Name: measuring caenorhabditis elegans sensitivity to the acetylcholine receptor agonist levamisole
Uploaded: 2022-06-07T14:00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole at JoVE.com

Ringraziamo Riya Dattani e Lauren Hogstrom, che hanno raccolto i dati in Figura 2B,C ciechi al genotipo nel BISC413 Advanced Genetics Laboratory (Spring 2022) presso l'Università del Delaware. Ulteriori informazioni sull'esperienza di ricerca universitaria basata sul corso BISC413 (CURE), nonché l'accesso al manuale di laboratorio progettato da J. Tanis, sono disponibili su richiesta. I ceppi di nematodi sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center, che è supportato dal NIH-ORIP (P40 OD010440). Questo lavoro è stato supportato da un P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (a J.E.T.).

1. Preparazione delle piastre per il saggio del levamisolo
<ol><li>Preparare il terreno di coltura dei nematodi (NGM) combinando 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone e 17 g di agar con 1 L di acqua deionizzata (DI) in un matraccio con un mescolatore.</li>
	<li>Dopo l'autoclave, mettere il fluido su una piastra calda impostata a 70 °C e agitare a velocità moderata per 1 ora.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di 5 mg/mL di colesterolo goccia per evitare precipitazioni, 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di 1 M MgSO4 e 25 mL di tampone fosfato di potassio pH 6,0 M al media.</li>
	<li>Trasferire 2 mL di fluido NGM in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con una pipetta sierologica sterile (Figura 1).</li>
	<li>Lasciare asciugare i piatti sul piano di lavoro per 2 giorni prima di seminare con i batteri. Per una conservazione a lungo termine, porli a 4 °C.</li>
	<li>Strisciare OP50 E. coli su una piastra di brodo lisogeno (LB) e crescere durante la notte a 37 ° C.</li>
	<li>Prelevare una singola colonia di OP50 in brodo B (10 g di triptone e 5 g di NaCl in 1 L di DI H2O) e impostare l'agitazione della coltura a 37 °C durante la notte.</li>
	<li>Utilizzando un pipettuccio sterile, far cadere 30 μL di sospensione OP50 sull'agar al centro di ciascun pozzetto (Figura 1). NOTA: Assicurarsi di non danneggiare la superficie dell'agar in quanto ciò causerebbe lo scavo del verme.</li>
	<li>Lasciare riposare le piastre a temperatura ambiente per almeno 2 giorni dopo la semina per consentire la formazione di un prato batterico. NOTA: Se i batteri nei pozzetti centrali non sono asciutti dopo 2 giorni, lasciare le piastre aperte nel cappuccio per 20 minuti (Figura 1). Le piastre devono essere versate e seminate con batteri 1-2 settimane prima del test.</li>
</ol>2. Sincronizzazione di C. elegans (giorno 1)
<ol><li>Crescere C. elegans wild-type, unc-63(x26), lev-10(x17) e unc-49(e407) fino all'età adulta su piatti di 6 cm, preparando almeno otto piastre per ceppo. Conferma che ci sono molti adulti gravidi non affamati sui piatti. NOTA: Questo è il doppio delle piastre necessarie; Tuttavia, è importante disporre di piastre di backup nel caso in cui il primo lotto di uova venga distrutto durante lo sbiancamento.</li>
	<li>Fare 10x tampone M9 sciogliendo 59,6 g di Na 2 HPO 4 (bibasico), 29,9 g di KH 2 PO 4 (monobasico), 12,8 g di NaCl e2,5g diMgSO4 in 750 mL di acqua DI agitando. Una volta sciolto, portare il volume fino a 1 L e sterilizzare il filtro. Diluire 1:10 e autoclave per ottenere 1x tampone M9. NOTA: il buffer M9 1x può essere effettuato con settimane o mesi di anticipo.</li>
	<li>Preparare la soluzione sbiancante sotto il cofano il giorno della sincronizzazione. Mescolare 10 ml di candeggina (tabella dei materiali), 2,5 ml di NaOH 10 N e 37,5 ml di acqua DI in un tubo conico da 50 mL. Indossare occhiali, guanti e un camice da laboratorio ogni volta che si lavora con la soluzione sbiancante.</li>
	<li>Utilizzando un pipetta di trasferimento in plastica, lavare i vermi adulti gravidi da almeno quattro piastre con 1x tampone M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml.</li>
	<li>Centrifugare a 716 x g per 1 minuto a temperatura ambiente, quindi rimuovere il surnatante utilizzando un pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Aggiungere 10 ml della soluzione sbiancante. Capovolgere o agitare delicatamente il tubo per ~4 minuti fino a quando la maggior parte, ma non tutte, delle carcasse di vermi si sono dissolte (Figura 1). NOTA: Fare attenzione a non sbiancare eccessivamente i vermi in quanto ciò distruggerà le uova. Alcune mutazioni possono aumentare la difficoltà di isolamento delle uova.</li>
	<li>Girare a 716 x g per 1 min.</li>
	<li>Versare la soluzione di candeggina in un solo movimento; Finché il tubo non viene scosso a questo punto, le uova si attaccheranno al lato del tubo.</li>
	<li>Aggiungere 15 mL di 1x buffer M9 e invertire. Ruotare a 716 x g per 1 minuto e versare il buffer M9 con un movimento regolare.</li>
	<li>Eseguire tre lavaggi in totale con 1x tampone M9, come descritto nel passaggio 2.9.</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, aggiungere 10 ml di 1x M9 fresco e posizionare su un rotatore per una notte a 15 °C per isolare una popolazione sincronizzata di animali affamati di primo stadio larvale (L1). NOTA: prima di posizionare il rotatore, verificare che ci siano uova nel tampone M9. In caso contrario, ripetere la preparazione con piastre di backup e candeggina per un tempo più breve.</li>
</ol>3. Placcatura sincronizzata C. elegans (giorno 2)
<ol><li>Stampa una mappa delle lastre a 24 pozzetti e assegna ceppi a luoghi casuali. Ogni ceppo dovrebbe essere rappresentato nella piastra a 24 pozzetti almeno sei volte.</li>
	<li>Circa 24 ore dopo la preparazione della candeggina, spin down i vermi L1 affamati di schiusa nel tampone M9 a 716 x g per 1 minuto a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere ~ 9 ml di tampone M9 con un pipet di trasferimento di plastica, quindi mescolare delicatamente i vermi del primo stadio larvale affamati (L1) nel restante tampone M9.</li>
	<li>Pipettare immediatamente 3 μL dei vermi nel tampone M9 su un vetrino da microscopio e determinare il numero di L1; il numero desiderato è 20-30 L1s in 3 μL. Ruotare verso il basso e rimuovere M9 se la concentrazione del verme è troppo bassa e aggiungere M9 se la concentrazione è troppo alta. NOTA: Controllare il numero di vite senza fine per 3 μL almeno 2x, invertendo ogni volta il tubo.</li>
	<li>Pipet 3 μL di L1s (20-30 vermi totali) in ciascun pozzetto secondo la mappa delle piastre prefabbricata (passo 3.1; Figura 1). NOTA: Capovolgere frequentemente il tubo con gli L1 in M9 per mantenere una distribuzione uniforme dei vermi mentre si depositano sul fondo. Se ciò non viene fatto, alcuni pozzi avranno troppo pochi vermi, mentre altri ne avranno troppi. Inoltre, non forare l'agar con la punta del pipet in quanto ciò causerebbe la tana degli animali.</li>
	<li>Lasciare crescere i vermi fino all'età adulta per 3 giorni a 20 °C. NOTA: L'uso di diverse temperature di crescita e alcune mutazioni possono influire sulla velocità di maturazione, quindi assicurati di considerare il ciclo di vita di C. elegans.</li>
</ol>4. Esecuzione del saggio del levamisolo (giorno 5)
<ol><li>Stampare un foglio dati vuoto, che verrà utilizzato per registrare il numero di vermi che si muovono in ogni pozzetto ogni 5 minuti per 1 ora. NOTA: Gli studenti saranno in grado di contare i vermi in un massimo di 12 pozzi ogni 5 minuti. I primi 12 pozzi vengono analizzati nella prima ora, mentre i 12 pozzi inferiori vengono analizzati nell'ora successiva.</li>
	<li>Controllare i vermi nelle piastre a 24 pozzetti. Usando un pennarello, fai una "X" sul coperchio della piastra su tutti i pozzetti che hanno contaminazione, sono affamati o hanno troppi vermi (>40), il che renderà difficile il conteggio.</li>
	<li>Produrre una soluzione di levamisolo 0,4 mM aggiungendo 200 μL di 100 mM di stock di levamisolo a 50 mL di 1x M9. Preparare 100 mM di lecamsolo stock sciogliendo 240,76 mg di levamisolo cloridrato in 10 mL di H2O e conservarlo a -20 °C. NOTA: Il levamisolo deve essere diluito in M9; la diluizione in H2O accelera la paralisi. Gli studenti devono indossare guanti. L'ingestione di alte concentrazioni di levamisolo è tossica.</li>
	<li>Avviare un timer e quindi, utilizzando un pipett di trasferimento, aggiungere 1 mL di levamisolo 0,4 mM ai primi due pozzetti, in modo che gli animali nuotino liberamente. Continuare ad aggiungere levamisolo ai pozzi adiacenti, scaglionando il tempo in base al numero di pozzi da dosare. NOTA: Ad esempio, se vengono analizzati 10 pozzi, il levamisolo verrà aggiunto nel modo seguente: pozzi 1 e 2 al tempo 0, pozzi 3 e 4 dopo 1 minuto, pozzi 5 e 6 dopo 2 minuti, pozzi 7 e 8 dopo 3 minuti e pozzi 9 e 10 dopo 4 minuti.</li>
	<li>Al minuto 5, iniziare a contare manualmente solo il numero di vermi in movimento in ciascun pozzetto, iniziando dal primo pozzo, e registrare tale numero nel foglio dati (Figura 1). I contatori possono essere utilizzati, ma non sono necessari per determinare con precisione il numero di worm in movimento. NOTA: Gli studenti devono tenere d'occhio il timer poiché a volte rimangono indietro durante i primi punti temporali prima che molti vermi si paralizzino. Il numero di punti temporali può essere regolato o, se necessario, è possibile dosare meno pozzi in ogni punto temporale.</li>
	<li>Continuare a contare il numero di vermi in movimento in ciascun pozzetto ogni 5 minuti per 1 ora. NOTA: L'immersione in M9 induce un movimento costante del nuoto nel corso di questo test di 1 ora, che elimina la necessità di pungolare i vermi per valutare la paralisi (Figura 2A). L'esposizione alla soluzione di levamisolo 0,4 mM induce una paralisi dipendente dal tempo, come osservato dalla cessazione del nuoto; I vermi che paralizzano non si riprendono.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.4.-4.6. per il resto dei pozzi nel piatto.</li>
	<li>Alla fine del test, o quando il tempo lo consente, registrare il numero totale di vermi in ciascun pozzetto.</li>
</ol>5. Analisi dei dati
<ol><li>Ottenere la mappa delle piastre (passo 3.1.) e registrare quale ceppo corrisponde a ciascun pozzetto. NOTA: a causa della quantità di dati raccolti, la successiva analisi e discussione dei dati richiederà almeno un paio d'ore.</li>
	<li>Inserisci i dati in un foglio di calcolo, iniziando con il numero totale di worm in ciascun pozzetto e organizzandoli per genotipo.</li>
	<li>Combinando i dati provenienti dai pozzi, determinare il numero di vermi che si muovono in ogni punto temporale per ogni ceppo.</li>
	<li>Utilizzare questi dati per creare una "curva di sopravvivenza" nel software statistico (Table of Materials) per visualizzare visivamente la paralisi dipendente dal tempo della popolazione (Figura 2B).</li>
	<li>Creare una tabella dati in modo tale che la colonna di sinistra indichi l'ora e le colonne successive contengano i dati per ogni ceppo. Per ogni animale che è paralizzato entro i primi 5 minuti, crea una riga e inserisci un "1" per 5 minuti. Ripeti questa operazione per ogni punto temporale. Per tutti gli animali che non si paralizzano entro la fine del test, inserire uno "0" per 60 minuti.</li>
	<li>Eseguire confronti a coppie utilizzando il test log-rank (Mantel-Cox) nel software statistico (Table of Materials) per determinare se esiste una differenza statisticamente significativa tra due ceppi diversi.</li>
	<li>Per l'analisi aggiuntiva/alternativa, invece di eseguire il passaggio 5.3. e passo 5.4., determinare la percentuale di animali che si muovono in ciascun pozzetto in ogni punto temporale. Tracciare la media con errore standard in ogni punto temporale per tutti i ceppi analizzati utilizzando un programma di fogli di calcolo o il software statistico (Figura 2C).</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

La risposta alterata al levamisolo può identificare i geni necessari per la segnalazione colinergica postsinaptica e la funzione muscolare. Il protocollo qui descrive un saggio di levamisolo liquido utilizzato per quantificare la paralisi dipendente dal tempo per un periodo di tempo di 1 ora. Gli studenti fanno previsioni sugli effetti di alcune mutazioni genetiche, conducono un esperimento con campioni di grandi dimensioni e quindi quantificano i loro risultati. Questo test è un modo semplice ed efficace per quantificare la paralisi indotta dal levamisolo senza raccogliere o pungolare gli animali, rendendolo adatto ai laboratori universitari e ai ricercatori che studiano la trasmissione neuromuscolare. Qui vengono discusse alcune delle insidie più comuni, i limiti del test e una variazione al protocollo che ne consente l'uso con animali knockdown RNAi; Qui viene anche discusso come questo test può essere incorporato in un'esperienza di ricerca universitaria basata sul corso.
La corretta preparazione delle piastre a 24 pozzetti è essenziale. In primo luogo, i prati batterici devono essere completamente asciutti prima di individuare gli animali L1 nei pozzi. Se non abbastanza essiccato, i batteri si mescolano con la soluzione di levamisolo durante il test, rendendo il liquido torbido e impedendo agli individui di essere in grado di contare i vermi. In secondo luogo, quando si sincronizzano i vermi attraverso la preparazione della candeggina, gli animali non devono essere esposti alla soluzione di candeggina per troppo tempo in quanto ciò causerebbe la disintegrazione del rivestimento protettivo sulle uova. In terzo luogo, è fondamentale individuare solo 20-30 L1 per pozzo, poiché troppi vermi nei pozzi rendono estremamente difficile contare con precisione il numero che si muove nel tempo assegnato. Infine, è importante mantenere una tecnica asettica durante la preparazione delle piastre poiché i pozzi contaminati non possono essere analizzati. 
Ci sono alcune limitazioni che devono essere considerate quando si esegue questo test. In primo luogo, contare il numero di worm in movimento in ogni pozzetto ogni 5 minuti può essere travolgente per le persone che non hanno precedenti esperienze di laboratorio, e questo potrebbe portare a una raccolta di dati imprecisa. Come per altri saggi utilizzati per determinare la sensibilità al farmaco18,19, questo esperimento può essere eseguito con meno punti temporali. In secondo luogo, la placcatura di L1 affamate isolate da una preparazione di candeggina è un metodo semplice per ottenere una popolazione sincronizzata; Tuttavia, è necessario apportare modifiche se i tempi di sviluppo differiscono tra i ceppi analizzati. È possibile prelevare animali del quarto stadio larvale (L4) in una piastra a 24 pozzetti per questo test; Tuttavia, quando si preparano molti piatti, questo è troppo laborioso. In alternativa, si dovrebbe determinare il tempo necessario affinché ogni ceppo raggiunga L4 e quindi posizionare gli L1 nei pozzetti in momenti diversi per regolare le differenze nella velocità di maturazione. Infine, mentre questo test può essere utilizzato per identificare nuovi geni importanti per la funzione muscolare postsinaptica11, l'alterata risposta del levamisolo può anche essere causata da mutazione o knockdown RNAi dei geni presinaptici12. Se si osserva un'alterata sensibilità al levamisolo, devono essere eseguiti ulteriori esperimenti per determinare la ragione di questo fenotipo.
Apportando alcune modifiche alle piastre a 24 pozzetti, il saggio di nuoto del levamisolo descritto può essere eseguito anche su animali abbattuti dall'RNAi11. Il knockdown genico attraverso RNAi può essere ottenuto alimentando i batteri C. elegans che esprimono RNA a doppio filamento corrispondente al gene di interesse20. Per la preparazione di piastre di RNAi, devono essere aggiunti 1 mL di IPTG 1M e 1 mL di carbenicillina da 25 mg/ml per litro di terreno dopo la rimozione dall'autoclave. Le colture batteriche vengono coltivate raccogliendo una singola colonia in 3 ml di brodo LB più 3 μL di 25 mg / mLcarbenicillina e agitando a 37 ° C durante la notte, e la mappa della piastra viene fatta quando i diversi batteri vengono individuati nei pozzetti. C. elegans sono sincronizzati dalla preparazione della candeggina come descritto; tuttavia, il ceppo eri-1 (mg366) ipersensibile all'RNAi dovrebbe essere usato al posto del wild type per aumentare il knockdown genico. I knockdown di RNAi producono gli stessi fenotipi di levamisolo osservati per i mutanti con perdita di funzione11. 
Il protocollo qui presentato può essere utilizzato nella ricerca di laboratorio, come esperimento autonomo nel laboratorio universitario o nelle prime settimane di un corso di laurea avanzato come introduzione alle tecniche di base di C. elegans e alla funzione neuromuscolare. In un corso più avanzato basato sulla scoperta, gli studenti possono utilizzare questo test per determinare se la perdita di omologhi di C. elegans di geni mutati in individui con sindromi miasteniche, distrofie muscolari o miopatie altera la sensibilità del levamisolo. In conclusione, questo semplice ed economico test di sensibilità al levamisolo fornisce un approccio pratico per apprendere la segnalazione presso l'NMJ e acquisire esperienza lavorando con il sistema modello di C. elegans.

L'attivazione dei recettori postsinaptici dell'acetilcolina (AChR) sul muscolo scheletrico provoca un segnale elettrico che porta alla contrazione muscolare. L'interruzione della funzione neuromuscolare provoca sindromi miasteniche e distrofie muscolari nell'uomo 1,2,3,4. Il nematode Caenorhabditis elegans è stato ampiamente utilizzato per conoscere i processi biologici fondamentali evolutivamente conservati e i meccanismi della malattia. I muscoli scheletrici dei vertebrati e i muscoli della parete corporea di C. elegans sono funzionalmente equivalenti nel controllo della locomozione5. Qui viene presentato un semplice saggio che può essere utilizzato per confrontare C. elegans wild-type con mutanti che hanno alterato la segnalazione neuromuscolare o la funzione muscolare.
Gli input eccitatori e inibitori ricevuti rispettivamente dai motoneuroni colinergici e GABAergici causano la contrazione dei muscoli su un lato del corpo di C. elegans mentre i muscoli sull'altro lato si rilassano, consentendo la locomozione coordinata6. Il levamisolo, un agente antielmintico usato per trattare le infezioni da nematodi parassiti, si lega e attiva costitutivamente una classe di AChR sui muscoli della parete corporea, con conseguente paralisi dipendente dal tempo7. Pertanto, l'alterata sensibilità al levamisolo può essere utilizzata per identificare C. elegans con difetti nell'equilibrio della segnalazione eccitatoria e inibitoria 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Ad esempio, mutazioni in subunità dell'AChR (L-AChR) sensibile al levamisolo, come UNC-63, così come l'omologo di C. elegans di Cubilin, LEV-10, che è richiesto per il raggruppamento di L-AChR nella sinapsi, influenzano la segnalazione eccitatoria e provocano resistenza al levamisolo 7,8. Le mutazioni nel recettore GABAA UNC-49 riducono la segnalazione inibitoria e causano ipersensibilità al levamisolo12.
L'ipersensibilità o la resistenza al levamisolo è stata tradizionalmente valutata trasferendo gli animali in piastre di agar contenenti levamisolo e quindi pungolando regolarmente i vermi per determinare il punto temporale in cui si verifica la paralisi13,14,15. Abbiamo sviluppato un test di nuoto in levamisolo liquido che elimina la necessità di manipolazione fisica degli animali e consente lo screening di centinaia di animali in solo 1 ora. Qui viene descritto l'uso di questo test con animali wild-type, unc-63 (x26), lev-10 (x17) e unc-49 (e407). Tuttavia, questo protocollo può essere eseguito anche su C. elegans esposti a RNAi, come è stato fatto per convalidare i knockdown identificati in uno screening RNAi a livello di genoma per l'alterata sensibilità al levamisolo11.
Per questo test farmacologico, i vermi sono cresciuti fino all'età adulta in piastre a 24 pozzetti, 0,4 mM di levamisolo in tampone M9 sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e il numero di animali in movimento è stato registrato ogni 5 minuti per 1 ora. La paralisi indotta da levamisolo è stata osservata visivamente nel tempo e, dopo il completamento del test, i dati sono stati quantificati. La valutazione dei mutanti insieme al tipo selvatico C. elegans consente agli studenti di fare prima previsioni sui potenziali effetti fenotipici e quindi eseguire esperimenti per testare le loro ipotesi. In conclusione, questo semplice e economico saggio di levamisolo liquido è un modo ideale per dimostrare l'impatto della perdita di geni specifici sulla funzione NMJ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes</td>
			<td>TriTech Research</td>
			<td>Cat #: T3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Bacto Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0140-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#:12-556-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>Cat#: 02101382-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eri-1(mg366)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>GR1373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Bacto Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0123-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Statistical software)</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lev-10(x17)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>ZZ17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Splash Regular Bleach - 121oz - up &#38; up</td>
			<td>Target</td>
			<td>Search target.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 wild type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>Bristol N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide 10N</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unc-49(e407)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>CB407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unc-63(x26)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>ZZ26 </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring caenorhabditis elegans sensitivity to the acetylcholine receptor agonist levamisole

Alla giunzione neuromuscolare (NMJ), il legame del neurotrasmettitore eccitatorio acetilcolina (ACh) ai recettori postsinaptici porta alla contrazione muscolare. Come nel muscolo scheletrico dei vertebrati, la segnalazione colinergica nei muscoli della parete corporea dell'organismo modello Caenorhabditis elegans è necessaria per la locomozione. L'esposizione al levamisolo, un agonista farmacologico di una classe di recettori ACh sui muscoli della parete corporea, provoca la paralisi dipendente dal tempo degli animali selvatici. L'alterata sensibilità al levamisolo suggerisce difetti nella segnalazione alla NMJ o alla funzione muscolare. Qui viene presentato un protocollo per un saggio di levamisolo liquido eseguito su C. elegans coltivati in piastre a 24 pozzetti. Il nuoto vigoroso degli animali nel liquido consente la valutazione e la quantificazione della paralisi indotta dal levamisolo in centinaia di vermi per un periodo di tempo di un'ora senza richiedere una manipolazione fisica. Questa procedura può essere utilizzata sia con wild-type che con mutanti che hanno alterato la sensibilità al levamisolo per dimostrare le conseguenze funzionali della segnalazione alterata al NMJ.

La segnalazione attraverso i recettori AChR e GABA consente ai muscoli su un lato del corpo di C. elegans di contrarsi mentre i muscoli sull'altro lato si rilassano, consentendo la locomozione coordinata 6,16. Il legame del levamisolo alle L-AChR ionotropiche provoca la contrazione, portando alla paralisi dipendente dal tempo degli animali selvatici. Qui, abbiamo valutato la sensibilità del mutante wild type, mutante unc-63 L-AChR, mutante di clustering lev-10 L-AChR e mutante del recettore GABA A unc-49 C. elegans al levamisolo. Le mutazioni nelle subunità di L-AChR, così come nei geni necessari per il traffico di L-AChR alla membrana plasmatica muscolare, il raggruppamento di L-AChR postsinaptici e la segnalazione a valle di Ca 2+, causano resistenza alla paralisi 7,8,9,10,11,16,17, come osservato nei mutanti UNC-63 e LEV-10 (Figura2B ,C). La perdita del canale ionico GABA-dipendente UNC-49 ha causato ipersensibilità al levamisolo (Figura 2B,C) a causa dell'interruzione del corretto equilibrio della segnalazione colinergica e GABAergica12. Quando questo test è stato recentemente eseguito da studenti universitari in un laboratorio di genetica avanzata, il 100% degli studenti ha osservato la resistenza al levamisolo con i mutanti unc-63 e lev-10, mentre l'88% ha osservato ipersensibilità al levamisolo con il mutante unc-49. Questi dati raccolti con il test di nuoto del levamisolo liquido sono coerenti con i fenotipi osservati nei tradizionali saggi di levamisolo basati su piastre 7,8,11,12,13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64056/64056fig01.jpg"> Figura 1: Schema della preparazione e dell'implementazione del saggio di levamisolo. Vengono versate piastre NGM a 24 pozzetti; 2 giorni dopo, OP50 Escherichia coli viene seminato nei pozzi. C. elegans sono sincronizzati attraverso la preparazione della candeggina e gli animali del primo stadio larvale (L1) per ogni ceppo da saggiare (wild type, nero; UNC-63(x26), magenta; lev-10 (x17), verde; UNC-49 (E407), blu) vengono pipettati nei pozzetti secondo una mappa di piastre predeterminata il giorno seguente. Dopo 3 giorni di crescita a 20 ºC, o quando gli animali raggiungono l'età adulta, 0,4 mM di levamisolo in tampone M9 vengono aggiunti a ciascun pozzetto e il numero di animali in movimento viene contato ogni 5 minuti per 1 ora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64056/64056fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64056/64056fig02.jpg"> Figura 2: Paralisi indotta da levamisolo in C. elegans wild type e mutante rappresentativo. (A) L'esposizione a 0,4 mM di levamisolo provoca paralisi dipendente dal tempo; Ciò non è osservato per gli animali che nuotano in 1x tampone M9 per 1 ora. (B) Paralisi dipendente dal tempo di animali wild-type (nero), UNC-63 (x26) (magenta), lev-10 (x17) (verde) e UNC-49 (E407) (blu) nel saggio di nuoto del levamisolo. La perdita della subunità L-AChR UNC-63 o della proteina di clustering L-AChR LEV-10 ha provocato resistenza al levamisolo e la perdita del recettore GABAA UNC-49 ha causato ipersensibilità al levamisolo. n ≥ 50 per genotipo, p < 0,0001 per tutti i mutanti rispetto al tipo selvatico in questo esperimento rappresentativo. (C) Utilizzando gli stessi dati del pannello (B), è stata determinata la percentuale di animali in movimento in ciascun punto temporale (media delle percentuali per ciascun pozzo ± SE) per ciascun ceppo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64056/64056fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Il presente protocollo descrive un test per determinare la risposta al levamisolo, un agonista farmacologico di una classe di recettori dell'acetilcolina di Caenorhabditis elegans . In questo test di nuoto di levamisolo liquido, i ricercatori osservano visivamente e quantificano la paralisi dipendente dal tempo degli animali coltivati in piastre a 24 pozzetti.

Misurazione della Caenorhabditis elegans Sensibilità al levamisolo agonista del recettore dell'acetilcolina

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Questo protocollo consente ai ricercatori di osservare come i C-elgans rispondono all'agonista del recettore dell'acetilcolina Levamisole. L'alterata sensibilità al levamisolo può suggerire difetti nella segnalazione alla loro giunzione neuromuscolare o funzione muscolare. Un grande vantaggio è che il vigoroso nuoto di C-elgans nella soluzione di levamisolo consente ai ricercatori di quantificare la paralisi dipendente dal tempo di centinaia di vermi in una sola ora.Contare il numero di vermi in ogni pozzetto ogni cinque minuti può essere travolgente. Il numero di pozzi analizzati o i punti temporali possono essere regolati se necessario. Per iniziare preparare i terreni di crescita dei nematodi combinando tre grammi di cloruro di sodio, 2,5 grammi di pep tone e 17 grammi di agar con un litro di acqua deionizzata in un pallone con un mescolatore.Dopo l'autoclave, mettere il supporto su una piastra calda impostata a 70 gradi Celsius e mescolare a una velocità moderata per un'ora. Aggiungere un millilitro di cinque milligrammi per millilitro di colesterolo goccia a goccia per prevenire le precipitazioni. Un millilitro di un cloruro di calcio molare, un millilitro di un solfato di magnesio molare e 25 millilitri di un tampone molare pH 6,0 fosfato di potassio al supporto.Trasferire due millilitri di terreno di crescita dei nematodi in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti con una pipetta sierologica sterile. Lasciato asciugare i piatti sul piano del banco per due giorni prima di sedersi con batteri. Scegli una singola colonia op 50 nel brodo B e imposta la cultura a 37 gradi Celsius durante la notte.Utilizzando una pipetta sterile, far cadere 30 microlitri di sospensione OP50 sull'agar al centro di ciascun pozzetto. Lasciare riposare i piatti a temperatura ambiente per almeno due giorni dopo la seduta per consentire la formazione di un prato batterico. Coltiva selvatici tipo unc-63 Lev10 e unc-49 C-elgan fino all'età adulta su piastre di sei centimetri, preparando almeno otto piastre per ceppo.Preparare la soluzione sbiancante sotto il cofano il giorno della sincronizzazione. Mescolare 10 millilitri di candeggina, 2,5 millilitri di idrossido di sodio e 37,5 millilitri di acqua deionizzata in un tubo cronico da 50 millilitri. Utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica, lavare i vermi adulti gravidi da almeno quattro piastre con tampone M9 e trasferirli in una provetta da 15 millilitri.Ruotare quel 716 G per un minuto a temperatura ambiente e quindi rimuovere il super natante usando una pipetta di trasferimento. Aggiungere 10 millilitri della soluzione sbiancante. Agitare delicatamente il tubo per quattro minuti fino a quando la maggior parte, ma non tutte le carcasse di vermi si sono dissolte.Girare a 716 G per un minuto. Versare la soluzione di candeggina in un solo movimento. Finché il tubo non viene scosso a questo punto, le uova si attaccheranno al lato del tubo a 15 millilitri di tampone M9 e si invertiranno.Ruotare a 716 G per un minuto e versare il buffer M9 con un movimento regolare. Ripetere questo lavaggio con soluzione tampone tre volte. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 10 millilitri di M9 fresco e posizionare su un rotatore durante la notte a 15 gradi Celsius per isolare una popolazione sincronizzata di animali affamati al primo stadio larvale.Stampa su 24 pozzetti e assegna ceppi a luoghi casuali. Circa 24 ore dopo la preparazione della candeggina, spin down i vermi L1 affamati a 716 G per un minuto a temperatura ambiente. Rimuovere circa nove millilitri di tampone M9 con una pipetta di trasferimento di plastica, quindi mescolare delicatamente i vermi del primo stadio larvale affamati nel restante tampone M9.Pipettare immediatamente tre microlitri di vermi e tampone M9 su un vetrino da microscopio e determinare il numero di L1. Il numero desiderato è da 20 a 30 L1 in tre microlitri. Pipettare tre microlitri di L1 in ciascun pozzetto secondo la mappa delle piastre prefabbricata, lasciare che i vermi crescano fino all'età adulta per tre giorni a 20 gradi Celsius.Stampare il foglio dati vuoto che verrà utilizzato per registrare il numero di vermi che si muovono in ciascun pozzetto ogni cinque minuti per un'ora. Controllare i vermi nelle piastre da 24 pozzetti. Usando un pennarello, fai una X sul coperchio della piastra su tutti i pozzi che hanno contaminazione, sono affamati o hanno troppi vermi, il che renderà difficile il conteggio.Produrre una soluzione di levamisolo da 0,4 millimolari aggiungendo 200 microlitri di materiale di levamisolo da 100 millimolari a 50 millilitri di M9. Avviare un timer e quindi utilizzare una pipetta di trasferimento aggiungere un millilitro di 0,4 millimolari di levamisolo ai primi due pozzetti, in modo che gli animali nuotino liberamente. Continuare ad aggiungere Levamisolo ai pozzi adiacenti, scaglionando il tempo in base al numero di pozzi da saggiare. Dopo cinque minuti, iniziare a contare manualmente solo il numero di vermi in movimento in ciascun pozzetto, iniziando dal primo pozzo, e registrare quel numero sul foglio dati.Continua a contare il numero di vermi in movimento in ciascun pozzetto ogni cinque minuti per un'ora. Alla fine del test o quando il tempo lo consente, registrare il numero totale di vermi in ciascun pozzetto. Ottenere la piastra, mappare e registrare quale ceppo corrisponde a ciascun pozzetto.Inserisci i dati in un foglio di calcolo che inizia con il numero totale di vermi in ciascun pozzetto e organizzandoli per genotipo. Combinando i dati provenienti dai pozzi, determinare il numero di vermi che si muovono in ogni punto temporale. Usa questo per calcolare il numero che paralizza in ogni punto temporale.Creare una tabella di dati in modo tale che la colonna di sinistra indichi l'ora e le colonne successive contengano i dati per ogni ceppo. Per ogni animale paralizzato entro i primi cinque minuti, crea una riga e inseriscine una per cinque minuti. Ripeti questa operazione per ogni punto temporale.Per tutti gli animali che non paralizzano entro la fine del test, inserire uno zero per 60 minuti. Utilizzare questi dati per creare una curva di sopravvivenza nel software statistico specifico utilizzato qui per visualizzare visivamente la paralisi dipendente dal tempo della popolazione. I dati relativi a tutti i ceppi analizzati devono essere inseriti nella stessa tabella di dati, lasciando gli spazi necessari.Mutazioni nelle subunità del recettore dell'acetilcolina levamisolo, così come nei geni necessari per il raggruppamento dei recettori dell'acetilcolina sensibili al levamisolo post-sinaptici, causano resistenza alla paralisi indotta dal levamisolo come osservato rispettivamente nei mutanti unc-63 e Lev-10. La perdita del canale ionico GABA-dipendente unc-49 ha causato ipersensibilità al levamisolo a causa dell'interruzione del corretto equilibrio della segnalazione colinergica e GABAergica. La corretta preparazione di 24 piastre di pozzetto è essenziale.Se i prati batterici non sono asciutti prima di individuare L1, la soluzione di levamisolo può diventare torbida durante il test, il che inibisce l'osservazione. Modificando le 24 piastre del pozzetto, questo protocollo può essere eseguito con animali abbattuti con RNAi. Ciò consente ai ricercatori di studiare i geni di C-elgan, per i quali i mutanti non sono disponibili.

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

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Analisi trascrittomica di<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing dati attraverso la suite Tuxedo sul Progetto Galaxy

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Ricerca

Genetica

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