Name: preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination at JoVE.com

We bedanken Dr. Mario Borgnia van de cryo-EM-kern van het National Institute of Environmental Health Sciences en Dr. Joshua Strauss van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill voor hun mentorschap en training in de cryo-EM-netwerkvoorbereiding. We danken ook Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende voor de technische assistentie in de beginfase van dit project. We waarderen de belangrijke bijdrage en steun van wijlen Dr. Samuel H. Wilson en zijn laboratoriumleden, in het bijzonder Dr. Rajendra Prasad en Dr. Joonas Jamsen voor de zuivering van het genetisch gefuseerde APE1-Polβ-complex. Onderzoek is ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van de National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [subsidienummers Z01ES050158, Z01ES050159 en K99ES031662-01].

1. Assembleer nucleosoomkerndeeltjes via zout-gariëntdialyse
OPMERKING: De bereiding van nucleosoomkerndeeltjes met behulp van recombinante histoneiwitten voor structurele studies is uitgebreid in detail beschreven door anderen14,15,16. Volg de zuivering van recombinant X. laevis histonen en histon octameer assemblage beschreven door anderen14,15,<...

<ol>
	<li>Ehrenhofer-Murray, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+at+DNA+replication,+transcription+and+repair.">Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.</a> European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).</li><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+mediated+interactions+in+the+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+1.9+a+resolution.">Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).</li><li>Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleosome+core+particle+containing+the+variant+histone+H2A.Z.">Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z.</a> Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).</li><li>Tachiwana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+centromeric+nucleosome+containing+CENP-A.">Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A.</a> Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).</li><li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+structure+and+function.">Nucleosome structure and function.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+acetylation+of+histone+H3+decreases+polymerase+beta+activity+on+nucleosome+core+particles+in+vitro.">Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+DNA+damage+in+chromatin:+Preparing+the+chromatin+landscape+for+base+excision+repair.">Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair.</a> DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+lysine+56+acetylation+enhances+AP+endonuclease+1-mediated+repair+of+AP+sites+in+nucleosome+core+particles.">Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles.</a> Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).</li><li>Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unencumbered+Pol+beta+lyase+activity+in+nucleosome+core+particles.">Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).</li><li>Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+location+of+DNA+lesions+in+nucleosome+core+particles+determines+accessibility+by+base+excision+repair+enzymes.">The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).</li><li>Olmon, E. D., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ability+of+five+DNA+glycosylases+to+recognize+and+repair+damage+on+nucleosomal+DNA.">Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA.</a> ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).</li><li>Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement+for+base+excision+repair+in+chromatin.">Rules of engagement for base excision repair in chromatin.</a> Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nucleosome+core+particle+from+recombinant+histones.">Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones.</a> Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).</li><li>McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+crystallization,+and+structure+determination+of+chromatin+enzyme/nucleosome+complexes.">Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes.</a> Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).</li><li>Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA+oligos+by+denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(PAGE).">Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).</a> Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).</li><li>Burgess, R. R. D., Murray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Protein Purification. 463, (2009).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+to+a+homo-oligomeric+scaffold+allows+cryo-EM+analysis+of+a+small+protein.">Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein.</a> Scientific Reports. 6, 30909 (2016).</li><li>Wu, X., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+determination+of+small+proteins+by+nanobody-binding+scaffolds+(Legobodies).">Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies).</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM.">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).</li><li>Takizawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+nucleosome+containing+the+ALB1+enhancer+DNA+sequence.">Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence.</a> Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).</li><li>Anderson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+recognition+of+ubiquitylated+nucleosome+by+Dot1L+methyltransferase.">Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase.</a> Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).</li></ol>

Een specifiek protocol voor het zuiveren van de DNA-reparatiefactor zal afhankelijk zijn van het enzym van belang. Er zijn echter enkele algemene aanbevelingen, waaronder het gebruik van recombinante methoden voor eiwitexpressie en -zuivering18; als het eiwit van belang te klein is (<50 kDa), was structuurbepaling door cryo-EM tot voor kort bijna onmogelijk door het gebruik van fusiesystemen19, nanobody-bindende steigers20 en het optimaliseren van be...

Eukaryote DNA wordt georganiseerd en verdicht door histoneiwitten, die chromatine vormen. Het nucleosoomkerndeeltje (NCP) vormt de fundamentele herhalende eenheid van chromatine die de toegankelijkheid tot DNA-bindende eiwitten reguleert voor DNA-reparatie, transcriptie en replicatie1. Hoewel de eerste röntgenkristalstructuur van het NCP meer dan twee decennia geleden voor het eerst werd opgelost2 en er sinds 3,4,5,6 nog veel meer structuren van het NCP zijn gepubliceerd, zijn DNA-reparatiemechanismen in nucleosomale substraten nog niet afgebakend. Het blootleggen van de moleculaire details die ten grondslag liggen aan DNA-reparatie in chromatine vereist structurele karakterisering van de deelnemende componenten om te begrijpen hoe lokale structurele kenmerken van het NCP DNA-reparatieactiviteiten reguleren. Dit is met name belangrijk in de context van base-excisieherstel (BER), aangezien biochemische studies met BER-enzymen unieke DNA-reparatiemechanismen in nucleosomen suggereren die afhankelijk zijn van enzymspecifieke structurele vereisten voor katalyse en de structurele positie van de DNA-laesie binnen het nucleosoom 7,8,9,10,11,12,13 . Aangezien BER een essentieel DNA-reparatieproces is, is er veel belangstelling om deze lacunes op te vullen en tegelijkertijd een startpunt vast te stellen van waaruit andere technisch haalbare structurele studies met relevante nucleosomale complexen kunnen worden uitgevoerd.
Cryo-EM wordt snel de voorkeursmethode voor het oplossen van de driedimensionale (3D) structuur van complexen waarvan de grootschalige voorbereiding van homogene monsters een uitdaging is. Hoewel het ontwerp en de zuivering van NCP's gecomplexeerd met een DNA-reparatiefactor (NCP-DRF) waarschijnlijk op maat gemaakte optimalisatie vereist, biedt de hier gepresenteerde procedure om een stabiel NCP-DRF-complex te genereren en te bevriezen details over hoe het monster en de cryo-EM-netwerkvoorbereiding kunnen worden geoptimaliseerd. Twee workflows (die elkaar niet uitsluiten) in figuur 1 en de specifieke details in het protocol identificeren kritieke stappen en bieden strategieën voor het optimaliseren van deze stappen. Dit werk zal het chromatine- en DNA-reparatieveld voortstuwen in een richting waarin het aanvullen van biochemische met structurele studies technisch haalbaar wordt om de moleculaire mechanismen van nucleosomaal DNA-herstel beter te begrijpen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES; pH 7.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>043398.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>491 prep cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1702926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z717185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoGrid Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EM GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1000 touch thermocycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-clips and rings</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>6640--6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>SCT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15370752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Tweezers</td>
			<td>Techni-Pro</td>
			<td>758TW0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA</td>
			<td>Integrated DNA techonologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEI Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>KRIOSG4TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC purification system</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector Model 2110</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Boxes</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>PB-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Storage Accessory Pack</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>GSAX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Ethane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic two-head pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6695BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (VWR) Low Retention</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solution (37.5:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4338-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PURX35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified recombinant DNA repair factor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant histone octamer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring clipping tools</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column 10/300</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Talos Arctica 200 kV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15514011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mark IV System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter paper (55 mM)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1005-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>440700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination

DNA-reparatie in de context van chromatine is slecht begrepen. Biochemische studies met nucleosoomkerndeeltjes, de fundamentele herhalende eenheid van chromatine, tonen aan dat de meeste DNA-reparatie-enzymen DNA-schade verwijderen met verminderde snelheden in vergelijking met vrij DNA. De moleculaire details over hoe base excision repair (BER) enzymen DNA-schade in nucleosomen herkennen en verwijderen, zijn niet opgehelderd. Biochemische BER-gegevens van nucleosomale substraten suggereren echter dat het nucleosoom verschillende structurele barrières vertoont, afhankelijk van de locatie van de DNA-laesie en het enzym. Dit geeft aan dat de mechanismen die door deze enzymen worden gebruikt om DNA-schade in vrij DNA te verwijderen, anders kunnen zijn dan die welke in nucleosomen worden gebruikt. Aangezien het grootste deel van het genomische DNA is geassembleerd tot nucleosomen, is structurele informatie van deze complexen nodig. Tot op heden ontbreekt het de wetenschappelijke gemeenschap aan gedetailleerde protocollen om technisch haalbare structurele studies van deze complexen uit te voeren. Hier bieden we twee methoden om een complex van twee genetisch gefuseerde BER-enzymen (Polymerase β en AP Endonuclease1) te bereiden die gebonden zijn aan een single-nucleotide-gap nabij de entry-exit van het nucleosoom voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) structurele bepaling. Beide methoden voor monstervoorbereiding zijn compatibel voor het vitrificeren van kwaliteitsroosters via ondervriezen. Dit protocol kan worden gebruikt als uitgangspunt om andere nucleosomale complexen te bereiden met verschillende BER-factoren, pioniertranscriptiefactoren en chromatine-modificerende enzymen.

Goed geassembleerde NCP's (figuur 2) werden gebruikt om een complex te maken met een recombinant fusie-eiwit van MBP-Polβ-APE1 (figuur 3). Om de verhouding van NCP tot MBP-Polβ-APE1 te bepalen om een stabiel complex te vormen, voerden we elektroforetische mobiliteitsverschuivingstests (EMSA) uit (figuur 4), die een afzonderlijk verschoven band van de NCP toonden met 5-voudige molaire overmaat van MBP-Polβ-APE1. Tijdens de optimal...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination at JoVE.com

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Dit protocol schetst in detail de voorbereiding van nucleosomale complexen met behulp van twee methoden voor monstervoorbereiding voor het bevriezen van TEM-roosters.

Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Structurele informatie over hoe base-excisieherstelenzymen DNA-laesies verwijderen in de context van chromatine is schaars. Dit vormt een belangrijke leemte in ons begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij de etiologie van menselijke ziekten. Het grote voordeel van ons protocol is dat we de monstervoorbereiding hebben geoptimaliseerd met behulp van standaard laboratoriumapparatuur.Dit zal andere biochemici in het veld in staat stellen om hun biochemische werk aan te vullen met technisch haalbare cryo-EM-studies. Ons protocol kan bovendien worden gebruikt om te onderzoeken hoe andere factoren, waaronder pioniertranscriptiefactoren, het nucleosoom beïnvloeden. Dit is een gebied waar de structurele informatie ook beperkt is geweest.Het optimaliseren van de monstervoorbereiding voordat we naar de vriesomstandigheden gingen, was de sleutel tot vooruitgang in ons project, en dit kan het beste worden gedaan met standaard biochemische testen in substraatontwerp, binding en cross-linking omstandigheden. Om te beginnen, incuber de NCP en de DNA-reparatiefactor van belang op ijs gedurende 15 minuten met behulp van een optimale buffer voor het specifieke complex. Voeg vervolgens glutaaraldehyde toe tot een eindconcentratie van 0,005%Na het goed mengen, incubeer gedurende 13 minuten bij kamertemperatuur.Blus met één kies Tris-CL tot een eindconcentratie van 20 millimolaire Tris-CL met pH 7,5. Concentreer je vervolgens tot ongeveer 50 microliter en vervang de buffer met vriesbuffer met behulp van een ontzoutingskolom. Bepaal vervolgens de absorpties bij optische dichtheid 280 en 260 nanometer en concentreer verder indien nodig om 1,3 tot 3 milligram per milliliter te bereiken op basis van optische dichtheid 280 nanometer.Nadat u de dialyseknop hebt voorbereid, plaatst u de knop met het monster op een polyethyleenglycolbed met het membraan naar beneden gericht. Om de zuivering door grootte-uitsluitingschromatografie uit te voeren, wast en balanceert u een grootte-uitsluitingskolom met 60 milliliter gedestilleerd water, gevolgd door 80 milliliter vriesbuffer 's nachts met een snelheid van 0,4 milliliter per minuut. Analyseer vervolgens onmiddellijk de piekfracties en concentreer die fracties die het infusie-eiwit MBP-PolBeta-APE1 van de histon bevatten.Elizabeth Viverette, een post-baccalaureaatsstagiair uit de cryo-EM-kern hier in NIH, demonstreert de volgende procedures. Nadat u de dompelvriezer hebt ingeschakeld en de luchtbevochtiger hebt gevuld met 50 milliliter gedestilleerd water, stelt u de kamertemperatuur in op 22 graden Celsius en de luchtvochtigheid op 98% Plaats vervolgens de ethaanbeker en de beker met vloeibare stikstof in de respectieve ruimtehouders. Bedek daarna de ethaanbeker met de ethaandekseldispenser en giet er voorzichtig vloeibare stikstof overheen terwijl u ook de stikstofbeker vult met vloeibare stikstof.Wanneer het vloeibare stikstofgehalte is gestabiliseerd en 100% bereikt en de temperatuur min 180 graden Celsius bereikt, opent u voorzichtig de ethaanklep en vult u de ethaanbeker totdat deze een bel vormt op het heldere deksel. Verwijder vervolgens de ethaandispenser. Plaats twee filterpapieren op de opberginrichting en zet ze vast met een metalen ring.Ga naar de setup en stel de blottingparameters in zoals beschreven in het manuscript, selecteer vervolgens A-Plunge en klik op OK. Klik in het hoofdscherm op Load Forceps en laad ze met een raster met de koolstoftoepassingszijde naar links gericht. Kalibreer de tang en pas de Z-as aan om een stevige vlek te garanderen. Klik op Tweede Kamer en breng drie microliter van het complex aan.Klik vervolgens op Blot A-Plunge, die het rooster zal draaien om van voren te vegen en het zal bevriezen. Bewaar het rooster na het overbrengen in de roosterdoos in de vloeibare stikstofkamer. Wanneer alle vier de roosters zijn bevroren en in de roosterdoos zijn geplaatst, draait u het deksel naar de neutrale positie waar alle roosters door het deksel worden bedekt en draait u de schroef vast.Voordat u de monsters in de microscoop laadt, plaatst u de verglaasde roosters op een ring en zet u deze vast met een C-clip onder vloeibare stikstof in een vochtige ruimte om ijsverontreiniging te voorkomen. Plaats bij het laden van de microscoop de roosters in een cassette met 12 sleuven. Schud de cassette in een nanocab-capsule en laad deze in de autoloader.Breng vervolgens het raster over van de cassette naar het microscoopstadium. Stel het podium in op eucentrische hoogte door het podium 10 graden te wiebelen en tegelijkertijd de Z-hoogte te verplaatsen totdat minimale planaire verschuiving in de afbeeldingen wordt waargenomen. Zodra de eucentrische hoogte is bereikt, begint u met het maken van een montageafbeelding van 3 bij 3 van het raster waarin elke montage wordt genomen met een vergroting van 62x om de atlas te verkrijgen.Na het kiezen van drie vierkanten van verschillende grootte en het nemen van de eucentrische hoogte, beeld met 210x vergroting. Zodra een vierkant is afgebeeld, kiest u elk een gat van de rand, het midden en daartussen binnen de vierkanten. Stel vervolgens elk gat voor met een vergroting van 2.600x.Neem het beeld met hoge vergroting vanuit het midden van het gat bij een vergroting van 36.000x en bij een belichtingstijd van 7,1 seconden, 60 frames, een pixelgrootte van 1,18 pixels en onscherpte van drie micrometer. Zie representatieve beelden van de screening. Om de verhouding van NCP tot MBP-PolBeta-APE1 te bepalen om een stabiel complex te vormen, werden elektroforetische mobiliteitsverschuivingstests uitgevoerd, die een afzonderlijk verschoven band van de NCP toonden met vijfvoudige molaire overmaat van MBP-PolBeta-APE1.In een kleiner volume toonde de assemblage van het complex van NCP-PolBeta-APE1 aan dat het monster te verknoopt was en resulteerde in aggregaten zonder waarneembare individuele complexen. Tienvoudige verdunning in NCP's resulteerde echter in aanzienlijk verminderde aggregatie en verbeterde deeltjesstabiliteit. De preparatieve gel- en grootte-uitsluitingsmethoden kunnen worden gecombineerd waarbij preparatieve gel de kwaliteit van de NCP's verbetert wanneer ze een aanzienlijke hoeveelheid aggregaten met een hoog molecuulgewicht bevatten, gevolgd door de zuivering van het complex via grootte-uitsluiting.De resultaten laten zien dat beide methoden onafhankelijk van elkaar kunnen worden gebruikt om stabiele complexen te genereren. Verder tonen de gegevens die van beide rasters zijn verzameld bijna identieke tweedimensionale klassen en driedimensionale kaarten met een resolutie van ongeveer 3,2 angstrom. Eerst moet een optimale verhouding tussen NCP en DNA-reparatiefactor worden bepaald, waarna het complex met glutaaraldehyde moet worden verbroken bij ten minste 10 keer meer verdund dan de concentratie die nodig is voor bevriezing.Na het verkrijgen van een cryo-EM 3D-kaart van het complex, zal verdere structurele verfijning nodig zijn om te bepalen hoe de DNA-reparatiefactor wordt gevonden en te identificeren welke regio's belangrijk zijn voor deze interacties.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snelle rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste cryo-elektronenmicroscopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Voorbereiding van sample support films in transmissie elektronenmicroscopie met behulp van een support floatation block

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Het extraheren van gemodificeerde microtubuli uit zoogdiercellen om microtubuli-eiwitcomplexen te bestuderen door cryo-elektronenmicroscopie

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

CryoEM-roosters coaten met monolaag grafeen om de voorbereiding van cryomonsters te verbeteren

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Auteur in de schijnwerpers: Verbetering van de voorbereiding van CryoEM-monsters met behulp van grafeenmonolaag op microscopieroosters 

Toepassing van monolaag grafeen op cryo-elektronenmicroscopieroosters voor structuurbepaling met hoge resolutie

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...