Name: preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination at JoVE.com

Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'ndeki cryo-EM çekirdeğinden Dr. Mario Borgnia'ya ve Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'nden Dr. Joshua Strauss'a kriyo-EM ızgara hazırlığındaki mentorlukları ve eğitimleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende'ye bu projenin ilk aşamalarındaki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Merhum Dr. Samuel H. Wilson ve laboratuvar üyelerinin, özellikle de Dr. Rajendra Prasad ve Dr. Joonas Jamsen'in genetik olarak kaynaşmış APE1-Polβ kompleksinin saflaştırılması için kilit katkılarını ve desteklerini takdir ediyoruz. Araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir [hibe numaraları Z01ES050158, Z01ES050159 ve K99ES031662-01].

1. Nükleozom çekirdek parçacıklarını tuz-gardient diyalizi yoluyla birleştirin
NOT: Yapısal çalışmalar için rekombinant histon proteinleri kullanılarak nükleozom çekirdek parçacıklarının hazırlanması, diğerleri tarafından ayrıntılı olarak tanımlanmıştır14,15,16. Diğerleri tarafından tanımlanan rekombinant X. laevis histonlarının ve histon okta...

<ol>
	<li>Ehrenhofer-Murray, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+at+DNA+replication,+transcription+and+repair.">Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.</a> European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).</li><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+mediated+interactions+in+the+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+1.9+a+resolution.">Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).</li><li>Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleosome+core+particle+containing+the+variant+histone+H2A.Z.">Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z.</a> Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).</li><li>Tachiwana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+centromeric+nucleosome+containing+CENP-A.">Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A.</a> Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).</li><li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+structure+and+function.">Nucleosome structure and function.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+acetylation+of+histone+H3+decreases+polymerase+beta+activity+on+nucleosome+core+particles+in+vitro.">Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).</li><li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+DNA+damage+in+chromatin:+Preparing+the+chromatin+landscape+for+base+excision+repair.">Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair.</a> DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).</li><li>Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+lysine+56+acetylation+enhances+AP+endonuclease+1-mediated+repair+of+AP+sites+in+nucleosome+core+particles.">Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles.</a> Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).</li><li>Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unencumbered+Pol+beta+lyase+activity+in+nucleosome+core+particles.">Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).</li><li>Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+location+of+DNA+lesions+in+nucleosome+core+particles+determines+accessibility+by+base+excision+repair+enzymes.">The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).</li><li>Olmon, E. D., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ability+of+five+DNA+glycosylases+to+recognize+and+repair+damage+on+nucleosomal+DNA.">Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA.</a> ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).</li><li>Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement+for+base+excision+repair+in+chromatin.">Rules of engagement for base excision repair in chromatin.</a> Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nucleosome+core+particle+from+recombinant+histones.">Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones.</a> Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).</li><li>McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+crystallization,+and+structure+determination+of+chromatin+enzyme/nucleosome+complexes.">Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes.</a> Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).</li><li>Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA+oligos+by+denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(PAGE).">Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).</a> Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).</li><li>Burgess, R. R. D., Murray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Protein Purification. 463, (2009).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+to+a+homo-oligomeric+scaffold+allows+cryo-EM+analysis+of+a+small+protein.">Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein.</a> Scientific Reports. 6, 30909 (2016).</li><li>Wu, X., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+determination+of+small+proteins+by+nanobody-binding+scaffolds+(Legobodies).">Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies).</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).</li><li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM.">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).</li><li>Takizawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+nucleosome+containing+the+ALB1+enhancer+DNA+sequence.">Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence.</a> Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).</li><li>Anderson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+recognition+of+ubiquitylated+nucleosome+by+Dot1L+methyltransferase.">Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase.</a> Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).</li></ol>

DNA onarım faktörünü saflaştırmak için özel bir protokol, ilgilenilen enzime bağlı olacaktır. Bununla birlikte, protein ekspresyonu ve saflaştırma için rekombinant yöntemlerin kullanılması da dahil olmak üzere bazı genel öneriler vardır18; İlgilenilen protein çok küçükse (<50 kDa), kriyo-EM ile yapı tayini, füzyon sistemleri19, nanogövde bağlayıcı iskeleler20 ve görüntüleme stratejilerinin optimize edilmesi<sup clas...

Ökaryotik DNA, histon proteinleri tarafından organize edilir ve sıkıştırılır ve kromatin oluşturur. Nükleozom çekirdek parçacığı (NCP), DNA onarımı, transkripsiyon ve replikasyon1 için DNA bağlayıcı proteinlere erişilebilirliği düzenleyen kromatinin temel tekrarlayan birimini oluşturur. NCP'nin ilk X-ışını kristal yapısı ilk olarak yirmi yıldan daha uzun bir süre önce çözülmüş olmasına rağmen2 ve NCP'nin daha birçok yapısı 3,4,5,6'dan beri yayınlanmış olmasına rağmen, nükleozomal substratlardaki DNA onarım mekanizmaları henüz tanımlanmamıştır. Kromatinde DNA onarımının altında yatan moleküler detayların ortaya çıkarılması, NCP'nin yerel yapısal özelliklerinin DNA onarım aktivitelerini nasıl düzenlediğini anlamak için katılımcı bileşenlerin yapısal karakterizasyonunu gerektirecektir. Bu, baz eksizyon onarımı (BER) bağlamında özellikle önemlidir, çünkü BER enzimleri ile yapılan biyokimyasal çalışmalar, kataliz için enzime özgü yapısal gereksinimlere ve DNA lezyonunun nükleozom içindeki yapısal konumuna bağlı olan nükleozomlarda benzersiz DNA onarım mekanizmaları önermektedir 7,8,9,10,11,12,13 . BER'in hayati bir DNA onarım süreci olduğu göz önüne alındığında, bu boşlukları doldurmaya ve aynı zamanda ilgili nükleozomal kompleksleri içeren diğer teknik olarak uygulanabilir yapısal çalışmaların gerçekleştirilebileceği bir başlangıç noktası oluşturmaya büyük ilgi vardır.
Cryo-EM, homojen numunenin büyük ölçekli hazırlanması zor olan komplekslerin üç boyutlu (3D) yapısını çözmek için hızla tercih edilen yöntem haline gelmektedir. Bir DNA onarım faktörü (NCP-DRF) ile kompleksleştirilmiş NCP'lerin tasarımı ve saflaştırılması muhtemelen özel optimizasyon gerektirecek olsa da, kararlı bir NCP-DRF kompleksi oluşturmak ve dondurmak için burada sunulan prosedür, numunenin ve kriyo-EM ızgara hazırlığının nasıl optimize edileceği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Şekil 1'de gösterilen iki iş akışı (birbirini dışlamayan) ve protokoldeki belirli ayrıntılar kritik adımları tanımlar ve bu adımları optimize etmek için stratejiler sağlar. Bu çalışma, kromatin ve DNA onarım alanını, nükleozomal DNA onarımının moleküler mekanizmalarını daha iyi anlamak için biyokimyasalın yapısal çalışmalarla tamamlanmasının teknik olarak mümkün olduğu bir yönde ilerletecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES; pH 7.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>043398.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>491 prep cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1702926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z717185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoGrid Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EM GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1000 touch thermocycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-clips and rings</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>6640--6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>SCT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15370752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Tweezers</td>
			<td>Techni-Pro</td>
			<td>758TW0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA</td>
			<td>Integrated DNA techonologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEI Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>KRIOSG4TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC purification system</td>
			<td>AKTA Pure</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector Model 2110</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Boxes</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>PB-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Storage Accessory Pack</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>GSAX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Ethane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 3 peristaltic two-head pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6695BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10002M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (VWR) Low Retention</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solution (37.5:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4338-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PURX35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified recombinant DNA repair factor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant histone octamer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring clipping tools</td>
			<td>SubAngostrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column 10/300</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Talos Arctica 200 kV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15514011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mark IV System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter paper (55 mM)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1005-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>440700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of nucleosome core particles complexed with dna repair factors for cryo-electron microscopy structural determination

Kromatin bağlamında DNA onarımı tam olarak anlaşılamamıştır. Kromatinin temel tekrarlayan birimi olan nükleozom çekirdek parçacıklarını kullanan biyokimyasal çalışmalar, çoğu DNA onarım enziminin DNA hasarını serbest DNA'ya kıyasla daha düşük oranlarda giderdiğini göstermektedir. Baz eksizyon onarımı (BER) enzimlerinin nükleozomlardaki DNA hasarını nasıl tanıdığı ve giderdiğine dair moleküler detaylar açıklığa kavuşturulmamıştır. Bununla birlikte, nükleozomal substratların biyokimyasal BER verileri, nükleozomun DNA lezyonunun ve enzimin konumuna bağlı olarak farklı yapısal bariyerler sunduğunu göstermektedir. Bu, serbest DNA'daki DNA hasarını gidermek için bu enzimler tarafından kullanılan mekanizmaların, nükleozomlarda kullanılanlardan farklı olabileceğini göstermektedir. Genomik DNA'nın çoğunluğunun nükleozomlara monte edildiği göz önüne alındığında, bu komplekslerin yapısal bilgisine ihtiyaç vardır. Bugüne kadar, bilimsel topluluk, bu komplekslerin teknik olarak uygulanabilir yapısal çalışmalarını gerçekleştirmek için ayrıntılı protokollerden yoksundur. Burada, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) yapısal tayini için nükleozomun giriş-çıkışına yakın tek bir nükleotid boşluğuna bağlı iki genetik olarak kaynaşmış BER enziminden (Polimeraz β ve AP Endonükleaz1) oluşan bir kompleks hazırlamak için iki yöntem sunuyoruz. Her iki numune hazırlama yöntemi de daldırma dondurma yoluyla kaliteli ızgaraları vitrifiye etmek için uyumludur. Bu protokol, farklı BER faktörleri, öncü transkripsiyon faktörleri ve kromatin modifiye edici enzimlere sahip diğer nükleozomal kompleksleri hazırlamak için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir.

MBP-Polβ-APE1'in rekombinant füzyon proteini ile bir kompleks yapmak için uygun şekilde monte edilmiş NCP'ler (Şekil 2) kullanıldı (Şekil 3). NCP'nin MBP-Polβ-APE1'e oranını kararlı bir kompleks oluşturmak için belirlemek için, NCP'nin MBP-Polβ-APE1'in 5 kat azı dişi fazlalığı ile tek başına kaymış bir bandını gösteren elektroforetik hareketlilik kayma testleri (EMSA) (Şekil 4) gerçekleştirdik. Bu kom...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination at JoVE.com

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Bu protokol, TEM ızgaralarının dondurulması için iki numune hazırlama yöntemi kullanılarak nükleozomal komplekslerin hazırlanmasını ayrıntılı olarak özetlemektedir.

Kriyo-Elektron Mikroskobu Yapısal Tayini için DNA Onarım Faktörleri ile Komplekslenmiş Nükleozom Çekirdek Parçacıklarının Hazırlanması

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Baz eksizyon onarım enzimlerinin kromatin bağlamında DNA lezyonlarını nasıl çıkardığına dair yapısal bilgiler azdır. Bu, insan hastalıklarının etiyolojisinde rol oynayan mekanizmaları anlamamızda önemli bir boşluk oluşturmaktadır. Protokolümüzün temel avantajı, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanarak numune hazırlamayı optimize etmiş olmamızdır.Bu, alandaki diğer biyokimyacıların biyokimyasal çalışmalarını teknik olarak uygulanabilir kriyo-EM çalışmaları ile tamamlamalarını sağlayacaktır. Protokolümüz, öncü transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere diğer faktörlerin nükleozomu nasıl etkilediğini araştırmak için de kullanılabilir. Bu, yapısal bilginin de sınırlı olduğu bir alandır.Dondurma koşullarına geçmeden önce numune hazırlamayı optimize etmek, projemizi ileriye taşımanın anahtarıydı ve bu en iyi şekilde substrat tasarımı, bağlama ve çapraz bağlama koşullarında standart biyokimyasal analizlerle yapılır. Başlamak için, NCP'yi ve ilgilenilen DNA onarım faktörünü, spesifik kompleks için en uygun tamponu kullanarak 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra,% 0.005'lik bir son konsantrasyona glutaraldehit ekleyinİyice karıştırdıktan sonra, oda sıcaklığında 13 dakika boyunca inkübe edin.Bir molar Tris-CL ile pH 7.5 ile 20 milimolar Tris-CL'nin son konsantrasyonuna kadar söndürün. Daha sonra, yaklaşık 50 mikrolitreye konsantre edin ve tamponu bir tuzdan arındırma sütunu kullanarak dondurma tamponu ile değiştirin. Daha sonra, optik yoğunluk 280 ve 260 nanometredeki absorbansları belirleyin ve optik yoğunluk 280 nanometreye dayanarak mililitre başına 1.3 ila 3 miligrama ulaşmak için gerekirse daha fazla konsantre olun.Diyaliz düğmesini hazırladıktan sonra, numuneyi içeren düğmeyi, membran aşağı bakacak şekilde bir polietilen glikol yatağının üzerine yerleştirin. Boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırmayı gerçekleştirmek için, bir boyut dışlama sütununu 60 mililitre damıtılmış su ile yıkayın ve dengeleyin, ardından dakikada 0,4 mililitre oranında gece boyunca 80 mililitre dondurma tamponu izleyin. Ardından, tepe fraksiyonlarını hemen analiz edin ve histonun infüzyon proteini MBP-PolBeta-APE1'i içeren fraksiyonları konsantre edin.Aşağıdaki prosedürleri gösteren, NIH'deki cryo-EM çekirdeğinden bir bakalorya sonrası stajyer olan Elizabeth Viverette olacaktır. Daldırma dondurucuyu açtıktan ve nemlendiriciyi 50 mililitre damıtılmış suyla doldurduktan sonra, oda sıcaklığını 22 santigrat dereceye ve nemi% 98'e ayarlayınDaha sonra etan kabını ve sıvı azot kabını ilgili alan tutuculara yerleştirin. Daha sonra, etan kabını etan kapağı dağıtıcısı ile örtün ve azot kabını sıvı azotla doldururken üzerine dikkatlice sıvı azot dökün.Sıvı azot seviyesi stabilize edildiğinde ve% 100'e ulaştığında ve sıcaklık eksi 180 santigrat dereceye ulaştığında, etan valfini dikkatlice açın ve etan kabını şeffaf kapakta bir kabarcık oluşturana kadar doldurun. Ardından etan dağıtıcısını çıkarın. Kurutma cihazına iki filtre kağıdı yerleştirin ve bunları metal bir halka ile sabitleyin.Kuruluma gidin ve makalede açıklandığı gibi lekeleme parametrelerini ayarlayın, ardından A-Plunge'u seçin ve Tamam'a tıklayın. Ana ekranda, Forseps Yükle'ye tıklayın ve karbon uygulama tarafı sola bakacak şekilde bir ızgara ile yükleyin. Forsepsleri kalibre edin, katı bir leke sağlamak için Z eksenini ayarlayın. Alt Oda'ya tıklayın ve kompleksin üç mikrolitresini uygulayın.Ardından, ızgarayı önden lekelemek için döndürecek ve daldırıp donduracak olan Blot A-Plunge'a tıklayın. Aktardıktan sonra, ızgarayı sıvı azot odasındaki ızgara kutusunda saklayın. Dört ızgaranın tümü dondurulduğunda ve ızgara kutusuna yerleştirildiğinde, kapağı tüm ızgaraların kapakla kaplandığı nötr konuma döndürün ve vidayı sıkın.Numuneleri mikroskopa yüklemeden önce, vitrifiye ızgaraları bir halka üzerine yerleştirin ve buz kontaminasyonunu önlemek için nem kontrollü bir odada sıvı azot altında bir C-klipsi kullanarak sabitleyin. Mikroskopu yüklerken, ızgaraları 12 yuvalı bir kasete yerleştirin. Kaseti bir nanocab kapsülüne karıştırın ve otomatik yükleyiciye yükleyin.Ardından, ızgarayı kasetten mikroskop aşamasına aktarın. Sahneyi 10 derece sallayarak ve aynı anda görüntülerde minimum düzlemsel kayma gözlenene kadar Z yüksekliğini hareket ettirerek sahneyi ösentrik yüksekliğe ayarlayın. Ösentrik yüksekliğe ulaşıldığında, atlası elde etmek için her montajın 62x büyütmede çekildiği ızgaranın 3'e 3 montaj görüntüsünü alarak görüntülemeye başlayın.Farklı boyutlarda üç kare seçtikten ve ösantrik yüksekliği aldıktan sonra, 210x büyütmede görüntü. Bir kare görüntülendikten sonra, karelerin kenarından, ortasından ve aralarından birer delik seçin. Ardından, her deliği 2.600x büyütmede görüntüleyin.Yüksek büyütmeli görüntüyü deliğin ortasından 36.000x büyütmede ve 7,1 saniye pozlama süresinde, 60 karede, 1,18 piksel boyutunda ve üç mikrometre bulanıklaştırmada çekin. Gösterimin temsili görüntülerine bakın. NCP'nin MBP-PolBeta-APE1'e oranını kararlı kompleks oluşturmak için belirlemek için, beş kat MBP-PolBeta-APE1 azı dişi fazlalığı ile NCP'nin tek tek kaydırılmış bir bandını gösteren elektroforetik hareketlilik kayma testleri yapıldı.Daha küçük hacimde, NCP-PolBeta-APE1 kompleksinin montajı, numunenin aşırı çapraz bağlı olduğunu ve fark edilebilir bireysel kompleksleri olmayan agregalarla sonuçlandığını göstermiştir. Bununla birlikte, NCP'lerde on kat seyreltme, agregasyonun önemli ölçüde azalmasına ve parçacık stabilitesinin iyileştirilmesine neden olmuştur. Hazırlayıcı jel ve boyut dışlama yöntemleri, preparatif jelin önemli miktarda yüksek moleküler ağırlıklı agrega içerdiklerinde NCP'lerin kalitesini arttırdığı ve ardından kompleksin boyut dışlama yoluyla saflaştırılması ile birleştirilebilir.Sonuçlar, her iki yöntemin de kararlı kompleksler oluşturmak için bağımsız olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, her iki ızgaradan toplanan veriler, yaklaşık 3.2-angstrom çözünürlükte neredeyse aynı iki boyutlu sınıfları ve üç boyutlu haritaları göstermektedir. Önce NCP'nin DNA onarım faktörüne optimal bir oranı belirlenmeli, daha sonra kompleksin glutaraldehit ile çapraz bağlanması, donma için gereken konsantrasyondan en az 10 kat daha seyreltik yapılmalıdır.Kompleksin bir kriyo-EM 3D haritası elde edildikten sonra, DNA onarım faktörünün nasıl bulunduğunu belirlemek ve bu etkileşimler için hangi bölgelerin önemli olduğunu belirlemek için daha fazla yapısal iyileştirmeye ihtiyaç duyulacaktır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Biyokimya

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Kitle Fotometrisi ile Antikor-Antijen Affinitesinin Hızlı Tayini

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Zaman Çözümlü Cryo-Elektron Mikroskopisi için Hızlı Şebeke Hazırlığı

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Destek Yüzdürme Bloğu Kullanılarak İletim Elektron Mikroskopisinde Numune Destek Filmlerinin Hazırlanması

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Kriyo-Elektron Mikroskobu ile Mikrotübül Protein Komplekslerini İncelemek için Memeli Hücrelerinden Modifiye Mikrotübüllerin Çıkarılması

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Kriyo Numune Hazırlamayı İyileştirmek için CryoEM Izgaralarının Tek Katmanlı Grafen ile Kaplanması

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Yazar Spotlight: Mikroskopi Izgaralarında Grafen Tek Tabaka Kullanarak CryoEM Numune Hazırlamanın Geliştirilmesi 

Yüksek Çözünürlüklü Yapı Belirleme için Tek Katmanlı Grafenin Kriyo-Elektron Mikroskobu Izgaralarına Uygulanması

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...