Name: use of bisection to reduce mitochondrial dna in the bovine oocyte
Uploaded: 2022-07-06T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Bisection to Reduce Mitochondrial DNA in the Bovine Oocyte at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke sine kolleger ved Utah State University, reproduktive vitenskapsforskere ved San Diego Zoo, og Dr. Rebecca Krisher ved Genus PLC.

Følgende protokoll følger retningslinjene for dyrepleie og etikk fra Utah State University.
1. Medieforberedelse
<ol><li>Før oocytthåndtering, klargjør du følgende løsninger, som beskrevet i tabell 1: 400 μL hyaluronidaseløsning, 500 μL T2-medier, 1020 μL T20-medier og 800 μL T10-medier.</li>
	<li>Del T10-mediet i to brønner på en firebrønns plate, 400 μL per brønn. Merk en brønn med "M" og den andre brønnen med "MR." Plasser i en 5% CO<su...

<ol>
	<li>Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer:+A+salvage+tool+seeking+first+aid.">Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid.</a> Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).</li><li>Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+cloned+Bactrian+camel+(camelus+bactrianus)+calf+produced+by+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer:+A+step+towards+preserving+the+critically+endangered+wild+Bactrian+camels.">First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels.</a> PLOS ONE. 12 (5), 0177800 (2017).</li><li>Oh, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+endangered+gray+wolves+(canis+lupus)+from+somatic+cells+collected+postmortem.">Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem.</a> Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).</li><li>Srirattana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+gaur-bovine+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer+embryos:+Effect+of+trichostatin+a+treatment.">Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment.</a> Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).</li><li>Kwon, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocysts+derived+from+adult+fibroblasts+of+a+rhesus+monkey+(macaca+mulatta)+using+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer.">Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer.</a> Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+cloned+sei+whale+(Balaenoptera+borealis)+embryos+by+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer+using+enucleated+pig+oocytes.">Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes.</a> Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285 (2009).</li><li>Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+interspecies+cloned+monkey+embryos+reconstructed+with+bovine+enucleated+oocytes.">Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes.</a> Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).</li><li>Hong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+canine+embryos+using+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer.">Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer.</a> Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+Implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+transmission+and+confounding+mitochondrial+influences+in+cloned+cattle+and+pigs.">Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs.</a> Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).</li><li>Lanza, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+an+endangered+species+(Bos+Gaurus)+using+interspecies+nuclear+transfer.">Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer.</a> Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).</li><li>Evans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+genotypes+in+nuclear+transfer-derived+cloned+sheep.">Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep.</a> Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).</li><li>Meirelles, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+replacement+of+the+mitochondrial+genotype+in+a+Bos+indicus+calf+reconstructed+by+nuclear+transfer+to+a+Bos+taurus+oocyte.">Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte.</a> Genetics. 158 (1), 351-356 (2001).</li><li>Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+nuclear+transfer:+Implications+for+embryonic+stem+cell+biology.">Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).</li><li>Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer:+advancements+and+problems.">Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems.</a> Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer+is+dependent+on+compatible+mitochondrial+DNA+and+reprogramming+factors.">Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors.</a> PLoS ONE. 6 (4), 14805 (2011).</li><li>Chiaratti, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+mitochondrial+DNA+depletion+is+reversed+during+early+embryogenesis+in+cattle.">Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).</li><li>Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+mitochondrial+DNA+replication+during+oocyte+maturation+is+essential+for+successful+porcine+embryonic+development.">Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development.</a> Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).</li><li>Cagnone, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+normal+embryogenesis+by+mitochondrial+supplementation+in+pig+oocytes+exhibiting+mitochondrial+DNA+deficiency.">Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).</li><li>Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+mitochondrial+DNA+replication+during+oocyte+maturation+is+essential+for+successful+porcine+embryonic+development.">Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development.</a> Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).</li><li>Ferreira, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+supplementation+with+mitochondria+improve+oocyte+competence?+A+systematic+review.">Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review.</a> Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).</li><li>Bhat, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+birth+of+a+pashmina+goat+kid+after+transfer+of+handmade+cloned+embryos.">Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos.</a> Journal of Reproduction and Development. , (2019).</li><li>Tecirlioglu, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+cloned+calf+derived+from+a+vitrified+hand-made+cloned+embryo.">Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo.</a> Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361 (2003).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handmade+cloned+transgenic+piglets+expressing+the+nematode+fat-1+gene.">Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene.</a> Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handmade+cloned+transgenic+sheep+rich+in+omega-3+fatty+acids.">Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids.</a> PLOS ONE. 8 (2), 55941 (2013).</li><li>Lagutina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+nuclear+transfer+in+horses:+Effect+of+oocyte+morphology,+embryo+reconstruction+method+and+donor+cell+type.">Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type.</a> Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).</li><li>Chiaratti, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+mitochondrial+DNA+depletion+is+reversed+during+early+embryogenesis+in+cattle.">Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).</li><li>Hosseini, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+efficient+method+of+manual+oocyte+enucleation+using+a+pulled+pasteur+pipette.">and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 49 (8), 569-575 (2013).</li><li>Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+proteins+F-actin+and+tubulin+distribution+and+interaction+with+mitochondria+in+the+granulosa+cells+surrounding+stage+III+zebrafish+(danio+rerio)+oocytes.">Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes.</a> Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).</li><li>International Union for Conservation of Nature. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IUCN+Red+List+of+Threatened+Species.">The IUCN Red List of Threatened Species.</a> International Union for Conservation of Nature. , (2021).</li><li>Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+deer+cloned+from+antler+stem+cells+and+their+differentiated+progeny.">Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny.</a> Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).</li><li>G&#243;mez, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+African+wildcat+cloned+kittens+born+from+domestic+cats.">Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats.</a> Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).</li><li>Lanza, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+an+endangered+species+(Bos+gaurus)+using+interspecies+nuclear+transfer.">Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer.</a> Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).</li></ol>

Metoder som tidligere ble brukt til å redusere mtDNA-kopinumre i oocytter, har sine respektive ulemper. Mikromanipuleringsbasert fjerning av mitokondrier fra oocytter reduserer mtDNA-kopieringsnumre med i gjennomsnitt 64%27. En unik metode, tidligere brukt til enukleasjon, innebærer bruk av pasteurpipetter med liten diameter og splitting av en zona pellucidafri oocytt ved grensen mellom en mikrodråpe medier og den omkringliggende mineraloljen. Sammen med utnyttelsen av oocytt sentrifugering kan...

Somatisk celle kjernefysisk overføring (SCNT) inkluderer sammensmelting av en enuklet oocytt fra ett dyr og en somatisk celle fra et dyr av samme art. I de fleste tilfeller stammer oocytten og somatisk celle fra samme art, og levende fødselsrater er under 6%1. Noe forskning innebærer bruk av interspecies SCNT (iSCNT), som inkluderer sammensmelting av en somatisk celle og oocytt som stammer fra to forskjellige arter. I disse studiene er levende fødselstall enda lavere enn i SCNT-vanligvis mindre enn 1%1. Imidlertid har iSCNT kapasitet til å brukes som en metode for å redde truede arter, siden somatiske celler fra disse dyrene er mer tilgjengelige enn deres bakterieceller1. Mottaker oocytter som brukes i iSCNT er ofte innenlandske eller vanlige laboratoriearter, for eksempel kyr, griser og mus. Noen forsøk så langt har lykkes med å produsere levende unge, selv om avkomene som produseres har vært intrageneriske dyr (mottaker oocyttarter og donorcellearter var medlemmer av samme slekt)2,3,4. Intergeneric modeller (som bruker en oocytt og somatisk celle fra dyr i forskjellige slekter) har ennå ikke produsert levende dyr, og flertallet av rekonstruerte embryoer arresterer på 8-16 cellestadiet av in vitro utvikling 5,6,7,8. En mulig forklaring på denne embryonale utviklingsstansen er forekomsten av mitokondrie heteroplasmy i embryoene - tilstedeværelsen av mer enn en mitokondrier DNA (mtDNA) type i en enkelt celle. Heteroplasmy kan føre til problemer som utviklingssvikt eller svikt i embryoet eller i det levende dyret1. Patogenese kan også forekomme senere i dyrets levetid9. Selv om dette problemet også er til stede i SCNT-avkom, forverrer den interspesifikke komponenten i iSCNT-embryoer problemet.
Når den embryonale mtDNA kommer fra to forskjellige arter, fungerer mottakeren oocytt mitokondrier, som representerer flertallet, ikke effektivt med donorcellens kjerne 1,10. Større taksonomiske hull mellom de to artene som brukes i iSCNT, intensiverer sannsynligvis dette problemet; intrageneriske levende avkom produsert (Bos gaurus og Bos indicus avkom ved hjelp av Bos taurus oocytter), samt avkom produsert via tradisjonell SCNT (f.eks Ovis aries avkom ved hjelp av Ovis aries oocytes) ble vist å være chimeras (mtDNA fra to personer var til stede i disse dyrene 11,12,13). Likevel utviklet de seg mye lenger enn de intergeneriske SCNT-embryoene14,15. Utvekslingen av informasjon mellom oocytt mitokondriene og donorcellens kjerne kan være mer vellykket i det intrageneriske embryoet enn i det intergeneriskeembryoet 16.
Mengden mtDNA i en moden storfe oocytt er ca. 100 ganger større enn mengden som finnes i en somatisk celle12. Å redusere dette forholdet kan oppmuntre de somatiske celle mitokondriene til å spre seg innenfor det rekonstruerte embryoet, slik at en større befolkning av produktive mitokondrier kan være til stede16. Dette kan igjen gi mer energi til å møte kravene til det utviklendeembryoet 15. Tidligere forsøk på å redusere mtDNA-kopinummeret til oocytten eller embryoet inkluderer kjemisk anvendelse, mikromanipulering og supplere oocytten eller embryoet med ytterligere mitokondrier fra donorcelleartene 16,17,18,19,20. Kjemisk anvendelse (for eksempel 2',3'-dideoxycytidine) er imidlertid ikke ideell for embryonal utvikling, og har redusert oocytt mtDNA kopitall med omtrent halvparten18. Tidligere oocytt mtDNA reduksjon ved mikromanipulering har bare fjernet et gjennomsnitt på 64% av oocyttens mtDNA17. Selv om tilskudd av donorcelle mitokondrier kan være et levedyktig alternativ, har bruken ennå ikke produsert et levende intergenerisk dyr i iSCNT-studiene21.
Bruk av biseksjon for å redusere oocytt mtDNA kopinummer er ennå ikke brukt i publiserte studier. Bisecting oocytter med den hensikt å fusjonere ooplastene med en somatisk celle er premisset for håndlaget kloning (HMC), som vanligvis bruker biseksjon som metode for å fjerne polarlegemet og metafaseplaten fra metafasen II (MII) oocytt. HMC har med hell produsert avkom i flere arter, inkludert geiter, storfe, griser, sauer og hester 22,23,24,25,26, men inkluderer vanligvis ikke et sentrifugeringstrinn før biseksjon. Integrering av høyhastighets sentrifugering av oocytten muliggjør isolering av mitokondrier (og derfor mtDNA) på en pol av oocytten, som deretter kan krysses ved hjelp av et mikroblad for å fjerne de mitokondri-tette fraksjonene. To mitokondrier-utarmede ooplaster kan deretter smeltes sammen med en somatisk celle, som det er tilfelle i HMC, for å danne et rekonstruert embryo som inneholder betydelig mindre mtDNA fra oocyttarter.
Spørsmålet vi prøver å svare på med denne protokollen er hvordan du kan redusere mtDNA i bovin oocytten for å produsere et levedyktig rekonstruert embryo som inneholder mindre heteroplasmatisk mtDNA. I denne protokollen ble oocytter sentrifugert og bisected. Ooplast og intakte oocytt mtDNA kopinumre ble beregnet for å bestemme effektiviteten av denne teknikken for å redusere bovint oocytes mtDNA kopinummer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Centrifuge</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>D1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtDNA Primer: Forward (12S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GGGCTACATTCTCTACACCAAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtDNA Primer: Reverse (12S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207300633</td>
			<td>Microblade for bisection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 3 - 96-Well 0.2-mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A28567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Search plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K0221</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoPlate</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TPi-SMZSSX</td>
			<td>Heating stage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of bisection to reduce mitochondrial dna in the bovine oocyte

Interspecies somatisk celle kjernefysisk overføring (iSCNT) kan brukes til å redde truede arter, men to forskjellige populasjoner av mitokondrie DNA (mtDNA) eksisterer innenfor det rekonstruerte embryoet: en i mottaker ooplasma og en i donor somatisk celle. Denne mitokondrie heteroplasmien kan føre til utviklingsproblemer i embryoet og fosteret. Håndlagde kloningsprotokoller inkluderer oocytt biseksjon, som kan brukes til å redusere mtDNA-kopinummeret, noe som reduserer graden av mitokondrie heteroplasmy i et rekonstruert embryo. Sentrifugering av denuded, modne storfe oocytter produserte en synlig mitokondri-tett brøkdel på en pol av oocytten. Oocytes' zonae pellucidae ble fjernet ved eksponering for en pronaseløsning. Biseksjon ble utført ved hjelp av et mikroblad for å fjerne den synlige mitokondrierfraksjonen. qPCR ble brukt til å kvantifisere mtDNA tilstede i DNA-prøver hentet fra hele oocytter og bisected ooplasts, noe som gir en sammenligning av mtDNA kopinumre før og etter biseksjon. Kopieringsnumre ble beregnet ved hjelp av syklusterskelverdier, en standardkurves regresjonslinjeformel og et forhold som inkluderte de respektive størrelsene på mtDNA PCR-produkter og genomiske PCR-produkter. En bovint oocytt hadde et gjennomsnittlig mtDNA-kopinummer (± standardavvik) på 137 904 ± 94 768 (n = 38). En mitokondri-utarmet ooplast hadde et gjennomsnittlig mtDNA kopinummer på 8 442 ± 13 806 (n = 33). Gjennomsnittlig mtDNA kopier til stede i en mitokondri-rik ooplast var 79,390 ± 58,526 mtDNA kopier (n = 28). Forskjellene mellom disse beregnede gjennomsnittene indikerer at sentrifugering og påfølgende biseksjon kan redusere mtDNA-kopinumrene som finnes i mitokondriene utarmet ooplast betydelig sammenlignet med den opprinnelige oocytten (P < 0,0001, bestemt av enveis ANOVA). Reduksjonen i mtDNA bør redusere graden av mitokondrie heteroplasmy i et rekonstruert embryo, muligens fremme standard embryonal og fosterutvikling. Tilskudd med mitokondrieekstrakt fra den somatiske donorcellen kan også være avgjørende for å oppnå vellykket embryonal utvikling.

Kvantitative PCR-resultater (qPCR) brukes til å bestemme de relative mengdene mtDNA som finnes i hver ooplast. Den beskrevne reaksjonen er designet for å forsterke 12S-regionen av bovin mtDNA.
Hvis biseksjonen var vellykket, vil prøvene fra hele oocytter og mitokondri-tette ooplaster ha lignende Ct-verdier . Prøvene fra mitokondriereduserende ooplaster vil ha høyere Ct-verdier sammenlignet med prøvene fra de to andre gruppene. En Ct-graf som viser vellykk...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Bisection to Reduce Mitochondrial DNA in the Bovine Oocyte at JoVE.com

Use of Bisection to Reduce Mitochondrial DNA in the Bovine Oocyte

Her presenterer vi en protokoll for å redusere mitokondrie-DNA-kopinumrene betydelig i en storfe oocytt (P < 0,0001). Denne metoden benytter sentrifugering og biseksjon for å redusere oocytt mitokondrier betydelig og kan gi økt sjanse for utvikling i de rekonstruerte interspecies somatiske celle kjernefysiske overføring embryoer.

Bruk av biseksjon for å redusere mitokondrie-DNA i Bovine Oocyte

Interspecies somatic cell nuclear transfer (iSCNT) may be used to rescue endangered species, but two distinct populations of mitochondrial DNA (mtDNA) ...

Protokollen reduserer mitokondrielt DNA-kopinummer i oocytten betydelig. Det kan være gunstig for kloning av intraarter. Denne metoden reduserer mitokondrie DNA-kopitall i storfe oocytter med over 90%, noe som kan redusere forekomsten av mitokondrie heteroplasmy i klonede embryoer.Laura Adams, en ph.d.-student fra laboratoriet mitt, vil demonstrere prosedyren. Til å begynne med, bruk en pipette, samle de valgte modne oocyttene fra HSOF-dråpen, og legg dem i 1,5 milliliterrøret som inneholder 50 mikroliter av HSOF CB-løsningen. Sentrifuger oocyttene ved 15 000 ganger G i 12 minutter.Mens oocyttene blir sentrifugert, forberede biseksjonsplaten. For dette, begynn med å lage et mønster på lokket på en 60 millimeter Petri-tallerken ved hjelp av 20 mikroliter per dråpe, og dekk dråpene fullt ut med mineralolje. Bruk en tynn tippet markør, merk linjene under parabolen.Dekk parabolen med et ugjennomsiktig lokk til sentrifugering er fullført for å forhindre osmolaritetsendringer av mikrodråper. Så snart sentrifugeringen er fullført, bruk en 200 mikroliterpipette for å samle oocyttene i løsningen, og flytt dem inn i en tom del av en ny søkeplate med fire 400 mikroliter HSOF-dråper, før du vasker oocyttene gjennom HSOF-dråper. Slå på varmetrinnet til 38,5 grader Celsius.Bruk en munnpipette til å flytte sentrifugede oocytter fra HSOF-dråpen til øverste venstre T2-dråpe av biseksjonsplaten. Vask deretter oocyttene gjennom de neste tre dråpene på øverste rad. Deponer oocyttene i en av pronasedråpene, og forsikrer at det er liten eller ingen kontakt mellom dem.Vær oppmerksom på oocyttene til det er klar deformasjon av zonae pellucidae. Når en enkelt oocytt zona pellucida har blitt deformert, flytt den oocytten til nabo-T2-dråpen. Gjenta etter hvert som flere oocytter blir deformert, til alle oocytter er fjernet fra pronasen og plassert i T2-dråpen.Vær oppmerksom på oocyttene til bare et tynt lag av zona pellucida forblir. Vask oocyttene gjennom de neste tre dråpene i raden, og deponer dem deretter i vertikale linjer i CBT20-dråpene. Begynn med færre oocytter i de loddrette linjene, og øk antallet oocytter per slipp etter hvert som biseksjonsferdighetene utvikler seg.Fokuser på den første CBT20-dråpen lengst til venstre som inneholder oocytter, og bruk en munnpipette til å rotere oocyttene slik at den mitokondri-tette delen av hver oocytt enten vender mot eller bort fra mikroskopets arm. Hvil spissen av mikrobladet til venstre for den øverste oocytten, i tråd med rommet rett over mitokondrienes tette del. Hold spissen av bladet på samme sted, senk forsiktig bladet for å kutte hele veien gjennom oocytten.Forsikre deg om at mitokondrie-tett ooplast og mitokondrier-redusert ooplast er av omtrent samme størrelse, og bladet krysser i det klareste segmentet av sentrifugert oocytt. Når du løfter bladet, må du sørge for at den samme linjen opprettholdes, og at spissen av bladet forblir på samme sted, og løft deretter spissen forsiktig fra platen. Gjenta biseksjonstrinn for alle oocytter innenfor det første biseksjonsfallet.Hvis oocytter er til stede i ekstra dråper, orienter og bisect de resterende oocytter. Bruk en munnpipette, samle mitokondrier-reduserte ooplaster fra den første biseksjonsdråpen. Plasser dem i venstre T20-dråpe plassert i den nederste raden av platen.Gjenta for alle gjenværende biseksjonsdråper. Bruk en munnpipette, samle mitokondrier tette ooplaster fra den første biseksjonsdråpen. Plasser dem i høyre T20-dråpe plassert i den nederste raden av platen.Gjenta for alle gjenværende biseksjonsdråper. Hent T10 firebrønnsfatet fra inkubatoren. Bruk en munnpipette, flytt alle mitokondrier-reduserte ooplaster til brønnen merket MR, og flytt mitokondri-tette ooplaster til brønnen merket M.Plasser firebrønnsplaten tilbake i den karbondioksidkontrollerte inkubatoren.La ooplaster hvile i minst 30 minutter før kvantifisering av mtDNA. For en vellykket biseksjon har prøvene fra hele oocytter og mitokondri-tette ooplaster lignende CT-verdier. Prøvene fra mitokondriereduserende ooplaster har høyere CT-verdier sammenlignet med prøvene fra de to andre gruppene.For en mislykket biseksjon reduserer ikke biseksjonen mtDNA-innholdet effektivt i mitokondrienes reduserte ooplaster. Etter produksjon av en standardkurve og bruk av de medfølgende mtDNA kopinummerformlene, er det oppnådd en gjennomsnittlig oocytt mtDNA-reduksjon på 93,88%ved hjelp av denne protokollen. Riktig orientering av hver oocytt i biseksjonsfallet, nøyaktig å krysse hver oocytt, og nøyaktig sortere ooplastene, er alle kritiske skritt å ta for å oppnå vellykkede resultater.To ooplaster kan smeltes sammen med en somatisk celle. De smeltede trillingene kan deretter aktiveres kjemisk og dyrkes som rekonstruerte embryoer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Produksjon og bruk av Lentivirus til Selektivt transduce Primær oligodendrocyte forløper celler for<em&gt; In Vitro</em&gt; myelination Analyser

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Bruk av Teton system for å studere molekylære mekanismer av Sebrafisk Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Funksjonell Cloning Ved hjelp av en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknikken til Target Mikroinjeksjon til utviklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Funksjonell Manipulering av mors Gene Products Bruke<em&gt; In Vitro</em&gt; Oocytmodningen i Sebrafisk

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC prikkblot-analyse Kvantifisering av DNA-metyleringsnivået av kondrocyt-diffusjon<em&gt; I Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Bruk av Immunolabeling å analysere stabil, dynamisk og gryende piskehale som henger i sebrafisk Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Bruk av RNAi og varme-sjokk-indusert transkripsjon faktor uttrykk å omprogrammere bakterie celler til nerveceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Bruk av blodkreft stamcelletransplantasjon å vurdere opprinnelsen til AML

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...