Name: preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination at JoVE.com

Vi takker Dr. Mario Borgnia fra kryo-EM-kjernen ved National Institute of Environmental Health Sciences og Dr. Joshua Strauss fra University of North Carolina på Chapel Hill for deres mentorskap og opplæring i cryo-EM-nettforberedelsen. Vi takker også Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende for teknisk assistanse i de innledende stadiene av dette prosjektet. Vi setter pris på nøkkelbidraget og støtten til avdøde Dr. Samuel H. Wilson og hans laboratoriemedlemmer, spesielt Dr. Rajendra Prasad og Dr. Joonas Jamsen for rensing av det genetisk smeltede APE1-Polβ-komplekset. Forskning har blitt støttet av det intramurale forskningsprogrammet til National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [tilskuddsnummer Z01ES050158, Z01ES050159 og K99ES031662-01].

1. Monter nukleosomkjernepartikler via saltgardientdialyse
MERK: Fremstillingen av nukleosomkjernepartikler ved bruk av rekombinante histonproteiner for strukturelle studier har blitt omfattende beskrevet i detalj av andre14,15,16. Følg rensingen av rekombinant X. laevis histoner og histonoktamerenhet beskrevet av andre14,15,<sup class="xref"...

<ol>
	<li>Ehrenhofer-Murray, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+at+DNA+replication,+transcription+and+repair.">Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.</a> European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).</li><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+mediated+interactions+in+the+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+1.9+a+resolution.">Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).</li><li>Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleosome+core+particle+containing+the+variant+histone+H2A.Z.">Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z.</a> Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).</li><li>Tachiwana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+centromeric+nucleosome+containing+CENP-A.">Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A.</a> Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).</li><li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+structure+and+function.">Nucleosome structure and function.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+acetylation+of+histone+H3+decreases+polymerase+beta+activity+on+nucleosome+core+particles+in+vitro.">Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+DNA+damage+in+chromatin:+Preparing+the+chromatin+landscape+for+base+excision+repair.">Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair.</a> DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+lysine+56+acetylation+enhances+AP+endonuclease+1-mediated+repair+of+AP+sites+in+nucleosome+core+particles.">Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles.</a> Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).</li><li>Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unencumbered+Pol+beta+lyase+activity+in+nucleosome+core+particles.">Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).</li><li>Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+location+of+DNA+lesions+in+nucleosome+core+particles+determines+accessibility+by+base+excision+repair+enzymes.">The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).</li><li>Olmon, E. D., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ability+of+five+DNA+glycosylases+to+recognize+and+repair+damage+on+nucleosomal+DNA.">Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA.</a> ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).</li><li>Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement+for+base+excision+repair+in+chromatin.">Rules of engagement for base excision repair in chromatin.</a> Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nucleosome+core+particle+from+recombinant+histones.">Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones.</a> Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).</li><li>McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+crystallization,+and+structure+determination+of+chromatin+enzyme/nucleosome+complexes.">Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes.</a> Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).</li><li>Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA+oligos+by+denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(PAGE).">Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).</a> Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).</li><li>Burgess, R. R. D., Murray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Protein Purification. 463, (2009).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+to+a+homo-oligomeric+scaffold+allows+cryo-EM+analysis+of+a+small+protein.">Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein.</a> Scientific Reports. 6, 30909 (2016).</li><li>Wu, X., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+determination+of+small+proteins+by+nanobody-binding+scaffolds+(Legobodies).">Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies).</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM.">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).</li><li>Takizawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+nucleosome+containing+the+ALB1+enhancer+DNA+sequence.">Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence.</a> Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).</li><li>Anderson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+recognition+of+ubiquitylated+nucleosome+by+Dot1L+methyltransferase.">Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase.</a> Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).</li></ol>

En spesifikk protokoll for rensing av DNA-reparasjonsfaktoren vil være avhengig av enzymet av interesse. Imidlertid er det noen generelle anbefalinger, inkludert bruk av rekombinante metoder for proteinuttrykk og rensing18; Hvis proteinet av interesse er for lite (<50 kDa), hadde strukturbestemmelse av cryo-EM vært nesten umulig inntil nylig gjennom bruk av fusjonssystemer19, nanokroppsbindende stillas20 og optimalisering av bildestrategier<sup cla...

Eukaryot DNA er organisert og komprimert av histonproteiner, som danner kromatin. Nukleosomkjernepartikkelen (NCP) utgjør den grunnleggende repeterende enheten av kromatin som regulerer tilgjengeligheten til DNA-bindende proteiner for DNA-reparasjon, transkripsjon og replikasjon1. Selv om den første røntgenkrystallstrukturen til NCP først ble løst for mer enn to tiår siden2 og mange flere strukturer av NCP har blitt publisert siden 3,4,5,6, har DNA-reparasjonsmekanismer i nukleosomale substrater ennå ikke blitt avgrenset. Å avdekke de molekylære detaljene som ligger til grunn for DNA-reparasjon i kromatin vil kreve strukturell karakterisering av de deltakende komponentene for å forstå hvordan lokale strukturelle trekk ved NCP regulerer DNA-reparasjonsaktiviteter. Dette er spesielt viktig i sammenheng med baseeksisjonsreparasjon (BER), gitt at biokjemiske studier med BER-enzymer antyder unike DNA-reparasjonsmekanismer i nukleosomer som er avhengige av enzymspesifikke strukturelle krav til katalyse og strukturposisjonen til DNA-lesjonen i nukleosomet 7,8,9,10,11,12,13 . Gitt at BER er en viktig DNA-reparasjonsprosess, er det stor interesse for å fylle ut disse hullene, samtidig som det etableres et utgangspunkt hvorfra andre teknisk gjennomførbare strukturelle studier som involverer relevante nukleosomale komplekser kan utføres.
Cryo-EM er raskt i ferd med å bli den foretrukne metoden for å løse den tredimensjonale (3D) strukturen til komplekser hvis storskala fremstilling av homogen prøve er utfordrende. Selv om design og rensing av kontaktpunkter kompleksert med en DNA-reparasjonsfaktor (NCP-DRF) sannsynligvis vil kreve skreddersydd optimalisering, gir prosedyren som presenteres her for å generere og fryse et stabilt NCP-DRF-kompleks detaljer om hvordan man optimaliserer prøven og klargjøring av kryo-EM-nettet. To arbeidsflyter (ikke gjensidig utelukkende) vist i figur 1, og de spesifikke detaljene i protokollen identifiserer kritiske trinn og gir strategier for å optimalisere disse trinnene. Dette arbeidet vil drive kromatin- og DNA-reparasjonsfeltet i en retning der komplementering av biokjemiske med strukturelle studier blir teknisk mulig for bedre å forstå molekylære mekanismer for nukleosomal DNA-reparasjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES; pH 7.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>043398.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>491 prep cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1702926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z717185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoGrid Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EM GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1000 touch thermocycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-clips and rings</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>6640--6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>SCT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15370752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Tweezers</td>
			<td>Techni-Pro</td>
			<td>758TW0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA</td>
			<td>Integrated DNA techonologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEI Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>KRIOSG4TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC purification system</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector Model 2110</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Boxes</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>PB-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Storage Accessory Pack</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>GSAX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Ethane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic two-head pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6695BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (VWR) Low Retention</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solution (37.5:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4338-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PURX35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified recombinant DNA repair factor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant histone octamer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring clipping tools</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column 10/300</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Talos Arctica 200 kV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15514011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mark IV System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter paper (55 mM)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1005-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>440700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination

DNA-reparasjon i sammenheng med kromatin er dårlig forstått. Biokjemiske studier ved bruk av nukleosomkjernepartikler, den grunnleggende repeterende enheten av kromatin, viser at de fleste DNA-reparasjonsenzymer fjerner DNA-skade ved reduserte hastigheter sammenlignet med fritt DNA. De molekylære detaljene om hvordan baseeksisjonsreparasjon (BER) enzymer gjenkjenner og fjerner DNA-skade i nukleosomer har ikke blitt belyst. Imidlertid antyder biokjemiske BER-data fra nukleosomale substrater at nukleosomet presenterer forskjellige strukturelle barrierer avhengig av plasseringen av DNA-lesjonen og enzymet. Dette indikerer at mekanismene som brukes av disse enzymene for å fjerne DNA-skade i fritt DNA, kan være forskjellige fra de som brukes i nukleosomer. Gitt at flertallet av genomisk DNA er samlet inn i nukleosomer, er strukturell informasjon av disse kompleksene nødvendig. Til dags dato mangler det vitenskapelige samfunn detaljerte protokoller for å utføre teknisk gjennomførbare strukturelle studier av disse kompleksene. Her gir vi to metoder for å fremstille et kompleks av to genetisk smeltede BER-enzymer (Polymerase β og AP Endonuclease1) bundet til et enkelt-nukleotidgap nær inngang-utgangen av nukleosomet for kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) strukturell bestemmelse. Begge metodene for prøvepreparering er kompatible for å vitrifisere kvalitetsgitter via dypfrysing. Denne protokollen kan brukes som utgangspunkt for å fremstille andre nukleosomale komplekser med forskjellige BER-faktorer, pionertranskripsjonsfaktorer og kromatinmodifiserende enzymer.

Riktig monterte kontaktpunkter (figur 2) ble brukt til å lage et kompleks med et rekombinant fusjonsprotein av MBP-Polβ-APE1 (figur 3). For å bestemme forholdet mellom NCP og MBP-Polβ-APE1 for å danne et stabilt kompleks, utførte vi elektroforetiske mobilitetsskiftanalyser (EMSA) (figur 4), som viste et enkeltskiftet bånd av NCP med 5 ganger molaroverskudd av MBP-Polβ-APE1. Under optimaliseringen av å gjøre dette komplekst...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination at JoVE.com

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Denne protokollen skisserer i detalj fremstillingen av nukleosomale komplekser ved hjelp av to metoder for prøvepreparering for frysing av TEM-nett.

Fremstilling av nukleosomkjernepartikler kompleksert med DNA-reparasjonsfaktorer for kryo-elektronmikroskopi strukturell bestemmelse

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Strukturell informasjon om hvordan baseeksisjonsreparasjonsenzymer fjerner DNA-lesjoner i sammenheng med kromatin har vært knapp. Dette utgjør et betydelig gap i vår forståelse av mekanismene som er involvert i etiologi av menneskelige sykdommer. Den største fordelen med protokollen vår er at vi har optimalisert prøvepreparering ved hjelp av standard laboratorieutstyr.Dette vil gjøre det mulig for andre biokjemikere i feltet å utfylle sitt biokjemiske arbeid med teknisk gjennomførbare kryo-EM-studier. Vår protokoll kan i tillegg brukes til å undersøke hvordan andre faktorer, inkludert pionertranskripsjonsfaktorer, engasjerer nukleosomet. Dette er et område hvor også strukturell informasjon har vært begrenset.Optimalisering av prøveprepareringen før vi gikk videre til fryseforholdene var nøkkelen til å drive prosjektet vårt fremover, og dette gjøres best med standard biokjemiske analyser i substratdesign, binding og kryssbindingsforhold. For å begynne, inkuber kontaktpunktet og DNA-reparasjonsfaktoren av interesse på is i 15 minutter ved hjelp av en optimal buffer for det spesifikke komplekset. Deretter tilsettes glutaraldehyd til en endelig konsentrasjon på 0,005% Etter å ha blandet det godt, inkuber ved romtemperatur i 13 minutter.Slukk med en molar Tris-CL til en endelig konsentrasjon på 20 millimolar Tris-CL med pH 7,5. Deretter konsentrerer du deg til ca. 50 mikroliter og bytter ut bufferen med frysebuffer ved hjelp av en avsaltingskolonne. Deretter bestemmer du absorbansene ved optisk tetthet 280 og 260 nanometer og konsentrerer seg videre om nødvendig for å nå 1, 3 til 3 milligram per milliliter basert på optisk tetthet 280 nanometer.Etter å ha forberedt dialyseknappen, plasser knappen som inneholder prøven på toppen av en polyetylenglykolseng med membranen vendt ned. For å utføre rensing ved størrelsesekskluderingskromatografi, vask og balanser en størrelsesekskluderingskolonne med 60 ml destillert vann, etterfulgt av 80 ml frysebuffer over natten med en hastighet på 0,4 milliliter per minutt. Deretter analyserer du umiddelbart toppfraksjonene og konsentrerer de fraksjonene som inneholder histonens infusjonsprotein MBP-PolBeta-APE1.Demonstrere følgende prosedyrer vil være Elizabeth Viverette, en post-baccalaureate trainee fra cryo-EM kjernen her i NIH. Etter å ha slått på stupefryseren og fylt luftfukteren med 50 ml destillert vann, sett kammertemperaturen til 22 grader Celsius og fuktighet til 98%Plasser deretter etankoppen og flytende nitrogenkoppen i de respektive plassholderne. Etterpå dekker du etankoppen med etanlokkdispenseren og heller forsiktig flytende nitrogen over den mens du også fyller nitrogenkoppen med flytende nitrogen.Når nivået av flytende nitrogen har stabilisert seg og når 100% og temperaturen når minus 180 grader Celsius, åpner du forsiktig etanventilen og fyller etankoppen til den danner en boble på det klare lokket. Fjern deretter etanddispenseren. Legg to filterpapir på blotteanordningen og fest dem med en metallring.Gå til oppsettet og angi blottingparametrene som beskrevet i manuskriptet, velg deretter A-Plunge og klikk på OK. På hovedskjermen klikker du på Load Forceps og laster dem med et rutenett med karbonapplikasjonssiden vendt mot venstre. Kalibrer tangen, juster Z-aksen for å sikre en solid flekk. Klikk på Nedre kammer og bruk tre mikroliter av komplekset.Klikk deretter på Blot A-Plunge, som vil rotere rutenettet for å slette fra fronten og vil stupe-fryse det. Etter overføring oppbevarer du rutenettet i gitterboksen i kammeret med flytende nitrogen. Når alle fire ristene er frosset og plassert i gitterboksen, drei lokket til nøytral posisjon der alle ristene er dekket av lokket og stram skruen.Før du legger prøvene i mikroskopet, plasser de forglassede ristene på en ring og fest den med et C-klips under flytende nitrogen i et fuktighetskontrollert rom for å unngå isforurensning. Når du legger i mikroskopet, sett inn ristene i en 12-spors kassett. Bland kassetten inn i en nanocabkapsel og legg den inn i autoloaderen.Deretter overfører du rutenettet fra kassetten til mikroskopstadiet. Juster scenen til eusentrisk høyde ved å vingle scenen 10 grader og samtidig flytte Z-høyden til minimal plan forskyvning observeres i bildene. Når den eusentriske høyden er nådd, kan du starte avbildningen ved å ta et 3-til-3 montasjebilde av rutenettet der hver montasje er tatt med 62x forstørrelse for å oppnå atlaset.Etter å ha valgt tre firkanter av varierende størrelser og tatt den eusentriske høyden, bildet ved 210x forstørrelse. Når en firkant er avbildet, velger du ett hull hver fra kanten, midten og i mellom rutene. Deretter avbilder du hvert hull ved 2, 600x forstørrelse.Ta bildet med høy forstørrelse fra midten av hullet ved 36 000x forstørrelse og med 7,1 sekunder eksponeringstid, 60 bilder, 1,18 piksler og tre mikrometer defokus. Se representative bilder av screening. For å bestemme forholdet mellom NCP og MBP-PolBeta-APE1 for å danne stabilt komplekst, ble elektroforetiske mobilitetsskiftanalyser utført, som viste et enkeltforskjøvet bånd av NCP med fem ganger molaroverskudd av MBP-PolBeta-APE1.I mindre volum viste montering av komplekset av NCP-PolBeta-APE1 at prøven var altfor tverrbundet og resulterte i aggregater uten merkbare individuelle komplekser. Tidoblet fortynning i NCP resulterte imidlertid i signifikant redusert aggregering og forbedret partikkelstabilitet. De preparative gel- og størrelseseksklusjonsmetodene kan kombineres der preparativ gel forbedrer kvaliteten på kontaktpunktene når de inneholder en betydelig mengde høymolekylære aggregater, etterfulgt av rensing av komplekset via størrelsesekskludering.Resultatene viser at begge metodene kan brukes uavhengig av hverandre for å generere stabile komplekser. Videre viser dataene samlet inn fra begge rutenett nesten identiske todimensjonale klasser og tredimensjonale kart med omtrent 3,2 meters oppløsning. Et optimalt forhold mellom NCP og DNA-reparasjonsfaktor bør bestemmes først, deretter skal kryssbinding av komplekset med glutaraldehyd utføres minst 10 ganger mer fortynnet enn konsentrasjonen som trengs for frysing.Etter å ha oppnådd et cryo-EM 3D-kart over komplekset, vil det være behov for ytterligere strukturell forbedring for å bestemme hvordan DNA-reparasjonsfaktoren er funnet og identifisere hvilke regioner som er viktige for disse interaksjonene.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttrykk og rensing av menneskelige Lipid-sensitive kasjon kanal-TRPC3 for strukturelle vilje av Single-partikkel Cryo-elektronmikroskop

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Rask bestemmelse av antistoff-antigen affinitet av masse fotometri

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Rask nettforberedelse for tidsavklart kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Utarbeidelse av prøvestøttefilmer i transmisjonselektronmikroskopi ved hjelp av en støtteflytblokk

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og Cryo-FIB mikromaskinering av Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropattering overføring elektronmikroskopinett til direkte celleposisjonering i hele celler Cryo-Electron Tomography Arbeidsflyter

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Ekstrahering av modifiserte mikrotubuli fra pattedyrceller for å studere mikrotubuli-proteinkomplekser ved kryo-elektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Belegg av CryoEM-gitter med monolagsgrafen for å forbedre forberedelsen av kryoprøver

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Forfatter i søkelyset: Forbedring av CryoEM-prøveforberedelse ved bruk av grafenmonolag på mikroskopigitter 

Anvendelse av monolags grafen til kryo-elektronmikroskopigitter for høyoppløselig strukturbestemmelse

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...