på skeletmuskulatur resulterer i et elektrisk signal, der fører til muskelkontraktion. Forstyrrelse af neuromuskulær funktion resulterer i myastheniske syndromer og muskeldystrofier hos mennesker 1,2,3,4. Nematoden Caenorhabditis elegans er blevet brugt i vid udstrækning til at lære om evolutionært bevarede grundlæggende biologiske processer og sygdomsmekanismer. Hvirveldyr skeletmuskler og C. elegans kropsvægsmuskler er funktionelt ækvivalente i kontrollen af bevægelse5. Her præsenteres et simpelt assay, der kan bruges til at sammenligne vildtype C. elegans med mutanter, der har ændret neuromuskulær signalering eller muskelfunktion.
Excitatoriske og hæmmende input modtaget fra henholdsvis kolinerge og GABAerge motorneuroner får musklerne på den ene side af C. elegans krop til at trække sig sammen, mens musklerne på den anden side slapper af, hvilket muliggør koordineret bevægelse6. Levamisol, et anthelmintisk middel, der anvendes til behandling af parasitære nematodeinfektioner, binder sig til og aktiverer konstitutivt en klasse af AChR'er på kropsvægsmusklerne, hvilket resulterer i tidsafhængig lammelse7. Således kan ændret følsomhed over for levamisol anvendes til at identificere C. eleganer med defekter i balancen mellem excitatorisk og hæmmende signalering 7,8,9,10,11,12,13,14,15. For eksempel påvirker mutationer i underenheder af den levamisolfølsomme AChR (L-AChR), såsom UNC-63, såvel som C. elegans homolog af Cubilin, LEV-10, som er nødvendig for L-AChR-klyngedannelse ved synapsen, excitatorisk signalering og resulterer i levamisolresistens 7,8. Mutationer i GABAA-receptoren UNC-49 reducerer hæmmende signalering og forårsager overfølsomhed over for levamisol12.
Overfølsomhed eller resistens over for levamisol er traditionelt blevet vurderet ved at overføre dyr til agarplader indeholdende levamisol og derefter regelmæssigt stikke ormene for at bestemme det tidspunkt, hvor lammelse forekommer 13,14,15. Vi har udviklet et flydende levamisol svømmeassay, der eliminerer behovet for fysisk manipulation af dyrene og giver mulighed for screening af hundredvis af dyr på bare 1 time. Her beskrives brugen af dette assay med vildtype, unc-63(x26), lev-10(x17) og unc-49(e407) dyr. Denne protokol kan dog også udføres på C. eleganer udsat for RNAi, som det blev gjort for at validere knockdowns identificeret i en genom-dækkende RNAi-skærm for ændret levamisolfølsomhed11.
Til dette farmakologiske assay blev orme dyrket til voksenalderen i 24-brøndplader, 0,4 mM levamisol i M9-buffer blev tilsat til hver brønd, og antallet af bevægelige dyr blev registreret hvert 5. minut i 1 time. Levamisolinduceret lammelse blev visuelt observeret over tid, og efter afslutningen af analysen blev data kvantificeret. Evalueringen af mutanter sammen med vildtype C. elegans giver eleverne mulighed for først at forudsige potentielle fænotypiske effekter og derefter udføre eksperimenter for at teste deres hypoteser. Afslutningsvis er dette enkle, billige, flydende levamisolassay en ideel måde at demonstrere virkningen af tabet af specifikke gener på NMJ-funktionen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes</td>
			<td>TriTech Research</td>
			<td>Cat #: T3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Bacto Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0140-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#:12-556-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>Cat#: 02101382-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eri-1(mg366)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>GR1373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Bacto Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0123-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Statistical software)</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lev-10(x17)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>ZZ17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Splash Regular Bleach - 121oz - up &#38; up</td>
			<td>Target</td>
			<td>Search target.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 wild type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>Bristol N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide 10N</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unc-49(e407)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>CB407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unc-63(x26)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>ZZ26 </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring caenorhabditis elegans sensitivity to the acetylcholine receptor agonist levamisole

Ved det neuromuskulære kryds (NMJ) fører bindingen af den excitatoriske neurotransmitter acetylcholin (ACh) til postsynaptiske receptorer til muskelkontraktion. Som i hvirveldyr skeletmuskulatur er kolinerge signalering i kropsvægsmusklerne i modelorganismen Caenorhabditis elegans nødvendig for bevægelse. Eksponering for levamisol, en farmakologisk agonist af en klasse af ACh-receptorer på kroppens vægmuskler, forårsager tidsafhængig lammelse af vildtypedyr. Ændret følsomhed over for levamisol antyder defekter i signalering ved NMJ eller muskelfunktion. Her præsenteres en protokol for et flydende levamisolassay udført på C. elegans dyrket i 24-brøndplader. Kraftig svømning af dyrene i væske giver mulighed for vurdering og kvantificering af levamisolinduceret lammelse i hundredvis af orme over en times tidsperiode uden at kræve fysisk manipulation. Denne procedure kan anvendes med både vildtype og mutanter, der har ændret følsomhed over for levamisol for at demonstrere de funktionelle konsekvenser af ændret signalering ved NMJ.

Signalering gennem AChR'er og GABA-receptorer gør det muligt for muskler på den ene side af C. elegans krop at trække sig sammen, mens musklerne på den anden side slapper af, hvilket muliggør koordineret bevægelse 6,16. Levamisolbinding til ionotrope L-AChR'er forårsager sammentrækning, hvilket fører til tidsafhængig lammelse af vildtypedyr. Her vurderede vi følsomheden af vildtype, unc-63 L-AChR mutant, lev-10 L-AChR clustering mutant og unc-49 GABAA receptor mutant C. elegans til levamisol. Mutationer i underenheder af L-AChR såvel som i gener, der kræves til handel med L-AChR'er til muskelplasmamembranen, klyngedannelse af postsynaptiske L-AChR'er og nedstrøms Ca2+ signalering, forårsager resistens over for levamisolinduceret lammelse 7,8,9,10,11,16,17, som observeret i unc-63 og lev-10 mutanter (figur 2B ,C). Tab af den GABA-gatede ionkanal UNC-49 forårsagede levamisoloverfølsomhed (figur 2B, C) på grund af forstyrrelse af den korrekte balance mellem kolinerge og GABAerge signalering12. Da dette assay for nylig blev udført af studerende i et avanceret genetiklaboratorium, observerede 100% af eleverne levamisolresistens med unc-63 og lev-10 mutanter, mens 88% observerede levamisoloverfølsomhed med unc-49 mutanten. Disse data indsamlet med det flydende levamisol svømmeassay er i overensstemmelse med fænotyper observeret i traditionelle pladebaserede levamisolassaysays 7,8,11,12,13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64056/64056fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk af levamisolassayforberedelse og implementering. 24-brønd NGM-plader hældes; 2 dage senere sås OP50 Escherichia coli i brøndene. C. eleganer synkroniseres gennem blegemiddelforberedelse og første larvetrin (L1) dyr for hver stamme, der skal analyseres (vildtype, sort; unc-63(x26), magenta; lev-10(x17), grøn; unc-49(e407), blå) pipetteres i brøndene i henhold til et forudbestemt pladekort den følgende dag. Efter 3 dages vækst ved 20 ºC, eller når dyrene når voksenalderen, tilføjes 0,4 mM levamisol i M9 buffer til hver brønd, og antallet af bevægelige dyr tælles hvert 5. minut i 1 time. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64056/64056fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64056/64056fig02.jpg"> Figur 2: Levamisol-induceret lammelse i vildtype og repræsentativ mutant C. elegans. (A) Eksponering for 0,4 mM levamisol forårsager tidsafhængig lammelse; dette observeres ikke for dyr, der svømmer i 1x M9 buffer i 1 time. (B) Tidsafhængig lammelse af vildtype (sort), unc-63 (x26) (magenta), lev-10 (x17) (grøn) og unc-49 (e407) (blå) dyr i levamisol svømmeassayet. Tab af L-AChR-underenheden UNC-63 eller L-AChR-klyngeprotein LEV-10 resulterede i levamisolresistens, og tab af GABAA-receptoren UNC-49 forårsagede levamisoloverfølsomhed. n ≥ 50 pr. genotype, p < 0,0001 for alle mutanter sammenlignet med vildtypen i dette repræsentative eksperiment. C) Ved hjælp af de samme data som i panel B) blev procentdelen af dyr i bevægelse på hvert tidspunkt (gennemsnit af procentdelene for hvert brønd ± SE) bestemt for hver stamme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64056/64056fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole at JoVE.com

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Den nuværende protokol beskriver et assay for at bestemme respons på levamisol, en farmakologisk agonist af en klasse af Caenorhabditis elegans acetylcholinreceptorer. I dette flydende levamisolsvømmeassay observerer og kvantificerer forskere visuelt den tidsafhængige lammelse af dyr dyrket i 24-brøndplader.

Måling af Caenorhabditis elegans Følsomhed over for acetylcholin receptoragonist levamisol

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Denne protokol giver forskere mulighed for at observere, hvordan C-elgans reagerer på acetylcholin receptoragonist Levamisole. Ændret levamisolfølsomhed kan tyde på defekter i signalering ved deres neuromuskulære kryds eller muskelfunktion. En stor fordel er, at den kraftige svømning af C-elgans i Levamisole-løsningen giver forskere mulighed for at kvantitative den tidsafhængige lammelse af hundredvis af orme på bare en time.At tælle antallet af orme i hver brønd hvert femte minut kan være overvældende. Antal brønde analyseret, eller tidspunkter kan justeres, hvis det er nødvendigt. For at begynde at forberede nematodevækstmedier ved at kombinere tre gram natriumchlorid, 2,5 gram peptone og 17 gram agar med en liter deioniseret vand i en kolbe med en rørestang.Efter autoklavering sættes mediet på en kogeplade indstillet til 70 grader Celsius og omrøres med moderat hastighed i en time. Tilsæt en milliliter på fem milligram per milliliter kolesterol dråbevis for at forhindre nedbør. En milliliter af et molært calciumchlorid, en milliliter et molært magnesiumsulfat og 25 ml af en molær pH 6,0 kaliumphosphatbuffer til mediet.Overfør to milliliter nematodevækstmedier i hver brønd på en 24 brøndplade med en steril serologisk pipette. Lad pladerne tørre på bordpladen i to dage, før de sidder med bakterier. Vælg en enkelt op 50 koloni i B bouillon og sæt kulturen rystende på 37 grader Celsius natten over.Brug en steril pipette til at droppe 30 mikroliter OP50 suspension på agar midt i hver brønd. Lad pladerne sidde ved stuetemperatur i mindst to dage efter siddepladser for at tillade dannelse af en bakterieplæne. Dyrk vildtype unc-63 Lev10 og unc-49 C-elgan til voksenalderen på seks centimeter plader, og tilbered mindst otte plader pr. Stamme.Forbered blegeopløsning under emhætten på synkroniseringsdagen. Bland 10 ml blegemiddel, 2,5 ml natriumhydroxid og 37,5 ml deioniseret vand i et 50 milliliter krønikerør. Ved hjælp af en plastoverførselspipette vaskes gravide voksne orme fra mindst fire plader med M9-buffer og overføres dem til et 15 milliliter krønikerør.Drej den 716 G i et minut ved stuetemperatur, og fjern derefter supernatanten ved hjælp af en overførselspipette. Tilsæt 10 ml blegeopløsning. Ryst forsigtigt røret i fire minutter, indtil de fleste, men ikke alle ormkroppe er opløst.Drej ved 716 G i et minut. Hæld blegemiddelopløsningen af i en bevægelse. Så længe røret ikke rystes på dette tidspunkt, klæber æggene til siden af røret ved 15 ml M9-buffer og inverterer.Drej ved 716 G i et minut og hæld M9-bufferen af i en jævn bevægelse. Gentag denne vask med bufferopløsning tre gange. Efter den sidste vask tilsættes 10 ml frisk M9 og placeres på en rotator natten over ved 15 grader Celsius for at isolere en synkroniseret population af udsultede dyr på første larvestadium.Udskriv til 24 brøndplader og tildel stammer til randomiserede steder. Ca. 24 timer efter blegemiddelforberedelsen skal du dreje ned udsultede L1-orme ved 716 G i et minut ved stuetemperatur. Fjern cirka ni milliliter M9-buffer med en plastoverførselspipette, og bland derefter forsigtigt de udsultede første larvestadieorme i den resterende M9-buffer.Pipetter straks tre mikroliter orme og M9 buffer på et mikroskop dias og bestem antallet af L1'er. Det ønskede tal er 20 til 30 L1'er i tre mikroliter. Pipetter tre mikroliter L1'er i hver brønd i henhold til det præfabrikerede pladekort, lad ormene vokse til voksenalderen i tre dage ved 20 grader Celsius.Udskriv det tomme datablad, som vil blive brugt til at registrere antallet af orme, der bevæger sig i hver brønd hvert femte minut i en time. Tjek ormene i de 24 brøndplader. Brug en markør til at lave et X på pladelåget over eventuelle brønde, der har forurening, har sultet eller har for mange orme, hvilket vil gøre det vanskeligt at tælle.Lav 0,4 millimolar Levamisolopløsning ved at tilsætte 200 mikroliter 100 millimolar levamisolbestand til 50 ml M9. Start en timer, og tilsæt derefter en milliliter 0,4 millimolar levamisol til de to første brønde, således at dyrene svømmer frit. Fortsæt med at tilføje Levamisol til de tilstødende brønde, og forskyde tiden i henhold til antallet af brønde, der skal analyseres. Efter fem minutter skal du begynde manuelt kun at tælle antallet af bevægelige orme i hver brønd, begyndende med den første brønd, og registrere dette nummer på databladet.Fortsæt med at tælle antallet af bevægelige orme i hver brønd hvert femte minut i en time. Ved afslutningen af analysen, eller når tiden tillader det, skal du registrere det samlede antal orme i hver brønd. Få fat i pladen, kortlæg og registrer, hvilken stamme der svarer til hver brønd.Indtast dataene i et regneark, der starter med det samlede antal orme i hver brønd og organiserer efter genotype. Ved at kombinere data fra brøndene skal du bestemme antallet af orme, der bevæger sig på hvert tidspunkt. Brug dette til at beregne det tal, der lammer på hvert tidspunkt.Lav en datatabel, så venstre kolonne angiver tid, og efterfølgende kolonner indeholder dataene for hver stamme. For hvert dyr, der er lammet inden for de første fem minutter, skal du oprette en række og indtaste en i fem minutter. Gentag dette for hvert tidspunkt.For alle dyr, der ikke lammer ved afslutningen af analysen, skal du indtaste et nul i 60 minutter. Brug disse data til at skabe en overlevelseskurve i den specifikke statistiske software, der bruges her til visuelt at vise den tidsafhængige lammelse af befolkningen. Data for alle stammer, der analyseres, skal indtastes i den samme datatabel, så der er plads efter behov.Mutationer i underenheder af Levamisol acetylcholinreceptoren såvel som i gener, der kræves til klyngedannelse af postsynaptiske Levalisolinfølsomme acetylcholinreceptorer, forårsager resistens over for Levamisolinduceret lammelse som observeret i henholdsvis unc-63 og Lev-10 mutanter. Tab af den GABA-gatede ionkanal unc-49 forårsagede Levamisol overfølsomhed på grund af forstyrrelse af den korrekte balance mellem kolinerg og GABAergic signalering. Korrekt forberedelse af 24 brøndplader er afgørende.Hvis bakterielle græsplæner ikke er tørre, før de får øje på L1'er, kan Levamisolopløsningen blive overskyet under analysen, hvilket hæmmer observationen. Ved at ændre de 24 brøndplader kan denne protokol udføres med RNAi slået ned dyr. Dette giver forskere mulighed for at studere C-elgans gener, for hvilke mutanter ikke er tilgængelige.

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transkriptom Analyse af<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA sekventering data via Tuxedo Suite på Galaxy-projektet

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Den nematodeprøveudtagning Caenorhabditis Elegans - en alsidig In Vivo Model til at studere Host-mikrobe interaktioner

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

En metode til at studere C924T polymorfi af tromboxan A2 Receptor genet

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation af Ploidi i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Den replika sæt metode: En høj overførselshastighed tilgang til kvantitativt foranstaltning Caenorhabditis elegans levetid

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay

Måling af mikrobielle Mutations rater med udsvings analysen

Fluctuation assays are widely used for estimating mutation rates in microbes growing in liquid environments. Many cultures are each inoculated with a few ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Kultur og assay af storstilet blandet stadie Caenorhabditis elegans Populationer

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Undersøgelse af billige metoder til måling af levetid og sundhed i Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Måling af embryonal levedygtighed og yngelstørrelse i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Analyse af transgenerationel epigenetisk arv i C. elegans ved hjælp af en fluorescerende reporter og kromatinimmunudfældning (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...