Name: preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00
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Ringraziamo il Dr. Mario Borgnia del nucleo crio-EM presso il National Institute of Environmental Health Sciences e il Dr. Joshua Strauss dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill per il loro tutoraggio e formazione nella preparazione della griglia crio-EM. Ringraziamo anche la Dott.ssa Juliana Mello Da Fonseca Rezende per l'assistenza tecnica nelle fasi iniziali di questo progetto. Apprezziamo il contributo chiave e il supporto del defunto Dr. Samuel H. Wilson e dei suoi membri del laboratorio, in particolare il Dr. Rajendra Prasad e il Dr. Joonas Jamsen per la purificazione del complesso APE1-Polβ geneticamente fuso. La ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [numeri di sovvenzione Z01ES050158, Z01ES050159 e K99ES031662-01].

1. Assemblare le particelle del nucleo del nucleosoma tramite dialisi salina
NOTA: La preparazione di particelle nucleosomiche utilizzando proteine istoniche ricombinanti per studi strutturali è stata ampiamente descritta in dettaglio da altri14,15,16. Seguire la purificazione degli istoni ricombinanti di X. laevis e dell'assemblaggio di ottameri istonici descritti da altri<su...

<ol>
	<li>Ehrenhofer-Murray, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+at+DNA+replication,+transcription+and+repair.">Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.</a> European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).</li><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+mediated+interactions+in+the+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+1.9+a+resolution.">Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).</li><li>Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleosome+core+particle+containing+the+variant+histone+H2A.Z.">Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z.</a> Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).</li><li>Tachiwana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+centromeric+nucleosome+containing+CENP-A.">Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A.</a> Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).</li><li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+structure+and+function.">Nucleosome structure and function.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+acetylation+of+histone+H3+decreases+polymerase+beta+activity+on+nucleosome+core+particles+in+vitro.">Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+DNA+damage+in+chromatin:+Preparing+the+chromatin+landscape+for+base+excision+repair.">Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair.</a> DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+lysine+56+acetylation+enhances+AP+endonuclease+1-mediated+repair+of+AP+sites+in+nucleosome+core+particles.">Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles.</a> Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).</li><li>Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unencumbered+Pol+beta+lyase+activity+in+nucleosome+core+particles.">Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).</li><li>Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+location+of+DNA+lesions+in+nucleosome+core+particles+determines+accessibility+by+base+excision+repair+enzymes.">The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).</li><li>Olmon, E. D., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ability+of+five+DNA+glycosylases+to+recognize+and+repair+damage+on+nucleosomal+DNA.">Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA.</a> ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).</li><li>Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement+for+base+excision+repair+in+chromatin.">Rules of engagement for base excision repair in chromatin.</a> Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nucleosome+core+particle+from+recombinant+histones.">Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones.</a> Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).</li><li>McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+crystallization,+and+structure+determination+of+chromatin+enzyme/nucleosome+complexes.">Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes.</a> Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).</li><li>Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA+oligos+by+denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(PAGE).">Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).</a> Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).</li><li>Burgess, R. R. D., Murray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Protein Purification. 463, (2009).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+to+a+homo-oligomeric+scaffold+allows+cryo-EM+analysis+of+a+small+protein.">Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein.</a> Scientific Reports. 6, 30909 (2016).</li><li>Wu, X., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+determination+of+small+proteins+by+nanobody-binding+scaffolds+(Legobodies).">Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies).</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM.">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).</li><li>Takizawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+nucleosome+containing+the+ALB1+enhancer+DNA+sequence.">Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence.</a> Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).</li><li>Anderson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+recognition+of+ubiquitylated+nucleosome+by+Dot1L+methyltransferase.">Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase.</a> Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).</li></ol>

Un protocollo specifico per purificare il fattore di riparazione del DNA dipenderà dall'enzima di interesse. Tuttavia, ci sono alcune raccomandazioni generali, tra cui l'uso di metodi ricombinanti per l'espressione e la purificazione delle proteine18; se la proteina di interesse è troppo piccola (<50 kDa), la determinazione della struttura da parte della crio-EM era stata quasi impossibile fino a tempi più recenti attraverso l'uso di sistemi di fusione19, scaffold legant...

Il DNA eucariotico è organizzato e compattato dalle proteine istoniche, formando la cromatina. La particella nucleosomica (NCP) costituisce l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina che regola l'accessibilità alle proteine leganti il DNA per la riparazione, la trascrizione e la replicazione del DNA1. Sebbene la prima struttura cristallina a raggi X del PCN sia stata risolta per la prima volta più di due decenni fa2 e molte altre strutture del PCN siano state pubblicate da 3,4,5,6, i meccanismi di riparazione del DNA nei substrati nucleosomiali non sono ancora stati delineati. Scoprire i dettagli molecolari alla base della riparazione del DNA nella cromatina richiederà la caratterizzazione strutturale dei componenti partecipanti per comprendere come le caratteristiche strutturali locali del PCN regolano le attività di riparazione del DNA. Ciò è particolarmente importante nel contesto della riparazione per escissione di base (BER), dato che gli studi biochimici con enzimi BER suggeriscono meccanismi unici di riparazione del DNA nei nucleosomi che dipendono dai requisiti strutturali enzimatici specifici per la catalisi e dalla posizione strutturale della lesione del DNA all'interno del nucleosoma 7,8,9,10,11,12,13 . Dato che il BER è un processo vitale di riparazione del DNA, vi è un notevole interesse a colmare queste lacune, stabilendo al contempo un punto di partenza da cui possono essere condotti altri studi strutturali tecnicamente fattibili che coinvolgono complessi nucleosomiali rilevanti.
Cryo-EM sta rapidamente diventando il metodo di scelta per risolvere la struttura tridimensionale (3D) di complessi la cui preparazione su larga scala di campioni omogenei è impegnativa. Sebbene la progettazione e la purificazione di NCP complessati con un fattore di riparazione del DNA (NCP-DRF) richiedano probabilmente un'ottimizzazione su misura, la procedura qui presentata per generare e congelare un complesso NCP-DRF stabile fornisce dettagli su come ottimizzare il campione e la preparazione della griglia crio-EM. Due flussi di lavoro (non mutuamente esclusivi) illustrati nella Figura 1 e i dettagli specifici nel protocollo identificano i passaggi critici e forniscono strategie per l'ottimizzazione di tali passaggi. Questo lavoro spingerà il campo della cromatina e della riparazione del DNA in una direzione in cui l'integrazione degli studi biochimici con quelli strutturali diventa tecnicamente fattibile per comprendere meglio i meccanismi molecolari della riparazione nucleosomica del DNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES; pH 7.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>043398.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>491 prep cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1702926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z717185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoGrid Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EM GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1000 touch thermocycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-clips and rings</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>6640--6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>SCT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15370752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Tweezers</td>
			<td>Techni-Pro</td>
			<td>758TW0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA</td>
			<td>Integrated DNA techonologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEI Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>KRIOSG4TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC purification system</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector Model 2110</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Boxes</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>PB-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Storage Accessory Pack</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>GSAX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Ethane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic two-head pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6695BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (VWR) Low Retention</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solution (37.5:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4338-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PURX35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified recombinant DNA repair factor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant histone octamer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring clipping tools</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column 10/300</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Talos Arctica 200 kV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15514011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mark IV System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter paper (55 mM)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1005-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>440700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination

La riparazione del DNA nel contesto della cromatina è poco conosciuta. Studi biochimici che utilizzano particelle nucleosomiche del nucleosoma, l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina, mostrano che la maggior parte degli enzimi di riparazione del DNA rimuove il danno al DNA a tassi ridotti rispetto al DNA libero. I dettagli molecolari su come gli enzimi di riparazione dell'escissione di base (BER) riconoscono e rimuovono il danno al DNA nei nucleosomi non sono stati chiariti. Tuttavia, i dati biochimici BER dei substrati nucleosomiali suggeriscono che il nucleosoma presenta diverse barriere strutturali a seconda della posizione della lesione del DNA e dell'enzima. Ciò indica che i meccanismi impiegati da questi enzimi per rimuovere il danno al DNA nel DNA libero possono essere diversi da quelli impiegati nei nucleosomi. Dato che la maggior parte del DNA genomico è assemblato in nucleosomi, sono necessarie informazioni strutturali di questi complessi. Ad oggi, la comunità scientifica manca di protocolli dettagliati per eseguire studi strutturali tecnicamente fattibili di questi complessi. Qui, forniamo due metodi per preparare un complesso di due enzimi BER geneticamente fusi (polimerasi β e AP Endonucleasi1) legati a un gap a singolo nucleotide vicino all'entrata-uscita del nucleosoma per la determinazione strutturale della crio-microscopia elettronica (crio-EM). Entrambi i metodi di preparazione del campione sono compatibili per la vetrificazione di griglie di qualità tramite congelamento a tuffo. Questo protocollo può essere utilizzato come punto di partenza per preparare altri complessi nucleosomiali con diversi fattori BER, fattori di trascrizione pionieristici ed enzimi modificanti la cromatina.

NCP correttamente assemblati (Figura 2) sono stati utilizzati per creare un complesso con una proteina di fusione ricombinante di MBP-Polβ-APE1 (Figura 3). Per determinare il rapporto tra NCP e MBP-Polβ-APE1 per formare un complesso stabile, abbiamo eseguito saggi di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) (Figura 4), che hanno mostrato una banda spostata singolarmente del NCP con un eccesso molare di 5 volte di MBP-Pol...

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Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Questo protocollo delinea in dettaglio la preparazione di complessi nucleosomiali utilizzando due metodi di preparazione del campione per il congelamento delle griglie TEM.

Preparazione di particelle nucleosomiche complessate con fattori di riparazione del DNA per la determinazione strutturale della microscopia crioelettronica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Le informazioni strutturali su come gli enzimi di riparazione dell'escissione di base rimuovono le lesioni del DNA nel contesto della cromatina sono state scarse. Ciò costituisce una lacuna significativa nella nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nell'eziologia delle malattie umane. Il vantaggio principale del nostro protocollo è che abbiamo ottimizzato la preparazione dei campioni utilizzando attrezzature di laboratorio standard.Ciò consentirà ad altri biochimici del settore di integrare il loro lavoro biochimico con studi crio-EM tecnicamente fattibili. Il nostro protocollo può inoltre essere utilizzato per studiare come altri fattori, inclusi i fattori di trascrizione pionieristici, coinvolgono il nucleosoma. Si tratta di un settore in cui anche le informazioni strutturali sono state limitate.L'ottimizzazione della preparazione del campione prima di passare alle condizioni di congelamento è stata la chiave per far avanzare il nostro progetto, e questo è meglio farlo con saggi biochimici standard nella progettazione del substrato, nel legame e nelle condizioni di reticolazione. Per iniziare, incubare l'NCP e il fattore di riparazione del DNA di interesse sul ghiaccio per 15 minuti utilizzando un tampone ottimale per il complesso specifico. Quindi, aggiungere glutaraldeide a una concentrazione finale dello 0,005%Dopo aver mescolato bene, incubare a temperatura ambiente per 13 minuti.Quench con un molare Tris-CL ad una concentrazione finale di 20 millimolari Tris-CL con pH 7,5. Quindi, concentrare a circa 50 microlitri e sostituire il tampone con tampone di congelamento utilizzando una colonna di dissalazione. Successivamente, determinare le assorbanze a densità ottica 280 e 260 nanometri e concentrarsi ulteriormente, se necessario, per raggiungere da 1,3 a 3 milligrammi per millilitro in base alla densità ottica 280 nanometri.Dopo aver preparato il pulsante di dialisi, posizionare il pulsante contenente il campione sopra un letto di glicole polietilenico con la membrana rivolta verso il basso. Per eseguire la purificazione mediante cromatografia di esclusione dimensionale, lavare ed equilibrare una colonna di esclusione dimensionale con 60 millilitri di acqua distillata, seguita da 80 millilitri di tampone di congelamento durante la notte ad una velocità di 0,4 millilitri al minuto. Quindi, analizzare immediatamente le frazioni di picco e concentrare quelle contenenti la proteina di infusione dell'istone MBP-PolBeta-APE1.A dimostrare le seguenti procedure sarà Elizabeth Viverette, una tirocinante post-diploma di maturità dal nucleo crio-EM qui in NIH. Dopo aver acceso il congelatore e riempito l'umidificatore con 50 millilitri di acqua distillata, impostare la temperatura della camera a 22 gradi Celsius e l'umidità al 98%Quindi posizionare la tazza di etano e la tazza di azoto liquido nei rispettivi supporti spaziali. Successivamente, coprire la tazza di etano con il distributore del coperchio di etano e versare con attenzione azoto liquido su di essa mentre si riempie anche la tazza di azoto con azoto liquido.Quando il livello di azoto liquido si è stabilizzato e raggiunge il 100% e la temperatura raggiunge meno 180 gradi Celsius, aprire con attenzione la valvola dell'etano e riempire la tazza di etano fino a formare una bolla sul coperchio trasparente. Quindi rimuovere il distributore di etano. Posizionare due carte da filtro sul dispositivo assorbente e fissarle con un anello metallico.Vai al setup e imposta i parametri di blotting come descritto nel manoscritto, quindi seleziona A-Plunge e fai clic su OK. Nella schermata principale, fai clic su Carica pinze e caricale con una griglia con il lato dell'applicazione del carbonio rivolto verso sinistra. Calibrare la pinza, regolando l'asse Z per garantire una macchia solida. Fare clic su Camera inferiore e applicare tre microlitri del complesso.Quindi fare clic su Blot A-Plunge, che ruoterà la griglia per macchiarla dalla parte anteriore e la congelerà. Dopo il trasferimento, conservare la griglia nella scatola della griglia nella camera di azoto liquido. Quando tutte e quattro le griglie sono state congelate e posizionate nella scatola della griglia, ruotare il coperchio in posizione neutra in cui tutte le griglie sono coperte dal coperchio e serrare la vite.Prima di caricare i campioni nel microscopio, posizionare le griglie vetrificate su un anello e fissarlo utilizzando una clip a C sotto azoto liquido in una stanza con umidità controllata per evitare la contaminazione da ghiaccio. Quando si carica il microscopio, inserire le griglie in una cassetta a 12 slot. Mescolare la cassetta in una capsula nanocab e caricarla nel caricatore automatico.Quindi, trasferire la griglia dalla cassetta allo stadio del microscopio. Regolare lo stadio all'altezza eucentrica oscillando lo stadio di 10 gradi e contemporaneamente spostando l'altezza Z fino a quando non si osserva uno spostamento planare minimo nelle immagini. Una volta raggiunta l'altezza eucentrica, inizia a scattare l'immagine scattando un'immagine di montaggio 3 per 3 della griglia in cui ogni montaggio viene effettuato con un ingrandimento di 62x per ottenere l'atlante.Dopo aver scelto tre quadrati di varie dimensioni e aver preso l'altezza eucentrica, immagine con ingrandimento 210x. Una volta creata l'immagine di un quadrato, scegliete un foro ciascuno dal bordo, dal centro e tra i quadrati. Quindi, immagina ogni foro con un ingrandimento di 2.600x.Prendi l'immagine ad alto ingrandimento dal centro del foro con un ingrandimento di 36.000x e un tempo di esposizione di 7,1 secondi, 60 fotogrammi, dimensioni di 1,18 pixel e sfocatura di tre micrometri. Vedi immagini rappresentative dello screening. Per determinare il rapporto tra NCP e MBP-PolBeta-APE1 per formare un complesso stabile, sono stati eseguiti saggi di spostamento della mobilità elettroforetica, che hanno mostrato una banda singolarmente spostata del NCP con un eccesso molare di cinque volte di MBP-PolBeta-APE1.In volumi più piccoli, l'assemblaggio del complesso di NCP-PolBeta-APE1 ha dimostrato che il campione era eccessivamente reticolato e risultava in aggregati senza complessi individuali distinguibili. Tuttavia, la diluizione di dieci volte negli NCP ha comportato una significativa riduzione dell'aggregazione e una migliore stabilità delle particelle. I metodi di esclusione del gel preparativo e delle dimensioni possono essere combinati quando il gel preparativo migliora la qualità dei PCN quando contengono una quantità significativa di aggregati ad alto peso molecolare, seguiti dalla purificazione del complesso tramite esclusione dimensionale.I risultati mostrano che entrambi i metodi possono essere utilizzati indipendentemente per generare complessi stabili. Inoltre, i dati raccolti da entrambe le griglie mostrano classi bidimensionali quasi identiche e mappe tridimensionali con una risoluzione di circa 3,2 angstrom. Un rapporto ottimale tra NCP e fattore di riparazione del DNA dovrebbe essere determinato prima, quindi la reticolazione del complesso con glutaraldeide deve essere eseguita almeno 10 volte più diluita della concentrazione necessaria per il congelamento.Dopo aver ottenuto una mappa 3D crio-EM del complesso, sarà necessario un ulteriore perfezionamento strutturale per determinare come viene trovato il fattore di riparazione del DNA e identificare quali regioni sono importanti per queste interazioni.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Ricerca

Biochimica

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Rapida determinazione dell'affinità anticorpo-antigene mediante fotometria di massa

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparazione rapida della griglia per la microscopia crioeletletnica risolta nel tempo

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Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Preparazione di film di supporto campione in microscopia elettronica a trasmissione utilizzando un blocco di galleggiamento di supporto

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

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Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Microscopia crioelettronica a particella singola: dal campione alla struttura

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Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

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Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

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Un robusto flusso di lavoro di elaborazione crioelettronica a particella singola (cryo-EM) con crioSPARC, RELION e Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Estrazione di microtubuli modificati da cellule di mammifero per studiare complessi microtubulo-proteine mediante microscopia crioelettronica

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Rivestimento delle griglie CryoEM con grafene monostrato per migliorare la preparazione dei campioni criogenici

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Autore in primo piano: Miglioramento della preparazione dei campioni CryoEM utilizzando il monostrato di grafene su griglie di microscopia 

Applicazione del grafene monostrato alle griglie di microscopia crioelettronica per la determinazione della struttura ad alta risoluzione

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...