Name: preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination at JoVE.com

Vi takker Dr. Mario Borgnia fra cryo-EM-kernen ved National Institute of Environmental Health Sciences og Dr. Joshua Strauss fra University of North Carolina i Chapel Hill for deres mentorskab og træning i cryo-EM-gitterforberedelsen. Vi takker også Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende for teknisk assistance i de indledende faser af dette projekt. Vi sætter pris på det vigtige bidrag og støtte fra afdøde Dr. Samuel H. Wilson og hans laboratoriemedlemmer, især Dr. Rajendra Prasad og Dr. Joonas Jamsen til oprensning af det genetisk smeltede APE1-Polβ-kompleks. Forskning er blevet støttet af Intramural Research Program fra National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [bevillingsnumre Z01ES050158, Z01ES050159 og K99ES031662-01].

1. Saml nukleosomkernepartikler via saltgardientdialyse
BEMÆRK: Fremstillingen af nukleosomkernepartikler ved anvendelse af rekombinante histonproteiner til strukturelle undersøgelser er blevet udførligt beskrevet detaljeret af andre14,15,16. Efter oprensning af rekombinant X. laevis histoner og histon octamer samling beskrevet af andre14,15,</su...

<ol>
	<li>Ehrenhofer-Murray, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+at+DNA+replication,+transcription+and+repair.">Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.</a> European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).</li><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+mediated+interactions+in+the+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+1.9+a+resolution.">Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).</li><li>Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleosome+core+particle+containing+the+variant+histone+H2A.Z.">Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z.</a> Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).</li><li>Tachiwana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+centromeric+nucleosome+containing+CENP-A.">Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A.</a> Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).</li><li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+structure+and+function.">Nucleosome structure and function.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+acetylation+of+histone+H3+decreases+polymerase+beta+activity+on+nucleosome+core+particles+in+vitro.">Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+DNA+damage+in+chromatin:+Preparing+the+chromatin+landscape+for+base+excision+repair.">Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair.</a> DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+lysine+56+acetylation+enhances+AP+endonuclease+1-mediated+repair+of+AP+sites+in+nucleosome+core+particles.">Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles.</a> Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).</li><li>Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unencumbered+Pol+beta+lyase+activity+in+nucleosome+core+particles.">Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).</li><li>Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+location+of+DNA+lesions+in+nucleosome+core+particles+determines+accessibility+by+base+excision+repair+enzymes.">The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).</li><li>Olmon, E. D., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ability+of+five+DNA+glycosylases+to+recognize+and+repair+damage+on+nucleosomal+DNA.">Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA.</a> ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).</li><li>Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement+for+base+excision+repair+in+chromatin.">Rules of engagement for base excision repair in chromatin.</a> Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nucleosome+core+particle+from+recombinant+histones.">Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones.</a> Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).</li><li>McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+crystallization,+and+structure+determination+of+chromatin+enzyme/nucleosome+complexes.">Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes.</a> Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).</li><li>Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA+oligos+by+denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(PAGE).">Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).</a> Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).</li><li>Burgess, R. R. D., Murray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Protein Purification. 463, (2009).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+to+a+homo-oligomeric+scaffold+allows+cryo-EM+analysis+of+a+small+protein.">Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein.</a> Scientific Reports. 6, 30909 (2016).</li><li>Wu, X., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+determination+of+small+proteins+by+nanobody-binding+scaffolds+(Legobodies).">Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies).</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM.">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).</li><li>Takizawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+nucleosome+containing+the+ALB1+enhancer+DNA+sequence.">Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence.</a> Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).</li><li>Anderson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+recognition+of+ubiquitylated+nucleosome+by+Dot1L+methyltransferase.">Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase.</a> Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).</li></ol>

En specifik protokol til rensning af DNA-reparationsfaktoren vil være afhængig af enzymet af interesse. Der er dog nogle generelle anbefalinger, herunder anvendelse af rekombinante metoder til proteinekspression og oprensning18; hvis proteinet af interesse er for lille (<50 kDa), havde strukturbestemmelse ved kryo-EM været næsten umulig indtil for nylig ved brug af fusionssystemer19, nanobody-bindende stilladser20 og optimering af billeddannelses...

Eukaryot DNA er organiseret og komprimeret af histonproteiner, der danner kromatin. Nukleosomkernepartiklen (NCP) udgør den grundlæggende gentagne enhed af kromatin, der regulerer tilgængeligheden til DNA-bindende proteiner til DNA-reparation, transkription og replikation1. Selvom den første røntgenkrystalstruktur af NCP først blev løst for mere end to årtier siden2, og mange flere strukturer i NCP er blevet offentliggjort siden 3,4,5,6, er DNA-reparationsmekanismer i nukleosomale substrater endnu ikke blevet afgrænset. Afdækning af de molekylære detaljer, der ligger til grund for DNA-reparation i kromatin, vil kræve strukturel karakterisering af de deltagende komponenter for at forstå, hvordan lokale strukturelle træk ved NCP regulerer DNA-reparationsaktiviteter. Dette er især vigtigt i forbindelse med baseexcisionsreparation (BER), da biokemiske undersøgelser med BER-enzymer tyder på unikke DNA-reparationsmekanismer i nukleosomer, der er afhængige af enzymspecifikke strukturelle krav til katalyse og DNA-læsionens strukturelle position i nukleosomet 7,8,9,10,11,12,13 . Da BER er en vital DNA-reparationsproces, er der stor interesse for at udfylde disse huller, samtidig med at der etableres et udgangspunkt, hvorfra andre teknisk gennemførlige strukturelle undersøgelser, der involverer relevante nukleosomale komplekser, kan udføres.
Cryo-EM er hurtigt ved at blive den foretrukne metode til løsning af den tredimensionelle (3D) struktur af komplekser, hvis storskala forberedelse af homogen prøve er udfordrende. Selvom design og oprensning af NCP'er kompleksbundet med en DNA-reparationsfaktor (NCP-DRF) sandsynligvis vil kræve skræddersyet optimering, giver proceduren, der præsenteres her for at generere og fryse et stabilt NCP-DRF-kompleks, detaljer om, hvordan man optimerer prøven og kryo-EM-gitterforberedelsen. To arbejdsprocesser (udelukker ikke hinanden) vist i figur 1 og de specifikke detaljer i protokollen identificerer kritiske trin og giver strategier til optimering af disse trin. Dette arbejde vil drive kromatin- og DNA-reparationsfeltet i en retning, hvor komplementaritet med biokemiske med strukturelle undersøgelser bliver teknisk muligt for bedre at forstå de molekylære mekanismer for nukleosomal DNA-reparation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES; pH 7.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>043398.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>491 prep cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1702926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z717185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoGrid Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EM GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1000 touch thermocycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-clips and rings</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>6640--6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>SCT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15370752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Tweezers</td>
			<td>Techni-Pro</td>
			<td>758TW0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA</td>
			<td>Integrated DNA techonologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEI Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>KRIOSG4TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC purification system</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector Model 2110</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Boxes</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>PB-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Storage Accessory Pack</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>GSAX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Ethane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic two-head pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6695BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (VWR) Low Retention</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solution (37.5:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4338-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PURX35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified recombinant DNA repair factor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant histone octamer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring clipping tools</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column 10/300</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Talos Arctica 200 kV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15514011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mark IV System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter paper (55 mM)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1005-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>440700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination

DNA-reparation i forbindelse med kromatin er dårligt forstået. Biokemiske undersøgelser ved hjælp af nukleosomkernepartikler, den grundlæggende gentagne enhed af kromatin, viser, at de fleste DNA-reparationsenzymer fjerner DNA-skader med reducerede hastigheder sammenlignet med frit DNA. De molekylære detaljer om, hvordan base excision repair (BER) enzymer genkender og fjerner DNA-skader i nukleosomer, er ikke blevet belyst. Biokemiske BER-data for nukleosomale substrater antyder imidlertid, at nukleosomet præsenterer forskellige strukturelle barrierer afhængigt af placeringen af DNA-læsionen og enzymet. Dette indikerer, at de mekanismer, der anvendes af disse enzymer til at fjerne DNA-skader i frit DNA, kan være forskellige fra dem, der anvendes i nukleosomer. I betragtning af at størstedelen af genomisk DNA samles i nukleosomer, er der behov for strukturel information om disse komplekser. Hidtil mangler det videnskabelige samfund detaljerede protokoller til at udføre teknisk gennemførlige strukturelle undersøgelser af disse komplekser. Her giver vi to metoder til at forberede et kompleks af to genetisk smeltede BER-enzymer (Polymerase β og AP Endonuclease1) bundet til et enkeltnukleotidgab nær nukleosomets indgang-udgang til kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) strukturbestemmelse. Begge metoder til prøveforberedelse er kompatible til forglasning af kvalitetsgitre via dybfrysning. Denne protokol kan bruges som udgangspunkt til at forberede andre nukleosomale komplekser med forskellige BER-faktorer, pionertranskriptionsfaktorer og kromatinmodificerende enzymer.

Korrekt monterede NCP'er (figur 2) blev brugt til at fremstille et kompleks med et rekombinant fusionsprotein af MBP-Polβ-APE1 (figur 3). For at bestemme forholdet mellem NCP og MBP-Polβ-APE1 for at danne et stabilt kompleks udførte vi elektroforetiske mobilitetsskiftassays (EMSA) (figur 4), som viste et enkeltforskudt bånd af NCP med 5 gange molært overskud af MBP-Polβ-APE1. Under optimeringen af at gøre dette kompleks var t...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination at JoVE.com

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Denne protokol beskriver detaljeret fremstillingen af nukleosomale komplekser ved anvendelse af to metoder til prøveforberedelse til frysning af TEM-gitter.

Fremstilling af nukleosomkernepartikler kompleksbundet med DNA-reparationsfaktorer til kryo-elektronmikroskopi strukturbestemmelse

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Strukturelle oplysninger om, hvordan baseexcisionsreparationsenzymer fjerner DNA-læsioner i forbindelse med kromatin, har været knappe. Dette udgør et betydeligt hul i vores forståelse af de mekanismer, der er involveret i ætiologi af menneskelige sygdomme. Den største fordel ved vores protokol er, at vi har optimeret prøveforberedelse ved hjælp af standard laboratorieudstyr.Dette vil gøre det muligt for andre biokemikere i marken at supplere deres biokemiske arbejde med teknisk gennemførlige cryo-EM-studier. Vores protokol kan desuden bruges til at undersøge, hvordan andre faktorer, herunder pionertranskriptionsfaktorer, engagerer nukleosomet. Dette er et område, hvor strukturelle oplysninger også har været begrænsede.Optimering af prøveforberedelsen, før vi gik videre til fryseforholdene, var nøglen til at flytte vores projekt fremad, og dette gøres bedst med standard biokemiske assays i substratdesign, binding og tværbindingsbetingelser. Til at begynde med inkuberes NCP og DNA-reparationsfaktoren af interesse på is i 15 minutter ved hjælp af en optimal buffer for det specifikke kompleks. Derefter tilsættes glutaraldehyd til en endelig koncentration på 0,005%Efter blanding godt, inkuberes ved stuetemperatur i 13 minutter.Sluk med en molær Tris-CL til en slutkoncentration på 20 millimolær Tris-CL med pH 7,5. Derefter koncentreres til ca. 50 mikroliter og udskiftes bufferen med frysebuffer ved hjælp af en afsaltningskolonne. Derefter bestemmes absorbanserne ved optisk densitet 280 og 260 nanometer og koncentreres yderligere, hvis det er nødvendigt for at nå 1,3 til 3 milligram pr. milliliter baseret på optisk densitet 280 nanometer.Efter klargøring af dialyseknappen anbringes knappen med prøven oven på et polyethylenglycolleje med membranen nedad. For at udføre rensningen ved størrelsesekskluderingskromatografi vaskes og afbalanceres en størrelsesudelukkelseskolonne med 60 ml destilleret vand efterfulgt af 80 ml frysebuffer natten over med en hastighed på 0,4 ml pr. Minut. Derefter analyseres straks topfraktionerne og koncentreres de fraktioner, der indeholder histonens infusionsprotein MBP-PolBeta-APE1.Demonstrere følgende procedurer vil være Elizabeth Viverette, en post-baccalaureat-praktikant fra cryo-EM-kernen her i NIH. Når du har tændt for dykfryseren og fyldt luftfugteren med 50 ml destilleret vand, skal du indstille kammertemperaturen til 22 grader Celsius og fugtigheden til 98%Anbring derefter ethankoppen og flydende nitrogenkoppen i de respektive pladsholdere. Dæk derefter ethankoppen med ethanlågdispenseren og hæld forsigtigt flydende nitrogen over den, mens du også fylder nitrogenkoppen med flydende nitrogen.Når det flydende nitrogenniveau er stabiliseret og når 100%og temperaturen når minus 180 grader Celsius, skal du forsigtigt åbne ethanventilen og fylde ethankoppen, indtil den danner en boble på det klare låg. Fjern derefter ethandispenseren. Anbring to filterpapirer på blottingenheden, og fastgør dem med en metalring.Gå til opsætningen og indstil blottingparametrene som beskrevet i manuskriptet, vælg derefter A-Plunge og klik på OK. På hovedskærmen skal du klikke på Load Tang og indlæse dem med et gitter med kulstofapplikationssiden vendt mod venstre. Kalibrer tangen, juster Z-aksen for at sikre en solid plet. Klik på Nedre kammer og påfør tre mikroliter af komplekset.Klik derefter på Blot A-Plunge, som vil rotere gitteret for at blotte forfra og vil dykke - fryse det. Efter overførsel opbevares gitteret i gitterboksen i kammeret med flydende nitrogen. Når alle fire riste er frosset og anbragt i gitterboksen, drejes låget til neutral position, hvor alle gitterene er dækket af låget, og skruen strammes.Før prøverne lægges i mikroskopet, skal du placere de forglasede gitter på en ring og fastgøre den ved hjælp af en C-klips under flydende nitrogen i et fugtighedskontrolleret rum for at undgå isforurening. Når du lægger mikroskopet, skal du indsætte gitterene i en 12-slot kassette. Bland kassetten i en nanocab-kapsel, og læg den i autoloaderen.Overfør derefter gitteret fra kassetten til mikroskoptrinnet. Juster scenen til eucentrisk højde ved at svinge scenen 10 grader og samtidig flytte Z-højden, indtil der observeres minimal plan forskydning i billederne. Når den eucentriske højde er nået, skal du starte billeddannelsen ved at tage et montagebillede på 3 x 3 af gitteret, hvor hver montage tages med 62x forstørrelse for at opnå atlasset.Efter at have valgt tre firkanter i forskellige størrelser og taget den eucentriske højde, billede ved 210x forstørrelse. Når en firkant er afbildet, skal du vælge et hul hver fra kanten, midten og imellem inden for firkanterne. Billede derefter hvert hul ved 2.600x forstørrelse.Tag billedet med høj forstørrelse fra midten af hullet ved 36.000x forstørrelse og ved 7,1 sekunders eksponeringstid, 60 billeder, 1,18 pixelstørrelse og tre mikrometer defokusering. Se repræsentative billeder af screening. For at bestemme forholdet mellem NCP og MBP-PolBeta-APE1 til dannelse af stabilt kompleks blev elektroforetiske mobilitetsskiftassays udført, hvilket viste et enkeltforskudt bånd af NCP med fem gange molært overskud af MBP-PolBeta-APE1.I mindre volumen viste samlingen af komplekset af NCP-PolBeta-APE1, at prøven var alt for tværbundet og resulterede i aggregater uden mærkbare individuelle komplekser. Ti gange fortynding i NCP'er resulterede imidlertid i signifikant reduceret aggregering og forbedret partikelstabilitet. De præparative gel- og størrelseseksklusionsmetoder kan kombineres, hvor præparativ gel forbedrer kvaliteten af NCP'erne, når de indeholder en betydelig mængde aggregater med høj molekylvægt, efterfulgt af rensning af komplekset via størrelsesudelukkelse.Resultaterne viser, at begge metoder kan bruges uafhængigt til at generere stabile komplekser. Endvidere viser data indsamlet fra begge gitre næsten identiske todimensionelle klasser og tredimensionelle kort med ca. 3,2-angstrom-opløsning. Et optimalt forhold mellem NCP og DNA-reparationsfaktor bør først bestemmes, derefter skal tværbinding af komplekset med glutaraldehyd udføres mindst 10 gange mere fortyndet end den koncentration, der er nødvendig til frysning.Efter at have opnået et cryo-EM 3D-kort over komplekset, vil der være behov for yderligere strukturel forfining for at bestemme, hvordan DNA-reparationsfaktoren findes og identificere, hvilke regioner der er vigtige for disse interaktioner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Proteinekspression og -oprensning af menneskelige Lipid-følsomme kation kanal TRPC3 for Strukturbestemmelse af enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Hurtig bestemmelse af antistof-antigen affinitet ved massefotometri

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Hurtig gitterforberedelse til tidstilslutt kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Forberedelse af prøvestøttefilm i transmissionselektronmikroskopi ved hjælp af en støtteflådsblok

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og kryo-FIB mikromaskiner af Saccharomyces cerevisiae til Kryo-Elektron Tomografi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmission ElektronMikroskopiGitre til direkte cellepositionering i hele celle kryo-elektrontomografi arbejdsprocesser

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Ekstraktion af modificerede mikrotubuli fra pattedyrceller til undersøgelse af mikrotubuli-proteinkomplekser ved kryo-elektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Belægning af CryoEM-gitre med monolagsgrafen for at forbedre forberedelsen af kryoprøver

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Forfatter Spotlight: Forbedring af CryoEM-prøveforberedelse ved hjælp af grafenmonolag på mikroskopigitre 

Anvendelse af monolagsgrafen på kryo-elektronmikroskopigitter til strukturbestemmelse med høj opløsning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...