Name: measuring caenorhabditis elegans sensitivity to the acetylcholine receptor agonist levamisole
Uploaded: 2022-06-07T14:00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole at JoVE.com

Agradecemos a Riya Dattani y Lauren Hogstrom, quienes recopilaron los datos en la Figura 2B, C ciego al genotipo en el Laboratorio de Genética Avanzada BISC413 (primavera de 2022) en la Universidad de Delaware. Información adicional sobre la experiencia de investigación de pregrado basada en el curso BISC413 (CURE), así como el acceso al manual de laboratorio diseñado por J. Tanis, está disponible a pedido. Las cepas de nematodos fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis , que cuenta con el apoyo del NIH-ORIP (P40 OD010440). Este trabajo fue apoyado por un P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (a J.E.T.).

1. Preparación de placas para el ensayo de levamisol
<ol><li>Preparar los medios del medio de crecimiento de nematodos (NGM) combinando 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona y 17 g de agar con 1 L de agua desionizada (DI) en un matraz con una barra de agitación.</li>
	<li>Después del autoclave, colocar el medio en una placa caliente ajustada a 70 °C y agitar a una velocidad moderada durante 1 h.</li>
	<li>Agregue 1 ml de 5 mg/ml de colesterol gota a gota para prevenir la precipitación, 1 ml de 1 M CaCl2, 1 ml de 1 M MgSO4 y 25 ml de 1 M pH 6.0 tampón fosfato de potasio a los medios.</li>
	<li>Transfiera 2 ml de medio NGM a cada pocillo de una placa de 24 pocillos con una pipeta serológica estéril (Figura 1).</li>
	<li>Deje que las placas se sequen en la mesa de trabajo durante 2 días antes de sembrar con bacterias. Para un almacenamiento a largo plazo, colóquelos a 4 °C.</li>
	<li>Rayar OP50 E. coli en una placa de caldo de lisogenia (LB) y crecer durante la noche a 37 °C.</li>
	<li>Recoger una sola colonia OP50 en caldo B (10 g de triptona y 5 g de NaCl en 1 L de DIH2O) y poner el cultivo agitando a 37 °C durante la noche.</li>
	<li>Usando una pipeta estéril, dejar caer 30 μL de suspensión OP50 sobre el agar en el centro de cada pocillo (Figura 1). NOTA: Asegúrese de no dañar la superficie del agar, ya que esto provocará la madriguera de gusanos.</li>
	<li>Deje que las placas reposen a temperatura ambiente durante al menos 2 días después de la siembra para permitir que se forme un césped bacteriano. NOTA: Si las bacterias en los pozos centrales no están secas después de 2 días, deje las placas abiertas en la campana durante 20 minutos (Figura 1). Las placas deben verterse y sembrarse con bacterias 1-2 semanas antes del ensayo.</li>
</ol>2. Sincronización de C. elegans (día 1)
<ol><li>Cultive C. elegans de tipo salvaje, unc-63 (x26), lev-10 (x17) y unc-49 (e407) hasta la edad adulta en placas de 6 cm, preparando al menos ocho placas por cepa. Confirme que hay muchos adultos grávidos no hambrientos en las placas. NOTA: Esto es el doble de placas que se necesitan; Sin embargo, es importante tener placas de respaldo en caso de que el primer lote de huevos se destruya durante el blanqueo.</li>
	<li>Haga 10x M9 tampón disolviendo 59.6 g de Na2 HPO 4 (dibásico), 29.9 g de KH 2 PO 4 (monobásico), 12.8 gde NaCly2.5g de MgSO 4 en 750 ml de agua DI con agitación. Una vez disuelto, llevar el volumen hasta 1 L y esterilizar el filtro. Diluir 1:10 y autoclave para hacer 1x M9 buffer. NOTA: El búfer 1x M9 se puede hacer con semanas o meses de anticipación.</li>
	<li>Prepare la solución blanqueadora debajo del capó el día de la sincronización. Mezcle 10 ml de lejía (tabla de materiales), 2.5 ml de NaOH 10 N y 37.5 ml de agua DI en un tubo cónico de 50 ml. Use gafas, guantes y una bata de laboratorio cuando trabaje con la solución blanqueadora.</li>
	<li>Usando una pipeta de transferencia de plástico, lave los gusanos adultos grávidos de al menos cuatro placas con 1x tampón M9 y transfiéralos a un tubo cónico de 15 ml.</li>
	<li>Girar a 716 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente y, a continuación, retirar el sobrenadante con una pipeta de transferencia.</li>
	<li>Añadir 10 ml de la solución blanqueadora. Invierta o agite suavemente el tubo durante ~ 4 minutos hasta que la mayoría, pero no todas, las canales de gusanos se hayan disuelto (Figura 1). NOTA: Tenga cuidado de no blanquear demasiado los gusanos, ya que esto destruirá los huevos. Ciertas mutaciones pueden aumentar la dificultad del aislamiento de óvulos.</li>
	<li>Girar a 716 x g durante 1 min.</li>
	<li>Vierta la solución de lejía en un solo movimiento; Mientras el tubo no se agite en este punto, los huevos se pegarán al costado del tubo.</li>
	<li>Agregue 15 ml de 1x tampón M9 e invierta. Girar a 716 x g durante 1 minuto y verter el búfer M9 con un movimiento suave.</li>
	<li>Realice tres lavados en total con 1x tampón M9, como se describe en el paso 2.9.</li>
	<li>Después del lavado final, agregue 10 ml de 1x M9 fresco y colóquelo en un rotador durante la noche a 15 ° C para aislar una población sincronizada de animales hambrientos en la etapa de primera larva (L1). NOTA: Antes de colocarlo en el rotador, verifique que haya huevos en el tampón M9. Si no, repita la preparación con placas de respaldo y lejía por un tiempo más corto.</li>
</ol>3. Enchapado sincronizado C. elegans (día 2)
<ol><li>Imprima un mapa de placas de 24 pocillos y asigne cepas a lugares aleatorios. Cada cepa debe estar representada en la placa de 24 pocillos al menos seis veces.</li>
	<li>Aproximadamente 24 h después de la preparación de lejía, gire los gusanos L1 hambrientos en tampón M9 a 716 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire ~ 9 ml de tampón M9 con una pipeta de transferencia de plástico, y luego mezcle suavemente los gusanos en etapa larvaria (L1) hambrientos en el tampón M9 restante.</li>
	<li>Pipetear inmediatamente 3 μL de los gusanos en M9 tampón en un portaobjetos de microscopio y determinar el número de L1s; el número deseado es de 20-30 L1s en 3 μL. Girar hacia abajo y quitar M9 si la concentración de gusanos es demasiado baja, y añadir M9 si la concentración es demasiado alta. NOTA: Compruebe el número de gusanos por 3 μL al menos 2x, invirtiendo el tubo cada vez.</li>
	<li>Pipet 3 μL de L1s (20-30 gusanos en total) en cada pocillo de acuerdo con el mapa de placas prefabricado (paso 3.1; Figura 1). NOTA: Invierta el tubo con los L1 en M9 con frecuencia para mantener una distribución uniforme de los gusanos, ya que se asentarán en el fondo. Si esto no se hace, algunos pozos tendrán muy pocos gusanos, mientras que otros tendrán demasiados. Además, no perfore el agar con la punta de la pipeta, ya que esto hará que los animales excaven.</li>
	<li>Deje que los gusanos crezcan hasta la edad adulta durante 3 días a 20 ° C. NOTA: El uso de diferentes temperaturas de crecimiento y ciertas mutaciones puede afectar la velocidad de maduración, así que asegúrese de considerar el ciclo de vida de C. elegans.</li>
</ol>4. Realización del ensayo de levamisol (día 5)
<ol><li>Imprima una hoja de datos en blanco, que se utilizará para registrar el número de gusanos que se mueven en cada pocillo cada 5 minutos durante 1 h. NOTA: Los estudiantes podrán contar los gusanos en un máximo de 12 pozos cada 5 minutos. Los 12 pozos principales se analizan en la primera hora, y los 12 pozos inferiores se analizan en la hora siguiente.</li>
	<li>Revise los gusanos en las placas de 24 pocillos. Usando un marcador, haga una "X" en la tapa de la placa sobre cualquier pozo que tenga contaminación, haya muerto de hambre o tenga demasiados gusanos (>40), lo que dificultará el conteo.</li>
	<li>Haga una solución de levamisol de 0,4 mM agregando 200 μL de material de levamisol de 100 mM a 50 ml de 1x M9. Preparar 100 mM de caldo de levamisol disolviendo 240,76 mg de clorhidrato de levamisol en 10 ml deH2Oy almacénelo a −20 °C. NOTA: Levamisol debe diluirse en M9; la dilución enH2Oacelera la parálisis. Los estudiantes deben usar guantes. La ingestión de altas concentraciones de levamisol es tóxica.</li>
	<li>Inicie un temporizador y luego, usando una pipeta de transferencia, agregue 1 ml de levamisol de 0.4 mM a los dos primeros pocillos, de modo que los animales naden libremente. Continúe agregando levamisol a los pozos adyacentes, escalonando el tiempo de acuerdo con el número de pozos a ensayar. NOTA: Por ejemplo, si se analizan 10 pozos, el levamisol se agregará de la siguiente manera: pozos 1 y 2 en el momento 0, pozos 3 y 4 después de 1 minuto, pozos 5 y 6 después de 2 minutos, pozos 7 y 8 después de 3 minutos, y pozos 9 y 10 después de 4 minutos.</li>
	<li>A los 5 minutos, comience a contar manualmente solo el número de gusanos en movimiento en cada pozo, comenzando con el primer pozo, y registre ese número en la hoja de datos (Figura 1). Se pueden usar contadores, pero no son necesarios para determinar con precisión el número de gusanos en movimiento. NOTA: Los estudiantes deben vigilar el temporizador, ya que a veces se retrasarán durante los primeros puntos de tiempo antes de que muchos gusanos se paralicen. El número de puntos de tiempo se puede ajustar, o se pueden analizar menos pozos en cada punto de tiempo si es necesario.</li>
	<li>Continúe contando el número de gusanos en movimiento en cada pocillo cada 5 minutos durante 1 h. NOTA: La inmersión en M9 induce un movimiento constante de natación en el transcurso de este ensayo de 1 h, lo que elimina la necesidad de pinchar los gusanos para evaluar la parálisis (Figura 2A). La exposición a 0,4 mM de solución de levamisol induce parálisis dependiente del tiempo como se observa al dejar de nadar; Los gusanos que paralizan no se recuperan.</li>
	<li>Repita los pasos 4.4.-4.6. para el resto de los pozos en el plato.</li>
	<li>Al final del ensayo, o cuando el tiempo lo permita, registre el número total de gusanos en cada pocillo.</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Obtenga el mapa de placas (paso 3.1.) y registre qué cepa corresponde a cada pocillo. NOTA: Debido a la cantidad de datos recopilados, el análisis y la discusión posteriores de los datos tomarán al menos un par de horas.</li>
	<li>Ingrese los datos en una hoja de cálculo, comenzando con el número total de gusanos en cada pozo y organizando por genotipo.</li>
	<li>Combinando los datos de los pozos, determine el número de gusanos que se mueven en cada punto de tiempo para cada cepa.</li>
	<li>Utilice estos datos para crear una "curva de supervivencia" en el software estadístico (Tabla de materiales) para mostrar visualmente la parálisis dependiente del tiempo de la población (Figura 2B).</li>
	<li>Haga una tabla de datos tal que la columna de la izquierda indique el tiempo y las columnas posteriores contengan los datos de cada cepa. Para cada animal que esté paralizado dentro de los primeros 5 minutos, cree una fila e ingrese un "1" durante 5 minutos. Repita esto para cada punto de tiempo. Para todos los animales que no se paralizan al final del ensayo, ingrese un "0" durante 60 minutos.</li>
	<li>Realice comparaciones por pares utilizando la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) en el software estadístico (Tabla de materiales) para determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa entre dos cepas diferentes.</li>
	<li>Para análisis adicionales/alternativos, en lugar de realizar el paso 5.3. y el paso 5.4., determinar el porcentaje de animales que se mueven en cada pocillo en cada punto de tiempo. Trazar el promedio con el error estándar en cada punto de tiempo para todas las cepas ensayadas usando un programa de hoja de cálculo o el software estadístico (Figura 2C).</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

La respuesta alterada al levamisol puede identificar los genes necesarios para la señalización colinérgica postsináptica y la función muscular. El protocolo aquí describe un ensayo de levamisol líquido utilizado para cuantificar la parálisis dependiente del tiempo durante un período de tiempo de 1 hora. Los estudiantes hacen predicciones sobre los efectos de ciertas mutaciones genéticas, llevan a cabo un experimento con un gran tamaño de muestra y luego cuantifican sus resultados. Este ensayo es una forma simple y eficiente de cuantificar la parálisis inducida por levamisol sin recoger o pinchar animales, lo que lo hace adecuado para laboratorios de pregrado, así como para investigadores que estudian la transmisión neuromuscular. Aquí se discuten algunos de los escollos más comunes, las limitaciones del ensayo y una variación del protocolo que permite su uso con animales de derribo de ARNi; También se discute aquí cómo este ensayo se puede integrar en una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos.
La preparación adecuada de las placas de 24 pocillos es esencial. Primero, los céspedes bacterianos deben estar completamente secos antes de detectar animales L1 en los pozos. Si no se seca lo suficiente, la bacteria se mezcla con la solución de levamisol durante el ensayo, volviendo el líquido turbio y evitando que las personas puedan contar los gusanos. En segundo lugar, al sincronizar los gusanos a través de la preparación de lejía, los animales no deben estar expuestos a la solución de lejía durante demasiado tiempo, ya que esto hará que la capa protectora de los huevos se desintegre. En tercer lugar, es crucial detectar solo 20-30 L1 por pozo, ya que demasiados gusanos en los pozos hacen que sea extremadamente difícil contar con precisión el número que se mueve en el tiempo asignado. Finalmente, es importante mantener una técnica aséptica durante la preparación de las placas, ya que los pozos contaminados no se pueden ensayar. 
Hay algunas limitaciones que deben considerarse al realizar este ensayo. Primero, contar el número de gusanos en movimiento en cada pozo cada 5 minutos puede ser abrumador para las personas que carecen de experiencia previa en laboratorio, y esto podría conducir a una recopilación de datos imprecisa. En cuanto a otros ensayos utilizados para determinar la sensibilidad a los medicamentos18,19, este experimento puede realizarse con menos puntos de tiempo. En segundo lugar, el recubrimiento de L1 hambrientos aislados de una preparación de lejía es un método fácil para obtener una población sincronizada; Sin embargo, se deben hacer ajustes si el tiempo de desarrollo difiere entre las cepas que se están analizando. Es posible recoger animales en fase larvaria tardía (L4) en una placa de 24 pocillos para este ensayo; Sin embargo, cuando se preparan muchos platos, esto requiere demasiado trabajo. Alternativamente, se debe determinar el tiempo que tarda cada cepa en alcanzar L4 y luego colocar las L1 en los pozos en diferentes momentos para ajustar las diferencias en la velocidad de maduración. Finalmente, si bien este ensayo puede usarse para identificar nuevos genes importantes para la función muscular postsináptica11, la respuesta alterada de levamisol también puede ser causada por mutación o knockdown de ARNi de genes presinápticos12. Si se observa una sensibilidad alterada al levamisol, se deben realizar experimentos adicionales para determinar la razón de este fenotipo.
Al hacer algunas modificaciones a las placas de 24 pocillos, el ensayo de natación de levamisol descrito también se puede realizar en animales de derribo de ARNi11. La eliminación del gen a través de RNAi se puede lograr alimentando bacterias C. elegans que expresan ARN bicatenario correspondiente al gen de interés20. Para la preparación de placas de RNAi, se debe agregar 1 mL de 1M IPTG y 1 mL de 25 mg/mL de carbenicilina por litro de medio después de retirarlo del autoclave. Los cultivos bacterianos se cultivan recogiendo una sola colonia en 3 ml de caldo LB más 3 μL de 25 mg / ml de carbenicillin, y agitando a 37 ° C durante la noche, y el mapa de placas se realiza cuando se detectan las diferentes bacterias en los pocillos. C. elegans se sincronizan mediante la preparación de lejía como se describe; sin embargo, se debe usar la cepa eri-1 hipersensible de ARNi (mg366) en lugar del tipo salvaje para aumentar la eliminación del gen. Las caídas de ARNi resultan en los mismos fenotipos de levamisol observados para los mutantes de pérdida de función11. 
El protocolo presentado aquí se puede utilizar en la investigación de laboratorio, como un experimento independiente en el laboratorio de pregrado, o en las primeras semanas de un curso avanzado de pregrado como una introducción a las técnicas básicas de C. elegans y la función neuromuscular. En un curso más avanzado basado en el descubrimiento, los estudiantes pueden usar este ensayo para determinar si la pérdida de C. elegans homólogos de genes mutados en individuos con síndromes miasténicos, distrofias musculares o miopatías alteran la sensibilidad al levamisol. En conclusión, este ensayo de sensibilidad de levamisol simple y económico proporciona un enfoque práctico para aprender sobre la señalización en el NMJ y adquirir experiencia trabajando con el sistema modelo de C. elegans.

La activación de los receptores de acetilcolina postsinápticos (AChR) en el músculo esquelético da como resultado una señal eléctrica que conduce a la contracción muscular. La alteración de la función neuromuscular resulta en síndromes miasténicos y distrofias musculares en humanos 1,2,3,4. El nematodo Caenorhabditis elegans se ha utilizado ampliamente para aprender sobre los procesos biológicos fundamentales conservados evolutivamente y los mecanismos de la enfermedad. Los músculos esqueléticos de los vertebrados y los músculos de la pared corporal de C. elegans son funcionalmente equivalentes en el control de la locomoción5. Aquí, se presenta un ensayo simple que se puede usar para comparar C. elegans de tipo salvaje con mutantes que han alterado la señalización neuromuscular o la función muscular.
Las entradas excitatorias e inhibitorias recibidas de las neuronas motoras colinérgicas y GABAérgicas, respectivamente, hacen que los músculos de un lado del cuerpo de C. elegans se contraigan mientras que los músculos del otro lado se relajan, lo que permite la locomoción coordinada6. El levamisol, un agente antihelmíntico utilizado para tratar infecciones parasitarias por nematodos, se une y activa constitutivamente una clase de AChR en los músculos de la pared del cuerpo, lo que resulta en parálisis dependiente del tiempo7. Así, la sensibilidad alterada al levamisol puede ser utilizada para identificar C. elegans con defectos en el equilibrio de la señalización excitatoria e inhibitoria 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Por ejemplo, las mutaciones en subunidades del AChR sensible al levamisol (L-AChR), como UNC-63, así como el homólogo de C. elegans de Cubilin, LEV-10, que se requiere para la agrupación de L-AChR en la sinapsis, impactan la señalización excitatoria y dan como resultado resistencia al levamisol 7,8. Las mutaciones en el receptor GABAA UNC-49 reducen la señalización inhibitoria y causan hipersensibilidad al levamisol12.
La hipersensibilidad o resistencia al levamisol se ha evaluado tradicionalmente transfiriendo animales a placas de agar que contienen levamisol y luego pinchando regularmente los gusanos para determinar el punto de tiempo en el que ocurre la parálisis13,14,15. Hemos desarrollado un ensayo de natación de levamisol líquido que elimina la necesidad de manipulación física de los animales y permite la detección de cientos de animales en solo 1 h. Aquí, se describe el uso de este ensayo con animales de tipo salvaje, unc-63 (x26), lev-10 (x17) y unc-49 (e407). Sin embargo, este protocolo también se puede realizar en C. elegans expuestos a ARNi, como se hizo para validar los derribos identificados en una pantalla de ARNi de todo el genoma para la sensibilidad alterada al levamisol11.
Para este ensayo farmacológico, los gusanos se cultivaron hasta la edad adulta en placas de 24 pocillos, se agregaron levamisol 0,4 mM en tampón M9 a cada pocillo, y el número de animales en movimiento se registró cada 5 min durante 1 h. La parálisis inducida por levamisol se observó visualmente a lo largo del tiempo, y después de la finalización del ensayo, se cuantificaron los datos. La evaluación de mutantes junto con C. elegans de tipo salvaje permite a los estudiantes hacer predicciones sobre posibles efectos fenotípicos y luego realizar experimentos para probar sus hipótesis. En conclusión, este ensayo de levamisol líquido simple y económico es una forma ideal de demostrar el impacto de la pérdida de genes específicos en la función de NMJ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes</td>
			<td>TriTech Research</td>
			<td>Cat #: T3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Bacto Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0140-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#:12-556-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>Cat#: 02101382-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eri-1(mg366)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>GR1373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Bacto Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: DF0123-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Statistical software)</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lev-10(x17)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>ZZ17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Splash Regular Bleach - 121oz - up &#38; up</td>
			<td>Target</td>
			<td>Search target.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 wild type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>Bristol N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide 10N</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unc-49(e407)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>CB407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unc-63(x26)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>ZZ26 </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring caenorhabditis elegans sensitivity to the acetylcholine receptor agonist levamisole

En la unión neuromuscular (NMJ), la unión del neurotransmisor excitatorio acetilcolina (ACh) a los receptores postsinápticos conduce a la contracción muscular. Al igual que en el músculo esquelético de los vertebrados, se requiere señalización colinérgica en los músculos de la pared corporal del organismo modelo Caenorhabditis elegans para la locomoción. La exposición al levamisol, un agonista farmacológico de una clase de receptores de ACh en los músculos de la pared del cuerpo, causa parálisis dependiente del tiempo de animales salvajes. La sensibilidad alterada al levamisol sugiere defectos en la señalización en la NMJ o en la función muscular. Aquí, se presenta un protocolo para un ensayo de levamisol líquido realizado en C. elegans cultivados en placas de 24 pocillos. La natación vigorosa de los animales en líquido permite la evaluación y cuantificación de la parálisis inducida por levamisol en cientos de gusanos durante un período de una hora sin requerir manipulación física. Este procedimiento se puede utilizar tanto con mutantes de tipo salvaje como con mutantes que tienen sensibilidad alterada al levamisol para demostrar las consecuencias funcionales de la señalización alterada en la NMJ.

La señalización a través de los receptores AChRs y GABA permite que los músculos de un lado del cuerpo de C. elegans se contraigan mientras que los músculos del otro lado se relajan, lo que permite la locomoción coordinada 6,16. La unión del levamisol a L-AChRs ionotrópico causa contracción, lo que lleva a la parálisis dependiente del tiempo de los animales salvajes. Aquí, evaluamos la sensibilidad del mutante de tipo salvaje, unc-63 L-AChR, lev-10 L-AChR mutante de agrupamiento y unc-49 GABAA receptor mutante C. elegans a levamisol. Las mutaciones en subunidades de L-AChR, así como en los genes necesarios para el tráfico de L-AChRs a la membrana plasmática muscular, la agrupación de L-AChR postsináptica y la señalización posterior de Ca 2+, causan resistencia a la parálisis inducida por levamisol 7,8,9,10,11,16,17, como se observa en los mutantes unc-63 y lev-10 (Figura2B ,C). La pérdida del canal iónico activado por GABA UNC-49 causó hipersensibilidad al levamisol (Figura 2B,C) debido a la interrupción del equilibrio adecuado de la señalización colinérgica y GABAérgica12. Cuando este ensayo fue realizado recientemente por estudiantes universitarios en un laboratorio de genética avanzada, el 100% de los estudiantes observaron resistencia al levamisol con los mutantes unc-63 y lev-10, mientras que el 88% observó hipersensibilidad al levamisol con el mutante unc-49. Estos datos recopilados con el ensayo de natación de levamisol líquido son consistentes con los fenotipos observados en los ensayos tradicionales de levamisol basados en placas 7,8,11,12,13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64056/64056fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de preparación e implementación del ensayo de levamisol. Se vierten placas NGM de 24 pocillos; 2 días después, OP50 Escherichia coli se siembra en los pozos. C. elegans se sincronizan a través de la preparación de lejía, y los animales en la primera etapa larvaria (L1) para cada cepa a ensayar (tipo salvaje, negro; UNC-63(X26), magenta; Lev-10(x17), verde; UNC-49 (E407), azul) se pipetean en los pozos de acuerdo con un mapa de placas predeterminado al día siguiente. Después de 3 días de crecimiento a 20 ºC, o cuando los animales alcanzan la edad adulta, se agrega levamisol 0,4 mM en tampón M9 a cada pocillo, y el número de animales en movimiento se cuenta cada 5 min durante 1 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64056/64056fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64056/64056fig02.jpg"> Figura 2: Parálisis inducida por levamisol en C. elegans mutantes de tipo salvaje y representativos. (A) La exposición a levamisol 0,4 mM causa parálisis dependiente del tiempo; esto no se observa para animales que nadan en 1x amortiguador M9 durante 1 h. (B) Parálisis dependiente del tiempo de animales de tipo salvaje (negro), UNC-63 (x26 ) (magenta), lev-10 (x17 ) (verde) y unc-49 (E407) (azul) en el ensayo de natación de levamisol. La pérdida de la subunidad L-AChR UNC-63 o la proteína de agrupamiento L-AChR LEV-10 resultó en resistencia al levamisol, y la pérdida del receptorGABA A UNC-49 causó hipersensibilidad al levamisol. n ≥ 50 por genotipo, p < 0,0001 para todos los mutantes en comparación con el tipo salvaje en este experimento representativo. (C) Utilizando los mismos datos que en el panel (B), se determinó el porcentaje de animales en movimiento en cada punto temporal (promedio de los porcentajes para cada pozo ± SE) para cada cepa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64056/64056fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

El presente protocolo describe un ensayo para determinar la respuesta al levamisol, un agonista farmacológico de una clase de receptores de acetilcolina de Caenorhabditis elegans . En este ensayo de natación de levamisol líquido, los investigadores observan visualmente y cuantifican la parálisis dependiente del tiempo de los animales cultivados en placas de 24 pocillos.

Medición de la sensibilidad de Caenorhabditis elegans al agonista del receptor de acetilcolina Levamisol

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Este protocolo permite a los investigadores observar cómo C-elgans responden al agonista del receptor de acetilcolina Levamisol. La sensibilidad alterada al levamisol puede sugerir defectos en la señalización de su unión neuromuscular o función muscular. Una ventaja importante es que la natación vigorosa de C-elgans en la solución de Levamisol permite a los investigadores cuantificar la parálisis dependiente del tiempo de cientos de gusanos en solo una hora.Contar el número de gusanos en cada pozo cada cinco minutos puede ser abrumador. El número de pozos ensayados o los puntos de tiempo se pueden ajustar si es necesario. Para comenzar, prepare los medios de crecimiento de nematodos combinando tres gramos de cloruro de sodio, 2,5 gramos de tono pep y 17 gramos de agar con un litro de agua desionizada en un matraz con una barra de agitación.Después del autoclave, coloque el medio en una placa caliente ajustada a 70 grados centígrados y revuelva a una velocidad moderada durante una hora. Agregue un mililitro de cinco miligramos por mililitro de colesterol gota a gota para evitar la precipitación. Un mililitro de un molar de cloruro de calcio, un mililitro de un molar de sulfato de magnesio y 25 mililitros de un molar de pH 6.0 tampón de fosfato de potasio a los medios.Transfiera dos mililitros de medios de crecimiento de nematodos a cada pocillo de una placa de 24 pocillos con una pipeta serológica estéril. Deje que las placas se sequen en la mesa de trabajo durante dos días antes de sentarse con bacterias. Elija una sola colonia op 50 en caldo B y establezca el cultivo temblando a 37 grados centígrados durante la noche.Con una pipeta estéril, deje caer 30 microlitros de suspensión OP50 sobre el agar en el centro de cada pocillo. Deje que las placas reposen a temperatura ambiente durante al menos dos días después de sentarse para permitir que se forme un césped bacteriano. Cultivar silvestre tipo unc-63 Lev10 y unc-49 C-elgan hasta la edad adulta en placas de seis centímetros, preparando al menos ocho placas por cepa.Prepare la solución blanqueadora debajo del capó el día de la sincronización. Mezcle 10 mililitros de lejía, 2.5 mililitros de hidróxido de sodio y 37.5 mililitros de agua desionizada en un tubo de crónica de 50 mililitros. Usando una pipeta de transferencia de plástico, lave los gusanos adultos grávidos de al menos cuatro placas con tampón M9 y transfiéralos a un tubo de crónica de 15 mililitros.Gire esos 716 g durante un minuto a temperatura ambiente y luego retire el súper nadante con una pipeta de transferencia. Agregue 10 mililitros de la solución blanqueadora. Agite suavemente el tubo durante cuatro minutos hasta que la mayoría, pero no todos los cadáveres de gusanos se hayan disuelto.Girar a 716 G durante un minuto. Vierta la solución de lejía en un solo movimiento. Mientras el tubo no se agite en este punto, los huevos se pegarán al costado del tubo a 15 mililitros de tampón M9 e invertirán.Girar a 716 G durante un minuto y verter el búfer M9 con un movimiento suave. Repita este lavado con solución tampón tres veces. Después del lavado final, agregue 10 mililitros de M9 fresco y colóquelo en un rotador durante la noche a 15 grados centígrados para aislar una población sincronizada de animales hambrientos en la primera etapa larvaria.Imprima en una placa de 24 pocillos y asigne cepas a lugares aleatorios. Aproximadamente 24 horas después de la preparación de lejía, gire hacia abajo los gusanos L1 hambrientos a 716 G durante un minuto a temperatura ambiente. Retire aproximadamente nueve mililitros de tampón M9 con una pipeta de transferencia de plástico, y luego mezcle suavemente los gusanos hambrientos de la primera etapa larvaria en el tampón M9 restante.Inmediatamente pipete tres microlitros de los gusanos y el tampón M9 en un portaobjetos de microscopio y determine el número de L1. El número deseado es de 20 a 30 L1 en tres microlitros. Pipetea tres microlitros de L1 en cada pocillo de acuerdo con el mapa de placas prefabricado, deja que los gusanos crezcan hasta la edad adulta durante tres días a 20 grados centígrados.Imprima la hoja de datos en blanco que se utilizará para registrar el número de gusanos que se mueven en cada pocillo cada cinco minutos durante una hora. Revise los gusanos en las placas de 24 pocillos. Usando un marcador, haga una X en la tapa de la placa sobre cualquier pozo que tenga contaminación, haya muerto de hambre o tenga demasiados gusanos, lo que dificultará el conteo.Haga una solución de levamisol de 0,4 milimolares agregando 200 microlitros de caldo de levamisol de 100 milimoles a 50 mililitros de M9. Inicie un temporizador y luego, con una pipeta de transferencia, agregue un mililitro de 0,4 milimolar de levamisol a los dos primeros pocillos, de modo que los animales naden libremente. Continúe agregando Levamisol a los pozos adyacentes, escalonando el tiempo de acuerdo con el número de pozos a ensayar. A los cinco minutos, comience a contar manualmente solo el número de gusanos en movimiento en cada pozo, comenzando con el primer pozo, y registre ese número en la hoja de datos.Continúe contando el número de gusanos en movimiento en cada pocillo cada cinco minutos durante una hora. Al final del ensayo o cuando el tiempo lo permita, registre el número total de gusanos en cada pocillo. Obtenga la placa, mapee y registre qué cepa corresponde a cada pocillo.Ingrese los datos en una hoja de cálculo comenzando con el número total de gusanos en cada pocillo y organizando por genotipo. Combinando los datos de los pozos, determine el número de gusanos que se mueven en cada punto de tiempo. Use esto para calcular el número que se paraliza en cada punto de tiempo.Haga una tabla de datos tal que la columna de la izquierda indique el tiempo y las columnas siguientes contengan los datos de cada cepa. Para cada animal que esté paralizado dentro de los primeros cinco minutos, cree una fila e ingrese una durante cinco minutos. Repita esto para cada punto de tiempo.Para todos los animales que no se paralizan al final del ensayo, introduzca un cero durante 60 minutos. Utilice estos datos para crear una curva de supervivencia en el software estadístico específico utilizado aquí para mostrar visualmente la parálisis dependiente del tiempo de la población. Los datos de todas las cepas ensayadas deben introducirse en la misma tabla de datos, dejando los espacios necesarios.Las mutaciones en las subunidades del receptor de acetilcolina de Levamisol, así como en los genes necesarios para la agrupación de receptores de acetilcolina sensibles a Levamisol postsinápticos, causan resistencia a la parálisis inducida por Levamisol como se observa en los mutantes unc-63 y Lev-10 respectivamente. La pérdida del canal iónico activado por GABA unc-49 causó hipersensibilidad al levamisol debido a la interrupción del equilibrio adecuado de la señalización colinérgica y GABAérgica. La preparación adecuada de 24 placas de pocillos es esencial.Si el césped bacteriano no está seco antes de detectar L1, la solución de Levamisol puede volverse turbia durante el ensayo, lo que inhibe la observación. Mediante la modificación de las placas de 24 pocillos, este protocolo se puede realizar con animales derribados con ARNi. Esto permite a los investigadores estudiar los genes de C-elgan, para los cuales los mutantes no están disponibles.

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Análisis de transcriptómica<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; ARN secuencia de datos a través de la suite smoking en el Proyecto Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Investigación

Genética

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

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El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Un método para el estudio del polimorfismo C924T del gen Receptor tromboxano A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

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Manipulación de ploidía en Caenorhabditis elegans

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The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

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El método de conjunto de réplica: Un enfoque de alto rendimiento para cuantitativamente medida Caenorhabditis elegans vida útil

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Medición de las tasas de mutación microbiana con el ensayo de fluctuación

Fluctuation assays are widely used for estimating mutation rates in microbes growing in liquid environments. Many cultures are each inoculated with a few ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

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Cultivo Y Ensayo De Las Poblaciones De Caenorhabditis elegans De Etapa Mixta A Gran Escala

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

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Encuesta de métodos de bajo costo para medir la esperanza de vida y la salud en Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

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Medición de la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Análisis de la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...