Name: measuring caenorhabditis elegans sensitivity to the acetylcholine receptor agonist levamisole
Uploaded: 2022-06-07T14:00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole at JoVE.com

Agradecemos a Riya Dattani e Lauren Hogstrom, que coletaram os dados na Figura 2B,C cega ao genótipo no Laboratório de Genética Avançada BISC413 (Primavera 2022) na Universidade de Delaware. Informações adicionais sobre a experiência de pesquisa de graduação baseada em curso BISC413 (CURE), bem como acesso ao manual de laboratório projetado por J. Tanis, estão disponíveis mediante solicitação. As cepas de nematode foram fornecidas pelo Centro de Genética de Caenorhabditis , que é apoiado pelo NIH-ORIP (P40 OD010440). Este trabalho foi apoiado por um P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (para J.E.T.).

1. Preparação de placas para o ensaio de levamisole
<ol><li>Prepare a mídia média de crescimento nematode (NGM) combinando 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone e 17 g de ágar com 1 L de água desionizada (DI) em um frasco com uma barra de mexida.</li>
	<li>Depois de autoclaving, coloque a mídia em uma placa quente definida para 70 °C e mexa a uma velocidade moderada por 1h.</li>
	<li>Adicione 1 mL de colesterol de 5 mg/mL em sentido gotílico para evitar a precipitação, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4 e 25 mL de 1 M pH 6.0 tampão fosfato de potássio para a mídia.</li>
	<li>Transfira 2 mL de mídia NGM em cada poço de uma placa de 24 poços com uma pipeta sorológica estéril (Figura 1).</li>
	<li>Deixe as placas secarem no banco por 2 dias antes de semear com bactérias. Para armazenamento a longo prazo, coloque-os a 4 °C.</li>
	<li>Listra para fora OP50 E. coli em uma placa de caldo de lysogeny (LB) e crescer durante a noite a 37 °C.</li>
	<li>Escolha uma única colônia OP50 em caldo B (10 g de triptona e 5 g de NaCl em 1 L de DI H2O) e coloque a cultura tremendo a 37 °C durante a noite.</li>
	<li>Usando uma tubulação estéril, solte 30 μL de suspensão OP50 no ágar no meio de cada poço (Figura 1). NOTA: Certifique-se de não danificar a superfície do ágar, pois isso levará à escavação de vermes.</li>
	<li>Deixe as placas sentarem-se à temperatura ambiente por pelo menos 2 dias após a semeadura para permitir que um gramado bacteriano se forme. NOTA: Se a bactéria nos poços centrais não estiver seca após 2 dias, deixe as placas abertas no capô por 20 minutos (Figura 1). As placas devem ser derramadas e semeadas com bactérias de 1 a 2 semanas antes do ensaio.</li>
</ol>2. Sincronizando C. elegans (dia 1)
<ol><li>Cresça do tipo selvagem, unc-63(x26), lev-10(x17), e unc-49(e407) C. elegans até a idade adulta em placas de 6 cm, preparando pelo menos oito placas por cepa. Confirme que há muitos adultos não famintos nas placas. NOTA: Esta é o dobro de placas que o necessário; no entanto, é importante ter placas de backup no caso do primeiro lote de ovos ser destruído durante o branqueamento.</li>
	<li>Faça 10x M9 tampão dissolvendo 59,6 g de Na2HPO4 (dibasic), 29,9 g de KH2PO4 (monobásico), 12,8 g de NaCl e 2,5 g de MgSO4 em 750 mL de água DI com agitação. Uma vez dissolvido, leve o volume até 1 L e o filtro seja esterilizado. Diluir 1:10 e autoclave para fazer 1x tampão M9. NOTA: O buffer 1x M9 pode ser feito semanas ou meses de antecedência.</li>
	<li>Prepare a solução de branqueamento sob o capô no dia da sincronização. Misture 10 mL de alvejante (Tabela de Materiais), 2,5 mL de 10 N NaOH e 37,5 mL de água DI em um tubo cônico de 50 mL. Use óculos, luvas e um jaleco sempre que trabalhar com a solução de branqueamento.</li>
	<li>Usando um tubo de transferência de plástico, lave vermes adultos gravid de pelo menos quatro placas com tampão 1x M9 e transfira-os para um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Gire a 716 x g por 1 min a temperatura ambiente e, em seguida, remova o supernante usando uma tubulação de transferência.</li>
	<li>Adicione 10 mL da solução de branqueamento. Inverter ou agitar suavemente o tubo por ~4 min até que a maioria, mas não todas, as carcaças de vermes tenham dissolvido (Figura 1). NOTA: Tenha cuidado para não branquear demais os vermes, pois isso destruirá os ovos. Certas mutações podem aumentar a dificuldade de isolamento dos ovos.</li>
	<li>Gire em 716 x g por 1 min.</li>
	<li>Despeje a solução de alvejante em um movimento; enquanto o tubo não estiver abalado neste momento, os ovos grudarão na lateral do tubo.</li>
	<li>Adicione 15 mL de tampão M9 1x e inverta. Gire a 716 x g por 1 min, e despeje o tampão M9 em um movimento suave.</li>
	<li>Realize três lavagens no total com tampão M9 1x, conforme descrito na etapa 2.9.</li>
	<li>Após a lavagem final, adicione 10 mL de 1x M9 fresco e coloque em um rotador durante a noite a 15 °C para isolar uma população sincronizada de animais de estágio primeiro larval (L1) famintos. NOTA: Antes de colocar no rotador, verifique se há ovos no buffer M9. Se não, repita a preparação com placas de backup e alvejante por um tempo menor.</li>
</ol>3. Chapeamento sincronizado C. elegans (dia 2)
<ol><li>Imprima um mapa de placas de 24 poços e atribua cepas a lugares randomizados. Cada cepa deve ser representada na placa de 24 poços pelo menos seis vezes.</li>
	<li>Aproximadamente 24 h após a preparação do alvejante, gire para baixo eclodidos vermes L1 famintos em tampão M9 a 716 x g por 1 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova ~9 mL de tampão M9 com um tubo de transferência de plástico e, em seguida, misture suavemente os vermes de estágio larval famintos (L1s) no tampão M9 restante.</li>
	<li>Insurrea imediatamente 3 μL dos worms no buffer M9 em um slide de microscópio e determine o número de L1s; o número desejado é de 20-30 L1s em 3 μL. Gire para baixo e remova M9 se a concentração do worm estiver muito baixa, e adicione M9 se a concentração for muito alta. NOTA: Verifique o número de worms por 3 μL pelo menos 2x, invertendo o tubo cada vez.</li>
	<li>Pipet 3 μL de L1s (20-30 worms total) em cada poço de acordo com o mapa da placa pré-feita (passo 3.1; Figura 1). NOTA: Inverta o tubo com os L1s em M9 com frequência para manter uma distribuição uniforme de vermes, pois eles se estabelecerão até o fundo. Se isso não for feito, alguns poços terão poucos vermes, enquanto outros terão muitos. Além disso, não fure o ágar com a ponta pipeta, pois isso fará com que os animais se enterrem.</li>
	<li>Deixe os vermes crescerem até a idade adulta por 3 dias a 20 °C. NOTA: O uso de diferentes temperaturas de crescimento e certas mutações podem afetar a velocidade de maturação, por isso não deixe de considerar o ciclo de vida C. elegans .</li>
</ol>4. Realizando o ensaio de levamisole (dia 5)
<ol><li>Imprima uma folha de dados em branco, que será usada para registrar o número de worms movendo-se em cada poço a cada 5 minutos por 1 h. NOTA: Os alunos poderão contar os vermes em no máximo 12 poços a cada 5 minutos. Os 12 melhores poços são avaliados na primeira hora, com os 12 poços inferiores avaliados na hora seguinte.</li>
	<li>Verifique os vermes nas placas de 24 poços. Usando um marcador, faça um "X" na tampa da placa sobre quaisquer poços que tenham contaminação, tenham passado fome ou tenham muitos vermes (>40), o que dificultará a contagem.</li>
	<li>Faça solução de levamisole de 0,4 mM adicionando 200 μL de 100 mM de estoque de levamisole a 50 mL de 1x M9. Prepare 100 mM de caldo de levamisole dissolvendo 240,76 mg de cloridrato de levamisole em 10 mL de H2O e armazene-o a −20 °C. NOTA: Levamisole deve ser diluído em M9; diluição em H2O acelera a paralisia. Os alunos devem usar luvas. A ingestão de altas concentrações de levamisole é tóxica.</li>
	<li>Inicie um temporizador e, em seguida, usando um pipet de transferência, adicione 1 mL de levamisole de 0,4 mM aos dois primeiros poços, de tal forma que os animais estão nadando livremente. Continue adicionando levamisole aos poços adjacentes, cambaleando o tempo de acordo com o número de poços a serem avaliados. NOTA: Por exemplo, se 10 poços forem avaliados, o levamisole será adicionado da seguinte forma: poços 1 e 2 no tempo 0, poços 3 e 4 após 1 min, poços 5 e 6 após 2 min, poços 7 e 8 após 3 min, e poços 9 e 10 após 4 min.</li>
	<li>Em 5 min, comece contando manualmente apenas o número de vermes em movimento em cada poço, começando com o primeiro poço, e regise esse número na folha de dados (Figura 1). Contadores podem ser usados, mas não são necessários para determinar com precisão o número de worms em movimento. NOTA: Os alunos precisam ficar de olho no temporizador, pois às vezes ficam para trás durante os primeiros momentos antes que muitos vermes paralisem. O número de pontos de tempo pode ser ajustado, ou menos poços podem ser avaliados em cada ponto de tempo, se necessário.</li>
	<li>Continue a contar o número de vermes em movimento em cada poço a cada 5 minutos por 1 h. NOTA: A imersão em M9 induz o movimento constante da natação ao longo deste ensaio de 1h, o que elimina a necessidade de prodding dos vermes para avaliar a paralisia (Figura 2A). A exposição à solução de levamisole de 0,4 mM induz paralisia dependente do tempo, conforme observado pela cessação da natação; vermes que paralisam não se recuperam.</li>
	<li>Repetir as etapas 4.4.-4.6. para o resto dos poços na placa.</li>
	<li>No final do ensaio, ou quando o tempo permitir, registo o número total de vermes em cada poço.</li>
</ol>5. Análise de dados
<ol><li>Obtenha o mapa da placa (etapa 3.1.) e regise qual cepa corresponde a cada poço. NOTA: Devido à quantidade de dados coletados, a análise e discussão subsequentes dos dados levará pelo menos algumas horas.</li>
	<li>Insira os dados em uma planilha, começando com o número total de worms em cada poço e organizando por genótipo.</li>
	<li>Combinando dados dos poços, determine o número de vermes se movendo em cada ponto de tempo para cada cepa.</li>
	<li>Use esses dados para criar uma "curva de sobrevivência" no software estatístico (Tabela de Materiais) para exibir visualmente a paralisia dependente do tempo da população (Figura 2B).</li>
	<li>Faça uma tabela de dados de modo que a coluna da mão esquerda indique tempo e as colunas subsequentes contenham os dados de cada cepa. Para cada animal que está paralisado dentro dos primeiros 5 minutos, crie uma linha e digite um "1" por 5 min. Repita isso para cada ponto de tempo. Para todos os animais que não paralisam até o final do ensaio, digite um "0" por 60 min.</li>
	<li>Realize comparações em pares usando o teste de log-rank (Mantel-Cox) no software estatístico (Tabela de Materiais) para determinar se há uma diferença estatisticamente significativa entre duas cepas diferentes.</li>
	<li>Para análise adicional/alternativa, em vez de realizar a etapa 5.3. e passo 5.4., determinar a porcentagem de animais que se movem em cada poço em cada ponto de tempo. Plote a média com erro padrão em cada ponto de tempo para todas as cepas avaliadas usando um programa de planilha ou o software estatístico (Figura 2C).</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm conflito de interesses.

A resposta alterada ao levamisole pode identificar genes necessários para sinalização colinérgica postiática e função muscular. O protocolo aqui descreve um ensaio líquido de levamisola usado para quantificar paralisia dependente do tempo durante um período de tempo de 1h. Os alunos fazem previsões sobre os efeitos de certas mutações genéticas, realizam um experimento com grande tamanho amostral e, em seguida, quantitam seus resultados. Este ensaio é uma maneira simples e eficiente de quantificar a paralisia induzida por levamisole sem colher ou cutucar animais, tornando-o adequado para laboratórios de graduação, bem como pesquisadores que estudam a transmissão neuromuscular. Aqui discutidos estão algumas das armadilhas mais comuns, as limitações do ensaio e uma variação ao protocolo que permite seu uso com animais de knockdown RNAi; também discutido aqui é como este ensaio pode ser incorporado em uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso.
A preparação adequada das placas de 24 poços é essencial. Primeiro, os gramados bacterianos devem estar completamente secos antes de detectar animais L1 nos poços. Se não estiver seca o suficiente, a bactéria se mistura com a solução de levamisole durante o ensaio, tornando o líquido nublado e impedindo que os indivíduos possam contar os vermes. Em segundo lugar, ao sincronizar vermes através da preparação de alvejante, os animais não devem ser expostos à solução alvejante por muito tempo, pois isso fará com que o revestimento protetor dos ovos se desinte com isso. Em terceiro lugar, é crucial detectar apenas 20-30 L1s por bem, já que muitos vermes nos poços tornam extremamente difícil contar com precisão o número se movendo no tempo atribuído. Por fim, é importante manter uma técnica asséptica durante a preparação das placas, pois os poços contaminados não podem ser avaliados. 
Existem algumas limitações que devem ser consideradas ao realizar este ensaio. Primeiro, contar o número de vermes em movimento em cada poço a cada 5 minutos pode ser esmagador para indivíduos que não têm experiência de laboratório prévia, e isso pode levar a uma coleta de dados imprecisa. Quanto a outros ensaios usados para determinar a sensibilidade da droga18,19, este experimento pode ser realizado com menos pontos de tempo. Em segundo lugar, o revestimento de L1s famintos isolados de uma preparação alvejante é um método fácil de obter uma população sincronizada; no entanto, ajustes devem ser feitos se o tempo de desenvolvimento difere entre as cepas que estão sendo avaliadas. É possível escolher animais de estágio quarto quarto (L4s) em uma placa de 24 poços para este ensaio; no entanto, ao preparar muitas placas, isso é muito trabalhoso. Alternativamente, deve-se determinar o tempo necessário para que cada cepa chegue a L4 e, em seguida, coloque os L1s nos poços em diferentes momentos para ajustar para diferenças na velocidade de maturação. Finalmente, enquanto este ensaio pode ser usado para identificar novos genes importantes para a função muscular não sináptica11, a resposta de levamisole alterada também pode ser causada por mutação ou down RNAi de genes pré-sinápticos12. Se observada a sensibilidade do levamisole alterado, devem ser realizados experimentos adicionais para determinar a razão deste fenótipo.
Ao fazer algumas modificações nas placas de 24 poços, o ensaio de natação de levamisole descrito também pode ser realizado em animais de knockdown RNAi11. O knockdown genético através do RNAi pode ser alcançado alimentando bactérias C. elegans que expressam RNA de dupla encalhada correspondente ao gene de interesse20. Para a preparação das placas RNAi, 1 mL de 1M IPTG e 1 mL de carbenicilina de 25 mg/mL devem ser adicionados por litro de mídia após a remoção da autoclave. As culturas bacterianas são cultivadas escolhendo uma única colônia em 3 mL de caldo LB mais 3 μL de 25 mg/mLcarbenicillin, e tremendo a 37 °C durante a noite, e o mapa da placa é feito quando as diferentes bactérias são vistas nos poços. C. elegans são sincronizados pela preparação de alvejante como descrito; no entanto, a cepa eri-1 (mg366) hipersensível RNAi deve ser usada em vez do tipo selvagem para aumentar o knockdown genético. Os knockdowns rnai resultam nos mesmos fenótipos de levamisole observados para mutantes de perda de função11. 
O protocolo aqui apresentado pode ser usado em pesquisas laboratoriais, como um experimento autônomo no laboratório de graduação, ou nas semanas de abertura de um curso avançado de graduação como introdução às técnicas básicas de C. elegans e função neuromuscular. Em um curso mais avançado baseado em descobertas, os alunos podem usar este ensaio para determinar se a perda de C. elegans homólogos de genes mutantes em indivíduos com síndromes miástênicas, distrofias musculares ou miopatias alteram a sensibilidade do levamisole. Em conclusão, este simples e barato ensaio de sensibilidade de levamisole fornece uma abordagem prática para aprender sobre sinalização no NMJ e ganhar experiência trabalhando com o sistema modelo C. elegans .

A ativação de receptores pós-sinápticos de acetilcolina (AChRs) no músculo esquelético resulta em um sinal elétrico que leva à contração muscular. A interrupção da função neuromuscular resulta em síndromes miasthenic e distrofias musculares em humanos 1,2,3,4. O nematode Caenorhabditis elegans tem sido amplamente utilizado para aprender sobre processos biológicos fundamentais e mecanismos de doença evolutivamente conservados. Os músculos esqueléticos vertebrados e os músculos da parede corporal de C. elegans são funcionalmente equivalentes no controle da locomoção5. Aqui, é apresentado um simples ensaio que pode ser usado para comparar elegans tipo selvagem com mutantes que alteraram a sinalização neuromuscular ou a função muscular.
Insumos excitatórios e inibitórios recebidos de neurônios motores colinérgicos e GABAérgicos, respectivamente, fazem com que os músculos de um lado do corpo de C. elegans se contraam enquanto os músculos do outro lado relaxam, permitindo a locomoção coordenada6. Levamisole, um agente antelminético usado para tratar infecções de nematoide parasitas, liga-se e ativa constitutivamente uma classe de AChRs nos músculos da parede do corpo, resultando em paralisia dependente do tempo7. Assim, a sensibilidade alterada ao levamisole pode ser utilizada para identificar C. elegans com defeitos no equilíbrio da sinalização excitatória e inibitória 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Por exemplo, mutações em subunidades do AChR sensível ao levamisole (L-AChR), como o UNC-63, bem como o cojenco C. elegans de Cubilin, LEV-10, que é necessário para o agrupamento L-AChR na sinapse, sinalização excitatória de impacto e resultam em resistência ao levamisole 7,8. Mutações no receptor GABAA UNC-49 reduzem a sinalização inibitória e causam hipersensibilidade ao levamisole12.
A hipersensibilidade ou resistência ao levamisole tem sido tradicionalmente avaliada transferindo animais para placas de ágar contendo levamisole e, em seguida, regularmente estimulando os vermes para determinar o ponto de tempo em que a paralisia ocorre 13,14,15. Desenvolvemos um ensaio de natação de leveisole líquido que elimina a necessidade de manipulação física dos animais e permite a triagem de centenas de animais em apenas 1h. Aqui, descreve-se o uso deste ensaio com animais do tipo selvagem, unc-63(x26), lev-10(x17)e unc-49(e407). No entanto, este protocolo também pode ser realizado em C. elegans expostos à RNAi, como foi feito para validar knockdowns identificados em uma tela RNAi em todo o genoma para sensibilidade de levamisole alterada11.
Para este ensaio farmacológico, os vermes foram cultivados até a idade adulta em placas de 24 poços, 0,4 mM de levamisole em tampão M9 foi adicionado a cada poço, e o número de animais em movimento foi registrado a cada 5 minutos por 1 h. A paralisia induzida por levamisole foi observada visualmente ao longo do tempo e, após a conclusão do ensaio, os dados foram quantificados. A avaliação dos mutantes, juntamente com os tipos selvagens C. elegans , permite que os alunos primeiro façam previsões sobre potenciais efeitos fenotípicos e, em seguida, realizem experimentos para testar suas hipóteses. Em conclusão, este ensaio simples, barato e líquido de levamisola líquida é uma maneira ideal de demonstrar o impacto da perda de genes específicos na função NMJ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes</td>
			<td>TriTech Research</td>
			<td>Cat #: T3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Bacto Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0140-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#:12-556-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>Cat#: 02101382-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eri-1(mg366)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>GR1373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Bacto Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0123-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Statistical software)</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lev-10(x17)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>ZZ17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Splash Regular Bleach - 121oz - up &#38; up</td>
			<td>Target</td>
			<td>Search target.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 wild type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>Bristol N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide 10N</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unc-49(e407)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>CB407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unc-63(x26)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>ZZ26 </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring caenorhabditis elegans sensitivity to the acetylcholine receptor agonist levamisole

Na junção neuromuscular (NMJ), a ligação da acetilcolina neurotransmissor excitatória (ACh) aos receptores pós-sinápticos leva à contração muscular. Como no músculo esquelético vertebrado, a sinalização colinérgica nos músculos da parede corporal do organismo modelo Caenorhabditis elegans é necessária para locomoção. A exposição ao levamisole, um agonista farmacológico de uma classe de receptores ACh nos músculos da parede do corpo, causa paralisia dependente do tempo de animais do tipo selvagem. A sensibilidade alterada ao levamisole sugere defeitos na sinalização no NMJ ou função muscular. Aqui, é apresentado um protocolo para um ensaio líquido de leveisole realizado em C. elegans cultivados em placas de 24 poços. A natação vigorosa dos animais em líquido permite a avaliação e a quantitação da paralisia induzida por levamisole em centenas de vermes durante um período de uma hora sem exigir manipulação física. Este procedimento pode ser usado tanto com tipo selvagem quanto com mutantes que alteraram a sensibilidade ao levamisole para demonstrar as consequências funcionais da sinalização alterada no NMJ.

A sinalização através de AChRs e receptores GABA permite que os músculos de um lado do corpo de C. elegans se contraam enquanto os músculos do outro lado relaxam, permitindo locomoção coordenada 6,16. A ligação de levamisole aos L-AChRs ionotrópicos causa contração, levando à paralisia dependente do tempo de animais do tipo selvagem. Aqui, avaliamos a sensibilidade do tipo selvagem, mutante unc-63 L-AChR, mutante de agrupamento lev-10 L-AChR, e unc-49 GABAA receptor mutante C. elegans to levaisole. Mutações em subunidades do L-AChR, assim como em genes necessários para o tráfico de L-AChRs para a membrana plasmática muscular, agrupamento de L-AChRs postsínapticas, e sinalização ca2+ a jusante, causam resistência à paralisia induzida por levamisole 7,8,9,10,11,16,17, como observado nos mutantes unc-63 e lev-10 (Figura 2B (C). A perda do canal de íons porta-gab-gated UNC-49 causou hipersensibilidade de levamisole (Figura 2B,C) devido à interrupção do equilíbrio adequado da sinalização colinérgica e GABAérgica12. Quando este ensaio foi recentemente realizado por graduandos em um laboratório de genética avançada, 100% dos alunos observaram resistência à levamisola com os mutantes unc-63 e lev-10, enquanto 88% observaram hipersensibilidade de levamisole com o mutante unc-49. Esses dados coletados com o ensaio de natação de leveisole líquido são consistentes com fenótipos observados nos ensaios tradicionais de levamisola à base de placas 7,8,11,12,13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64056/64056fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de preparação e implementação do ensaio de levamisole. Placas de GNL de 24 poços são derramadas; 2 dias depois, OP50 Escherichia coli é semeada nos poços. C. elegans são sincronizados através da preparação de alvejantes, e primeiro estágio larval (L1) animais para cada cepa a ser avaliada (tipo selvagem, preto; unc-63(x26), magenta; lev-10(x17), verde; unc-49(e407), azul) são pipetos nos poços de acordo com um mapa de placas predeterminada no dia seguinte. Após 3 dias de crescimento a 20 ºC, ou quando os animais atingem a idade adulta, 0,4 mM de levamisole em M9 tampão é adicionado a cada poço, e o número de animais em movimento é contado a cada 5 minutos por 1 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64056/64056fig01large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64056/64056fig02.jpg"> Figura 2: Paralisia induzida por levamisole em tipo selvagem e mutante representativo C. elegans. (A) A exposição a levamisole de 0,4 mM causa paralisia dependente do tempo; isso não é observado para animais nadando em tampão M9 1x por 1 h. (B) Paralisia dependente do tempo de animais do tipo selvagem (preto), unc-63(x26) (magenta), lev-10(x17) (verde) e animais unc-49(e407) (azul) no ensaio de natação de leveisole. A perda da subunidade L-AChR UNC-63 ou L-AChR, proteína de agrupamento LEV-10, resultou na resistência ao levamisole, e a perda do receptor GABAA UNC-49 causou hipersensibilidade de levamisole. n ≥ 50 por genótipo, p < 0,0001 para todos os mutantes em comparação com o tipo selvagem neste experimento representativo. (C) Utilizando os mesmos dados do painel (B), foi determinada a porcentagem de animais em movimento em cada ponto de tempo (média das porcentagens para cada poço ± SE) para cada cepa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64056/64056fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

O presente protocolo descreve um ensaio para determinar a resposta ao levamisole, um agonista farmacológico de uma classe de receptores de acetilcolina caenorhabditis . Neste ensaio de natação de leveisole líquido, os pesquisadores observam visualmente e quantificam a paralisia dependente do tempo de animais cultivados em placas de 24 poços.

Medindo a sensibilidade de Caenorhabditis para o Receptor acetilcolina Agonista Levamisole

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Este protocolo permite que os pesquisadores observem como os C-elgans respondem ao agonista agonista do receptor acetilcolina Levamisole. A sensibilidade do levamisole alterado pode sugerir defeitos na sinalização em sua junção neuromuscular ou função muscular. Uma grande vantagem é que a natação vigorosa de C-elgans na solução levaisole permite aos pesquisadores quantitativar o tempo dependente da paralisia de centenas de vermes em apenas uma hora.Contar o número de vermes em cada poço a cada cinco minutos pode ser esmagador. Número de poços avaliados ou pontos de tempo podem ser ajustados se necessário. Para começar a preparar a mídia de crescimento nematoide combinando três gramas de cloreto de sódio, 2,5 gramas de tom de pep e 17 gramas de ágar com um litro de água deionizada em um frasco com uma barra de mexida.Depois de autoclaving, coloque a mídia em uma placa quente definida para 70 graus Celsius e mexa a uma velocidade moderada por uma hora. Adicione um mililitro de cinco miligramas por mililitro de colesterol em sentido para evitar a precipitação. Um mililitro de um cloreto de cálcio molar, um mililitro de um sulfato de magnésio molar, e 25 mililitros de um tampão de fosfato de potássio de pH 6.0 molar para a mídia.Transfira dois mililitros de mídia de crescimento de nematoides em cada poço de uma placa de poço 24 com uma pipeta sorológica estéril. Permitiu que as placas secassem na parte superior do banco por dois dias antes de sentar com bactérias. Escolha uma única colônia op 50 em caldo B e coloque a cultura tremendo a 37 graus Celsius durante a noite.Usando uma pipeta estéril, solte 30 microliters de suspensão OP50 no ágar no meio de cada poço. deixe as placas sentarem-se à temperatura ambiente por pelo menos dois dias após o assento para permitir que um gramado bacteriano se forme. Cresça tipo selvagem unc-63 Lev10 e unc-49 C-elgan até a idade adulta em placas de seis centímetros, preparando pelo menos oito placas por cepa.Prepare a solução de branqueamento sob o capô no dia da sincronização. Misture 10 mililitros de alvejante, 2,5 mililitros de hidróxido de sódio e 37,5 mililitros de água deionizada em um tubo de crônica de 50 mililitros. Usando uma pipeta de transferência de plástico lavar vermes adultos gravid de pelo menos quatro placas com tampão M9 e transferi-los para um tubo de crônica de 15 mililitros.Gire esse 716 G por um minuto em temperatura ambiente e, em seguida, remova o super natant usando uma pipeta de transferência. Adicione 10 mililitros da solução de branqueamento. Agite suavemente o tubo por quatro minutos até que a maioria, mas nem todas as carcaças de vermes se dissolveram.Gire a 716 G por um minuto. Despeje a solução de alvejante em um movimento. Enquanto o tubo não estiver agitado neste momento, os ovos grudarão na lateral do tubo a 15 mililitros de tampão M9 e invertido.Gire a 716 G por um minuto e despeje o tampão M9 em um movimento suave. Repita esta lavagem com a solução tampão três vezes. Após a lavagem final, adicione 10 mililitros de M9 fresco e coloque em um rotador durante a noite a 15 graus Celsius para isolar uma população sincronizada de animais de estágio larval famintos.Imprima até 24 placas de poço e atribua cepas a lugares randomizados. Aproximadamente 24 horas após a preparação do alvejante, gire para baixo eclodidos vermes L1 famintos a 716 G por um minuto em temperatura ambiente. Remova aproximadamente nove mililitros de tampão M9 com uma pipeta de transferência de plástico e, em seguida, misture suavemente os vermes de estágio larval famintos no tampão M9 restante.Imediatamente pipete três microlitros dos worms e tampão M9 em um slide de microscópio e determine o número de L1.. O número desejado é de 20 a 30 L1 em três microliters. Pipeta três microliters de L1 em cada poço de acordo com o mapa da placa pré-feita, deixe os vermes crescerem até a idade adulta por três dias a 20 graus Celsius.Imprima a ficha de dados em branco que será usada para registrar o número de worms movendo-se em cada poço a cada cinco minutos durante uma hora. Verifique os vermes nas 24 placas do poço. Usando um marcador, faça um X na tampa da placa sobre quaisquer poços que tenham contaminação, tenham fome ou tenham muitos vermes, o que dificultará a contagem.Faça a solução Levaisole 0,4 milimão adicionando 200 microliters de 100 mililitros de levamisole a 50 mililitros de M9. Inicie um temporizador e, em seguida, usando uma pipeta de transferência adicione um mililitro de 0,4 mililitro de levamisole aos dois primeiros poços, de tal forma que os animais estão nadando livremente. Continue adicionando Levamisole aos poços adjacentes, cambaleando o tempo de acordo com o número de poços a serem avaliados. Em cinco minutos, comece contando manualmente apenas o número de worms em movimento em cada poço, começando com o primeiro poço, e regise esse número na ficha técnica.Continue contando o número de vermes em movimento em cada poço a cada cinco minutos por uma hora. No final do ensaio ou quando o tempo permitir, registo o número total de vermes em cada poço. Obtenha a placa, mapa e registro qual cepa corresponde a cada poço.Digite os dados em uma planilha começando com o número total de worms em cada poço e organizando por genótipo. Combinando dados dos poços, determine o número de vermes se movendo em cada ponto de partida. Use isso para calcular o número que paralisa em cada ponto de tempo.Faça uma tabela de dados de modo que a coluna da mão esquerda indique tempo e as colunas subsequentes contenham os dados de cada cepa. Para cada animal que estiver paralisado nos primeiros cinco minutos, crie uma linha e entre em uma por cinco minutos. Repita isso para cada ponto de tempo.Para todos os animais que não paralisam até o final do ensaio, entre em um zero por 60 minutos. Use esses dados para criar uma curva de sobrevivência no software estatístico específico utilizado aqui para exibir visualmente a paralisia dependente do tempo da população. Os dados de todas as cepas indicadas devem ser inseridos na mesma tabela de dados, deixando os espaços conforme necessário.Mutações em subunidades do receptor de acetilcolina levamisole, bem como em genes necessários para o agrupamento de receptores de acetilcolina sensível levamisole pós-sináptico, causam resistência à paralisia induzida por Levamisole, como observado nos mutantes unc-63 e Lev-10, respectivamente. A perda do canal de íons porta-se GABA unc-49 causou hipersensibilidade de Levamisole devido à interrupção do equilíbrio adequado da sinalização colinérgica e GABAérgica. A preparação adequada de 24 placas de poço é essencial.Se os gramados bacterianos não estiverem secos antes de detectar a solução levamisole de L1 pode ficar nublado durante o ensaio, o que inibe a observação. Modificando as 24 placas do poço, este protocolo pode ser realizado com animais abatidos pela RNAi. Isso permite que os pesquisadores estudem os genes de C-elgan, para os quais os mutantes não estão disponíveis.

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

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Análise transcriptomic de<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequenciação de dados através da Suíte Tuxedo no Projeto Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Genética

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

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O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Um método para estudar o polimorfismo C924T do Gene do Receptor tromboxano A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

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Manipulação de ploidia em Caenorhabditis elegans

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The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

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O método de conjunto de réplica: Uma abordagem de alto rendimento para quantitativamente medida Caenorhabditis elegans expectativa de vida

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Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

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Pesquisando métodos de baixo custo para medir a expectativa de vida e a saúde em Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

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Mensuração da Viabilidade Embrionária e do Tamanho da Ninhada em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Análise da Herança Epigenética Transgeracional em C. elegans Usando um Fluorescente Reporter e Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...