Name: preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination at JoVE.com

Vi tackar Dr. Mario Borgnia från cryo-EM-kärnan vid National Institute of Environmental Health Sciences och Dr. Joshua Strauss från University of North Carolina at Chapel Hill för deras mentorskap och utbildning i kryo-EM-nätberedningen. Vi tackar också Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende för teknisk hjälp i de inledande stadierna av detta projekt. Vi uppskattar det viktiga bidraget och stödet från den avlidne Dr. Samuel H. Wilson och hans laboratoriemedlemmar, särskilt Dr. Rajendra Prasad och Dr. Joonas Jamsen för rening av det genetiskt smälta APE1-Polβ-komplexet. Forskning har fått stöd av det intramurala forskningsprogrammet vid National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [bidragsnummer Z01ES050158, Z01ES050159 och K99ES031662-01].

1. Montera nukleosomkärnpartiklar via saltgardient dialys
OBS: Beredningen av nukleosomkärnpartiklar med användning av rekombinanta histonproteiner för strukturella studier har beskrivits utförligt i detalj av andra14,15,16. Följ reningen av rekombinant X. laevis histoner och histonokemerenhet som beskrivs av andra14,15...

<ol>
	<li>Ehrenhofer-Murray, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+at+DNA+replication,+transcription+and+repair.">Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.</a> European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).</li><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+mediated+interactions+in+the+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+1.9+a+resolution.">Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).</li><li>Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleosome+core+particle+containing+the+variant+histone+H2A.Z.">Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z.</a> Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).</li><li>Tachiwana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+centromeric+nucleosome+containing+CENP-A.">Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A.</a> Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).</li><li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+structure+and+function.">Nucleosome structure and function.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+acetylation+of+histone+H3+decreases+polymerase+beta+activity+on+nucleosome+core+particles+in+vitro.">Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+DNA+damage+in+chromatin:+Preparing+the+chromatin+landscape+for+base+excision+repair.">Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair.</a> DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+lysine+56+acetylation+enhances+AP+endonuclease+1-mediated+repair+of+AP+sites+in+nucleosome+core+particles.">Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles.</a> Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).</li><li>Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unencumbered+Pol+beta+lyase+activity+in+nucleosome+core+particles.">Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).</li><li>Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+location+of+DNA+lesions+in+nucleosome+core+particles+determines+accessibility+by+base+excision+repair+enzymes.">The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).</li><li>Olmon, E. D., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ability+of+five+DNA+glycosylases+to+recognize+and+repair+damage+on+nucleosomal+DNA.">Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA.</a> ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).</li><li>Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement+for+base+excision+repair+in+chromatin.">Rules of engagement for base excision repair in chromatin.</a> Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nucleosome+core+particle+from+recombinant+histones.">Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones.</a> Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).</li><li>McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+crystallization,+and+structure+determination+of+chromatin+enzyme/nucleosome+complexes.">Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes.</a> Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).</li><li>Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA+oligos+by+denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(PAGE).">Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).</a> Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).</li><li>Burgess, R. R. D., Murray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Protein Purification. 463, (2009).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+to+a+homo-oligomeric+scaffold+allows+cryo-EM+analysis+of+a+small+protein.">Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein.</a> Scientific Reports. 6, 30909 (2016).</li><li>Wu, X., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+determination+of+small+proteins+by+nanobody-binding+scaffolds+(Legobodies).">Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies).</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM.">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).</li><li>Takizawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+nucleosome+containing+the+ALB1+enhancer+DNA+sequence.">Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence.</a> Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).</li><li>Anderson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+recognition+of+ubiquitylated+nucleosome+by+Dot1L+methyltransferase.">Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase.</a> Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).</li></ol>

Ett specifikt protokoll för rening av DNA-reparationsfaktorn kommer att vara beroende av enzymet av intresse. Det finns emellertid några allmänna rekommendationer, inklusive användning av rekombinanta metoder för proteinuttryck och rening18; om proteinet av intresse är för litet (<50 kDa) hade strukturbestämning med kryo-EM varit nästan omöjligt tills nyligen genom användning av fusionssystem19, nanokroppsbindande byggnadsställningar20 oc...

Eukaryot DNA organiseras och komprimeras av histonproteiner och bildar kromatin. Nukleosomkärnpartikeln (NCP) utgör den grundläggande upprepande enheten av kromatin som reglerar tillgängligheten till DNA-bindande proteiner för DNA-reparation, transkription och replikation1. Även om den första röntgenkristallstrukturen i NCP först löstes för mer än två decennier sedan2 och många fler strukturer av NCP har publicerats sedan 3,4,5,6, har DNA-reparationsmekanismer i nukleosomala substrat ännu inte avgränsats. Att avslöja de molekylära detaljerna som ligger till grund för DNA-reparation i kromatin kommer att kräva strukturell karakterisering av de deltagande komponenterna för att förstå hur lokala strukturella egenskaper hos NCP reglerar DNA-reparationsaktiviteter. Detta är särskilt viktigt i samband med reparation av basexcision (BER) med tanke på att biokemiska studier med BER-enzymer tyder på unika DNA-reparationsmekanismer i nukleosomer som är beroende av enzymspecifika strukturella krav för katalys och DNA-lesionens strukturella position inom nukleosomen 7,8,9,10,11,12,13 . Med tanke på att BER är en viktig DNA-reparationsprocess finns det ett stort intresse för att fylla i dessa luckor och samtidigt fastställa en utgångspunkt från vilken andra tekniskt genomförbara strukturstudier med relevanta nukleosomkomplex kan utföras.
Cryo-EM blir snabbt den valda metoden för att lösa den tredimensionella (3D) strukturen hos komplex vars storskaliga beredning av homogent prov är utmanande. Även om design och rening av NCP: er komplexerade med en DNA-reparationsfaktor (NCP-DRF) sannolikt kommer att kräva skräddarsydd optimering, ger proceduren som presenteras här för att generera och frysa ett stabilt NCP-DRF-komplex detaljer om hur man optimerar provet och kryo-EM-nätberedningen. Två arbetsflöden (inte ömsesidigt uteslutande) som visas i figur 1 och den specifika informationen i protokollet identifierar kritiska steg och tillhandahåller strategier för att optimera dessa steg. Detta arbete kommer att driva kromatin- och DNA-reparationsfältet i en riktning där komplementering av biokemiska med strukturella studier blir tekniskt genomförbart för att bättre förstå de molekylära mekanismerna för nukleosomal DNA-reparation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES; pH 7.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>043398.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>491 prep cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1702926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z717185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoGrid Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EM GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1000 touch thermocycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-clips and rings</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>6640--6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>SCT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15370752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Tweezers</td>
			<td>Techni-Pro</td>
			<td>758TW0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA</td>
			<td>Integrated DNA techonologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEI Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>KRIOSG4TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC purification system</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector Model 2110</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Boxes</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>PB-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Storage Accessory Pack</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>GSAX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Ethane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic two-head pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6695BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (VWR) Low Retention</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solution (37.5:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4338-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PURX35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified recombinant DNA repair factor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant histone octamer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring clipping tools</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column 10/300</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Talos Arctica 200 kV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15514011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mark IV System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter paper (55 mM)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1005-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>440700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination

DNA-reparation i samband med kromatin är dåligt förstådd. Biokemiska studier med nukleosomkärnpartiklar, den grundläggande upprepande enheten av kromatin, visar att de flesta DNA-reparationsenzymer tar bort DNA-skador med reducerade hastigheter jämfört med fritt DNA. De molekylära detaljerna om hur basexcisionsreparationsenzymer (BER) känner igen och tar bort DNA-skador i nukleosomer har inte klarlagts. Biokemiska BER-data för nukleosomala substrat tyder emellertid på att nukleosomen uppvisar olika strukturella barriärer beroende på platsen för DNA-lesionen och enzymet. Detta indikerar att mekanismerna som används av dessa enzymer för att avlägsna DNA-skador i fritt DNA kan vara annorlunda än de som används i nukleosomer. Med tanke på att majoriteten av genomiskt DNA monteras i nukleosomer behövs strukturell information om dessa komplex. Hittills saknar det vetenskapliga samfundet detaljerade protokoll för att utföra tekniskt genomförbara strukturella studier av dessa komplex. Här tillhandahåller vi två metoder för att förbereda ett komplex av två genetiskt smälta BER-enzymer (polymeras β och AP Endonuclease1) bundna till ett enda nukleotidgap nära nukleosomens inträde-utgång för kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) strukturbestämning. Båda metoderna för provberedning är kompatibla för förglasning av kvalitetsgaller via doppfrysning. Detta protokoll kan användas som utgångspunkt för att förbereda andra nukleosomala komplex med olika BER-faktorer, pionjärtranskriptionsfaktorer och kromatinmodifierande enzymer.

Korrekt monterade NCP (figur 2) användes för att göra ett komplex med ett rekombinant fusionsprotein av MBP-Polβ-APE1 (figur 3). För att bestämma förhållandet mellan NCP och MBP-Polβ-APE1 för att bilda ett stabilt komplex utförde vi elektroforetiska mobilitetsskiftanalyser (EMSA) (figur 4), som visade ett enstaka skiftat band av NCP med 5-faldigt molärt överskott av MBP-Polβ-APE1. Under optimeringen av att göra detta ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination at JoVE.com

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Detta protokoll beskriver i detalj beredningen av nukleosomala komplex med användning av två metoder för provberedning för frysning av TEM-galler.

Beredning av nukleosomkärnpartiklar komplexerade med DNA-reparationsfaktorer för kryoelektronmikroskopi Strukturell bestämning

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Strukturell information om hur basexcisionsreparationsenzymer tar bort DNA-lesioner i samband med kromatin har varit knapp. Detta utgör ett betydande gap i vår förståelse av de mekanismer som är involverade i etiologi av mänskliga sjukdomar. Den största fördelen med vårt protokoll är att vi har optimerat provberedning med standard laboratorieutrustning.Detta kommer att göra det möjligt för andra biokemister inom området att komplettera sitt biokemiska arbete med tekniskt genomförbara kryo-EM-studier. Vårt protokoll kan dessutom användas för att undersöka hur andra faktorer, inklusive pionjärtranskriptionsfaktorer, engagerar nukleosomen. Detta är ett område där strukturell information också har varit begränsad.Att optimera provberedningen innan vi gick vidare till frysförhållandena var nyckeln till att föra vårt projekt framåt, och detta görs bäst med standard biokemiska analyser i substratdesign, bindning och tvärbindningsförhållanden. Börja med att inkubera NCP och DNA-reparationsfaktorn av intresse på is i 15 minuter med en optimal buffert för det specifika komplexet. Tillsätt sedan glutaraldehyd till en slutlig koncentration av 0,005%Efter att ha blandat det väl, inkubera vid rumstemperatur i 13 minuter.Släck med en molar Tris-CL till en slutlig koncentration av 20 millimolar Tris-CL med pH 7,5. Koncentrera sedan till cirka 50 mikroliter och byt ut bufferten mot frysbuffert med en avsaltningskolonn. Därefter bestämmer absorbanserna vid optisk densitet 280 och 260 nanometer och koncentrerar dig ytterligare om det behövs för att nå 1,3 till 3 milligram per milliliter baserat på optisk densitet 280 nanometer.Efter att dialysknappen förberetts, placera knappen som innehåller provet ovanpå en polyetylenglykolbädd med membranet nedåt. För att utföra reningen genom storleksuteslutningskromatografi, tvätta och balansera en storleksuteslutningskolonn med 60 ml destillerat vatten, följt av 80 ml frysbuffert över natten med en hastighet av 0,4 ml per minut. Analysera sedan omedelbart toppfraktionerna och koncentrera de fraktioner som innehåller histons infusionsprotein MBP-PolBeta-APE1.Att demonstrera följande procedurer kommer att vara Elizabeth Viverette, en post-baccalaureatpraktikant från kryo-EM-kärnan här i NIH. När du har slagit på dykfrysen och fyllt luftfuktaren med 50 ml destillerat vatten, ställ in kammartemperaturen på 22 grader Celsius och fuktighet till 98%Placera sedan etankoppen och flytande kvävekoppen i respektive utrymmeshållare. Täck sedan etankoppen med etanlockdispensern och häll försiktigt flytande kväve över den samtidigt som du fyller kvävekoppen med flytande kväve.När den flytande kvävenivån har stabiliserats och når 100%och temperaturen når minus 180 grader Celsius, öppna försiktigt etanventilen och fyll etankoppen tills den bildar en bubbla på det klara locket. Ta sedan bort etandispensern. Placera två filterpapper på blottinganordningen och säkra dem med en metallring.Gå till inställningarna och ställ in blottingparametrarna som beskrivs i manuskriptet, välj sedan A-Plunge och klicka på OK. På huvudskärmen klickar du på Ladda pincett och laddar dem med ett rutnät med kolapplikationssidan vänd mot vänster. Kalibrera pincetten, justera Z-axeln för att säkerställa en solid fläck. Klicka på Nedre kammaren och applicera tre mikroliter av komplexet.Klicka sedan på Blot A-Plunge, som roterar gallret för att blotta framifrån och fryser det. Efter överföring, förvara gallret i gallerlådan i flytande kvävekammaren. När alla fyra galler har frusit och placerats i gallerlådan, vrid locket till neutralt läge där alla galler täcks av locket och dra åt skruven.Innan proverna laddas i mikroskopet, placera de förglasade gallren på en ring och säkra den med en C-klämma under flytande kväve i ett fuktkontrollerat rum för att undvika iskontaminering. När du laddar mikroskopet, sätt in gallret i en kassett med 12 slitsar. Blanda kassetten i en nanocab-kapsel och ladda den i autoladdaren.Överför sedan rutnätet från kassetten till mikroskopsteget. Justera scenen till eucentrisk höjd genom att vingla scenen 10 grader och samtidigt flytta Z-höjden tills minimal plan förskjutning observeras i bilderna. När den eucentriska höjden har uppnåtts, börja avbilda genom att ta en 3-by-3-montagebild av rutnätet där varje montage tas med 62x förstoring för att få atlasen.Efter att ha valt tre rutor av varierande storlekar och tagit den eucentriska höjden, bild vid 210x förstoring. När en fyrkant har avbildats väljer du ett hål vardera från kanten, mitten och däremellan inom rutorna. Avbilda sedan varje hål med 2 600x förstoring.Ta bilden med hög förstoring från mitten av hålet med 36 000x förstoring och vid 7,1 sekunders exponeringstid, 60 bilder, 1,18 pixelstorlek och tre mikrometer oskärpa. Se representativa bilder från screening. För att bestämma förhållandet mellan NCP och MBP-PolBeta-APE1 för att bilda stabilt komplex, utfördes elektroforetiska mobilitetsskiftanalyser, vilket visade ett enskilt skiftat band av NCP med femfaldigt molärt överskott av MBP-PolBeta-APE1.I mindre volym visade montering av komplexet av NCP-PolBeta-APE1 att provet var alltför tvärbundet och resulterade i aggregat utan urskiljbara enskilda komplex. Tiofaldig utspädning i NCP resulterade dock i signifikant minskad aggregering och förbättrad partikelstabilitet. De preparativa gel- och storleksuteslutningsmetoderna kan kombineras där preparativ gel förbättrar kvaliteten på NCP: erna när de innehåller en betydande mängd aggregat med hög molekylvikt, följt av rening av komplexet via storleksuteslutning.Resultaten visar att båda metoderna kan användas oberoende av varandra för att generera stabila komplex. Vidare visar data som samlats in från båda rutnäten nästan identiska tvådimensionella klasser och tredimensionella kartor med ungefär 3,2 ångströms upplösning. Ett optimalt förhållande mellan NCP och DNA-reparationsfaktor bör bestämmas först, sedan tvärbindning av komplexet med glutaraldehyd bör utföras minst 10 gånger mer utspädd än den koncentration som behövs för frysning.Efter att ha erhållit en kryo-EM 3D-karta över komplexet kommer ytterligare strukturell förfining att behövas för att bestämma hur DNA-reparationsfaktorn hittas och identifiera vilka regioner som är viktiga för dessa interaktioner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Snabb bestämning av antikropp-antigen affinitet genom Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snabb gallerförberedelse för tidsupp lös Cryo-Electron mikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Förberedelse av provstödsfilmer i transmissionselektronmikroskopi med hjälp av ett stödflötblock

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Förberedelse och Kryo-FIB mikromachining av Saccharomyces cerevisiae för Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Mikroskopi: Från prov till struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extrahera modifierade mikrotubuli från däggdjursceller för att studera mikrotubuli-proteinkomplex med kryoelektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Beläggning av CryoEM-rutnät med monolagergrafen för att förbättra förberedelsen av kryoprover

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Författare i fokus: Förbättra CryoEM-provberedning med hjälp av grafenmonolager på mikroskopigaller 

Tillämpning av monolagergrafen på kryoelektronmikroskopinät för högupplöst strukturbestämning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...