Name: preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00
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미국 국립환경보건과학연구소(National Institute of Environmental Health Sciences)의 Cryo-EM 코어의 Mario Borgnia 박사와 채플힐에 있는 노스캐롤라이나 대학교(University of North Carolina at Chapel Hill)의 Joshua Strauss 박사에게 Cryo-EM 그리드 준비에 대한 멘토링과 교육에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트의 초기 단계에서 기술 지원을 해주신 Juliana Mello Da Fonseca Rezende 박사에게도 감사드립니다. 우리는 고(故) Samuel H. Wilson 박사와 그의 연구실 구성원, 특히 유전적으로 융합된 APE1-Polβ 복합체의 정제를 위해 Dr. Rajendra Prasad와 Dr. Joonas Jamsen의 주요 공헌과 지원에 감사드립니다. 연구는 국립 보건원, 국립 환경 보건 과학 연구소의 교내 연구 프로그램[보조금 번호 Z01ES050158, Z01ES050159 및 K99ES031662-01]의 지원을 받았습니다.

1. 염 투석을 통해 뉴클레오솜 코어 입자 조립
참고: 구조 연구를 위해 재조합 히스톤 단백질을 사용하는 뉴클레오솜 코어 입자의 제조는 다른 사람들에 의해 광범위하게 상세히 기술되었다14,15,16. 다른14,15에 의해 기술된 재조합 X. laevis 히스톤 및 히스톤 옥타머 조립체?...

<ol>
	<li>Ehrenhofer-Murray, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+at+DNA+replication,+transcription+and+repair.">Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.</a> European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).</li><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+mediated+interactions+in+the+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+1.9+a+resolution.">Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).</li><li>Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleosome+core+particle+containing+the+variant+histone+H2A.Z.">Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z.</a> Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).</li><li>Tachiwana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+centromeric+nucleosome+containing+CENP-A.">Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A.</a> Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).</li><li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+structure+and+function.">Nucleosome structure and function.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+acetylation+of+histone+H3+decreases+polymerase+beta+activity+on+nucleosome+core+particles+in+vitro.">Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+DNA+damage+in+chromatin:+Preparing+the+chromatin+landscape+for+base+excision+repair.">Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair.</a> DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+lysine+56+acetylation+enhances+AP+endonuclease+1-mediated+repair+of+AP+sites+in+nucleosome+core+particles.">Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles.</a> Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).</li><li>Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unencumbered+Pol+beta+lyase+activity+in+nucleosome+core+particles.">Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).</li><li>Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+location+of+DNA+lesions+in+nucleosome+core+particles+determines+accessibility+by+base+excision+repair+enzymes.">The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).</li><li>Olmon, E. D., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ability+of+five+DNA+glycosylases+to+recognize+and+repair+damage+on+nucleosomal+DNA.">Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA.</a> ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).</li><li>Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement+for+base+excision+repair+in+chromatin.">Rules of engagement for base excision repair in chromatin.</a> Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nucleosome+core+particle+from+recombinant+histones.">Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones.</a> Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).</li><li>McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+crystallization,+and+structure+determination+of+chromatin+enzyme/nucleosome+complexes.">Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes.</a> Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).</li><li>Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA+oligos+by+denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(PAGE).">Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).</a> Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).</li><li>Burgess, R. R. D., Murray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Protein Purification. 463, (2009).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+to+a+homo-oligomeric+scaffold+allows+cryo-EM+analysis+of+a+small+protein.">Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein.</a> Scientific Reports. 6, 30909 (2016).</li><li>Wu, X., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+determination+of+small+proteins+by+nanobody-binding+scaffolds+(Legobodies).">Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies).</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM.">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).</li><li>Takizawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+nucleosome+containing+the+ALB1+enhancer+DNA+sequence.">Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence.</a> Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).</li><li>Anderson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+recognition+of+ubiquitylated+nucleosome+by+Dot1L+methyltransferase.">Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase.</a> Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).</li></ol>

DNA 복구 인자를 정제하기 위한 특정 프로토콜은 관심 효소에 따라 달라집니다. 그러나, 단백질 발현 및 정제를 위한 재조합 방법의 사용을 포함하여 몇 가지 일반적인 권장 사항이 있다18; 관심 단백질이 너무 작으면(<50kDa), Cryo-EM에 의한 구조 결정은 융합 시스템(19), 나노바디 결합 스캐폴드(nanobody-binding scaffolds)20 및 이미징 전략?...

진핵 생물 DNA는 히스톤 단백질에 의해 조직되고 압축되어 염색질을 형성합니다. 뉴클레오솜 코어 입자(NCP)는 DNA 복구, 전사 및 복제를 위한 DNA 결합 단백질에 대한 접근성을 조절하는 염색질의 기본 반복 단위를 구성합니다1. NCP의 첫 번째 X선 결정 구조가 20여 년 전에 처음 해결되었지만2 3,4,5,6 이후 NCP의 더 많은 구조가 발표되었지만 뉴클레오솜 기질의 DNA 복구 메커니즘은 아직 설명되지 않았습니다. 염색질에서 DNA 복구의 기본 분자 세부 사항을 밝히려면 NCP의 국소 구조적 특징이 DNA 복구 활동을 조절하는 방법을 이해하기 위해 참여 구성 요소의 구조적 특성화가 필요합니다. 이것은 BER 효소를 사용한 생화학적 연구가 촉매 작용에 대한 효소 특이적 구조 요구 사항 및 뉴클레오솜 내 DNA 병변의 구조적 위치에 의존하는 뉴클레오솜의 고유한 DNA 복구 메커니즘을 제안한다는 점을 감안할 때 염기 절제 복구(BER)의 맥락에서 특히 중요합니다 7,8,9,10,11,12,13 . BER이 중요한 DNA 복구 과정이라는 점을 감안할 때, 이러한 격차를 메우는 동시에 관련 뉴클레오솜 복합체와 관련된 기술적으로 실현 가능한 다른 구조 연구를 수행할 수 있는 출발점을 설정하는 데 상당한 관심이 있습니다.
Cryo-EM은 균질 시료의 대규모 전처리가 어려운 복합체의 3차원 (3D) 구조를 해결하기 위한 방법으로 빠르게 자리잡고 있습니다. DNA 복구 인자(NCP-DRF)와 복합체를 이루는 NCP의 설계 및 정제에는 맞춤형 최적화가 필요할 수 있지만, 안정적인 NCP-DRF 복합체를 생성 및 동결하기 위해 여기에 제시된 절차는 시료 및 Cryo-EM 그리드 준비를 최적화하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 그림 1에 표시된 두 개의 워크플로(상호 배타적이지 않음)와 프로토콜의 특정 세부 정보는 중요한 단계를 식별하고 이러한 단계를 최적화하기 위한 전략을 제공합니다. 이 연구는 뉴클레오솜 DNA 복구의 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 생화학적과 구조적 연구를 보완하는 것이 기술적으로 실현 가능한 방향으로 염색질 및 DNA 복구 분야를 추진할 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES; pH 7.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>043398.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>491 prep cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1702926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z717185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoGrid Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EM GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1000 touch thermocycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-clips and rings</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>6640--6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>SCT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15370752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Tweezers</td>
			<td>Techni-Pro</td>
			<td>758TW0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA</td>
			<td>Integrated DNA techonologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEI Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>KRIOSG4TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC purification system</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector Model 2110</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Boxes</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>PB-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Storage Accessory Pack</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>GSAX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Ethane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic two-head pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6695BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (VWR) Low Retention</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solution (37.5:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4338-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PURX35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified recombinant DNA repair factor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant histone octamer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring clipping tools</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column 10/300</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Talos Arctica 200 kV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15514011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mark IV System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter paper (55 mM)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1005-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>440700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination

염색질의 맥락에서 DNA 복구는 잘 알려져 있지 않습니다. 염색질의 기본 반복 단위인 뉴클레오솜 코어 입자를 사용한 생화학적 연구에 따르면 대부분의 DNA 복구 효소는 유리 DNA에 비해 감소된 속도로 DNA 손상을 제거합니다. 염기 절제 복구(BER) 효소가 뉴클레오솜에서 DNA 손상을 인식하고 제거하는 방법에 대한 분자적 세부 사항은 밝혀지지 않았습니다. 그러나 뉴클레오솜 기질의 생화학적 BER 데이터는 뉴클레오솜이 DNA 병변의 위치와 효소에 따라 다른 구조적 장벽을 제시함을 시사합니다. 이것은 유리 DNA에서 DNA 손상을 제거하기 위해 이러한 효소가 사용하는 메커니즘이 뉴클레오솜에 사용되는 메커니즘과 다를 수 있음을 나타냅니다. 대부분의 게놈 DNA가 뉴클레오솜으로 조립된다는 점을 감안할 때 이러한 복합체의 구조적 정보가 필요합니다. 현재까지 과학계는 이러한 복합체에 대해 기술적으로 실현 가능한 구조 연구를 수행하기위한 상세한 프로토콜이 부족합니다. 여기에서는 초저온 전자 현미경(Cryo-EM) 구조 결정을 위해 뉴클레오솜의 입구-출구 근처의 단일 뉴클레오티드 갭에 결합된 두 개의 유전적으로 융합된 BER 효소(중합효소 β 및 AP 엔도뉴클레아제1)의 복합체를 제조하는 두 가지 방법을 제공합니다. 두 가지 시료 전처리 방법 모두 플런지 냉동을 통해 품질 그리드를 유리화하는 데 적합합니다. 이 프로토콜은 다른 BER 인자, 선구자 전사 인자 및 염색질 변형 효소를 가진 다른 뉴클레오솜 복합체를 준비하기 위한 출발점으로 사용할 수 있습니다.

적절하게 조립된 NCP(그림 2)를 사용하여 MBP-Polβ-APE1의 재조합 융합 단백질과 복합체를 만들었습니다(그림 3). 안정적인 복합체를 형성하기 위해 MBP-Polβ-APE1에 대한 NCP의 비율을 결정하기 위해 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)을 수행했으며(그림 4), MBP-Polβ-APE1의 5배 몰 초과로 NCP의 단일 이동 밴드를 보여주었습니다. 이 복합체를 만...

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Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

이 프로토콜은 TEM 그리드 동결을 위한 두 가지 샘플 준비 방법을 사용하여 뉴클레오솜 복합체의 준비를 자세히 설명합니다.

초저온 전자 현미경 구조 결정을 위한 DNA 복구 인자와 복합체화된 뉴클레오솜 코어 입자의 준비

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

염기 절제 복구 효소가 염색질의 맥락에서 DNA 병변을 제거하는 방법에 대한 구조적 정보는 부족합니다. 이것은 인간 질병의 병인과 관련된 메커니즘에 대한 우리의 이해에 상당한 격차를 구성합니다. 당사 프로토콜의 주요 장점은 표준 실험실 장비를 사용하여 샘플 준비를 최적화했다는 것입니다.이를 통해 현장의 다른 생화학자들은 기술적으로 실현 가능한 Cryo-EM 연구로 생화학 연구를 보완할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 개척자 전사 인자를 포함한 다른 인자가 뉴클레오솜에 어떻게 관여하는지 조사하는 데 추가로 사용될 수 있습니다. 이것은 구조적 정보도 제한적인 영역입니다.동결 조건으로 이동하기 전에 시료 전처리를 최적화하는 것이 프로젝트를 진행하는 데 핵심적인 역할을 했으며, 이는 기질 설계, 결합 및 가교 조건에서 표준 생화학적 분석을 통해 가장 잘 수행됩니다. 시작하려면 특정 복합체에 대한 최적의 완충액을 사용하여 15분 동안 얼음 위에서 NCP와 DNA 복구 인자를 배양합니다. 그런 다음 글루타르알데히드를 최종 농도 0.005%로 첨가한 후 잘 혼합한 후 실온에서 13분간 배양한다.1몰 Tris-CL로 pH 7.5의 최종 농도 20밀리몰 Tris-CL로 급냉합니다. 이어서, 약 50 마이크로리터로 농축하고, 탈염 컬럼을 사용하여 완충액을 동결 완충액으로 교환한다. 다음으로, 광학 밀도 280 및 260 나노미터에서 흡광도를 결정하고, 광학 밀도 280 나노미터를 기준으로 밀리리터당 1.3 내지 3 밀리그램에 도달하기 위해 필요한 경우 추가로 농축한다.투석 버튼을 준비한 후 멤브레인이 아래를 향하도록 하여 폴리에틸렌 글리콜 베드 위에 샘플이 들어 있는 버튼을 놓습니다. 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제를 수행하기 위해, 크기 배제 컬럼을 60 밀리리터의 증류수로 세척하고 평형화시킨 다음, 분당 0.4 밀리리터의 속도로 밤새 80 밀리리터의 동결 완충액을 세척하였다. 그런 다음 즉시 피크 분획을 분석하고 히스톤의 주입 단백질 MBP-PolBeta-APE1을 포함하는 분획을 농축합니다.엘리자베스 비베렛(Elizabeth Viverette)은 여기 NIH의 Cryo-EM 코어에서 학사 후 과정을 밟고 있는 연수생입니다. 플런지 냉동고를 켜고 가습기에 증류수 50ml를 채운 후 챔버 온도를 섭씨 22도, 습도를 98%로 설정한 다음 에탄 컵과 액체 질소 컵을 각각의 공간 홀더에 넣습니다. 그런 다음 에탄 컵을 에탄 뚜껑 디스펜서로 덮고 그 위에 액체 질소를 조심스럽게 붓고 질소 컵에 액체 질소를 채웁니다.액체 질소 수준이 안정화되어 100%에 도달하고 온도가 섭씨 영하 180도에 도달하면 에탄 밸브를 조심스럽게 열고 투명한 뚜껑에 거품이 생길 때까지 에탄 컵을 채웁니다. 그런 다음 에탄 디스펜서를 제거합니다. 두 개의 여과지를 블로팅 장치에 놓고 금속 링으로 고정합니다.설정으로 이동하여 원고에 설명된 대로 블로팅 매개변수를 설정한 다음 A-Plunge를 선택하고 확인을 클릭합니다. 메인 화면에서 Load Posps를 클릭하고 탄소 도포 면이 왼쪽을 향하도록 그리드를 로드합니다. 집게를 보정하고 Z축을 조정하여 단단한 얼룩을 보장합니다. Lower Chamber를 클릭하고 3 마이크로 리터의 복합체를 적용하십시오.그런 다음 Blot A-Plunge를 클릭하면 그리드가 회전하여 전면에서 블롯이 되고 플런지 프리즈됩니다. 이송 후 그리드를 액체 질소 챔버의 그리드 상자에 보관하십시오. 4개의 그리드가 모두 고정되어 그리드 상자에 배치되면 모든 그리드가 뚜껑으로 덮인 중립 위치로 뚜껑을 돌리고 나사를 조입니다.현미경에 샘플을 로드하기 전에 유리화된 그리드를 링에 놓고 얼음 오염을 방지하기 위해 습도가 조절되는 방에서 액체 질소 아래 C-클립을 사용하여 고정합니다. 현미경을 로드할 때 그리드를 12슬롯 카세트에 삽입합니다. 카세트를 nanocab 캡슐에 넣고 오토로더에 장착합니다.그런 다음 그리드를 카세트에서 현미경으로 옮깁니다.tage. 스테이지를 10도 흔들어 스테이지를 유센트릭 높이로 조정하고 이미지에서 최소한의 평면 이동이 관찰될 때까지 Z 높이를 동시에 움직입니다. 유센트릭 높이에 도달하면 각 몽타주를 62배 배율로 촬영한 그리드의 3x3 몽타주 이미지를 촬영하여 이미징을 시작하여 아틀라스를 얻습니다.다양한 크기의 정사각형 3개를 선택하고 유센트릭 높이를 취한 후 210x 배율로 이미지를 만듭니다. 정사각형이 이미지화되면 정사각형 내의 가장자리, 중앙 및 그 사이에서 각각 하나의 구멍을 선택합니다. 그런 다음 각 구멍을 2, 600x 배율로 이미지화합니다.36, 000x 배율 및 7.1 초 노출 시간, 60 프레임, 1.18 픽셀 크기 및 3 마이크로 미터 디 포커스로 구멍 중앙에서 고배율 이미지를 가져옵니다. 상영의 대표 이미지를 참조하십시오. 안정적인 복합체를 형성하기 위한 MBP-PolBeta-APE1에 대한 NCP의 비율을 결정하기 위해 전기영동 이동성 이동 분석을 수행했으며, 이는 MBP-PolBeta-APE1의 5배 몰 초과로 NCP의 단일 이동 밴드를 보여주었습니다.더 작은 부피에서 NCP-PolBeta-APE1 복합체의 조립은 샘플이 과도하게 가교되어 식별 가능한 개별 복합체가 없는 응집체를 생성한다는 것을 입증했습니다. 그러나 NCP를 10배 희석하면 응집이 크게 감소하고 입자 안정성이 향상되었습니다. 분취 겔과 크기 배제 방법을 결합할 수 있는데, 여기서 분취 겔은 상당한 양의 고분자량 응집체를 포함할 때 NCP의 품질을 개선한 다음 크기 배제를 통해 복합체를 정제합니다.결과는 두 방법 모두 독립적으로 사용하여 안정적인 복합체를 생성할 수 있음을 보여줍니다. 또한 두 그리드에서 수집된 데이터는 약 3.2옹스트롬 해상도에서 거의 동일한 2차원 클래스와 3차원 지도를 보여줍니다. DNA 복구 인자에 대한 NCP의 최적 비율을 먼저 결정해야 하며, 그 다음 복합체와 글루타르알데히드의 가교결합은 동결에 필요한 농도보다 최소 10배 더 희석하여 수행되어야 합니다.복합체의 Cryo-EM 3D 지도를 얻은 후 DNA 복구 인자를 찾는 방법을 결정하고 이러한 상호 작용에 중요한 영역을 식별하기 위해 추가 구조적 개선이 필요합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

연구

생화학

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

질량 광합성에 의한 항체 항원 선호도의 신속한 결정

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

시간 해결 된 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 빠른 그리드 준비

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

지원 부동 블록을 사용하여 전송 전자 현미경 검사법에서 샘플 지원 필름의 준비

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

초저온 전자 현미경으로 미세소관-단백질 복합체를 연구하기 위해 포유류 세포에서 변형된 미세소관 추출

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

고분해능 구조 측정을 위해 Monolayer Graphene을 Cryo-Electron Microscopy Grid에 적용

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...