Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من خلال منح بحثية من المعاهد الوطنية للصحة إلى JHR (#R01 5R01HD081266 و #R01GM141493). تم توفير بعض السلالات من قبل CGC ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية البحثية (P40 OD010440). نود أن نعرب عن تقديرنا لبراديب جوشي (UCSB) على مدخلاته التحريرية. استشارة إحصائية مقدمة من مختبر بيانات UCSB.

السلالات المستخدمة في هذه الدراسة هي C. elegans (N2) و C. briggsae (AF16) (انظر جدول المواد). تم استخدام مجموعة مختلطة من الجنسين من dauers لكل فحص.
1. إعداد الغرفة
<ol><li>العمل في غطاء الدخان. قم بإعداد مساحة العمل باستخدام موقد بنسن و 1-2 شفرات حلاقة وكماشة وملاقط وسط?...

<ol>
	<li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+for+human+balance+control.">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li><li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates.">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).</li><li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors.">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li><li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis.">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li><li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway.">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391 (2014).</li><li>Fr&#233;zal, L., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+outside+the+Petri+dish.">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans,+is+regulated+by+IL2+neurons.">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li><li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae.">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li><li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans.">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>H&#228;der, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitaxis+in+Euglena.">Gravitaxis in Euglena.</a> Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston's+organ.">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li><li>Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis.">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+chemotaxis+assay.">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans.">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493 (2015).</li><li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals.">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae.">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).</li><li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+dauer+larvae.">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li><li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn's+test.">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li><li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+a+sensible+model+for+sensory+biology.">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li><li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li><li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound.">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li><li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans.">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).</li><li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans.">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).</li><li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels.">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li><li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron.">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).</li><li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear.">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li><li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+the+vestibular+system.">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li><li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+vestibular+syndromes.">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li><li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders.">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).</li><li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hearing+and+balance.">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567 (2019).</li></ol>

مقارنة مع الطرق السابقة على عكس التاكسي الكيميائي ، لا يمكن ملاحظة محور الجاذبية في Caenorhabditis بشكل موثوق باستخدام تصميم تجريبي تقليدي للوحة أجار. يبلغ قطر طبق بتري القياسي 150 مم ، مما يؤدي إلى توفر 75 مم فقط في أي من الاتجاهين ل dauers لإظهار تفضيل محور الجاذبية. على الرغم من أنه ي?...

يعد استشعار جاذبية الأرض أمرا بالغ الأهمية لتوجيه العديد من الكائنات الحية وحركتها وتنسيقها وتوازنها. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية والدوائر العصبية للإحساس بالجاذبية غير مفهومة بشكل جيد مقارنة بالحواس الأخرى. في الحيوانات ، يتفاعل الإحساس بالجاذبية مع المحفزات الأخرى ويمكن التغلب عليها للتأثير على السلوك. يمكن دمج الإشارات البصرية وردود الفعل الحسية والمعلومات الدهليزية لتوليد شعور بالوعي بالجسم بالنسبة إلى محيط الحيوان 1,2. على العكس من ذلك ، يمكن تغيير تفضيل الجاذبية في وجود محفزات أخرى 3,4,5. لذلك ، يعد السلوك الثقالي مثاليا لدراسة الإحساس بالجاذبية وفهم التكامل الحسي المعقد للجهاز العصبي واتخاذ القرارات.
C. elegans هو كائن حي نموذجي مفيد بشكل خاص لدراسة محور الجاذبية بسبب دورة حياته متعددة الفينات. عند التعرض للضغوطات أثناء التطور ، بما في ذلك الحرارة أو الاكتظاظ أو نقص الطعام ، تتطور يرقات C. elegans إلى dauers ، وهي مقاومة للإجهاد للغاية6. تؤدي الديدان سلوكيات مميزة ، مثل النيكتيشن ، حيث "تقف" الديدان على ذيولها وتلوح برؤوسها ، والتي قد تسهل الانتشار إلى موائل أفضل7. تشير فحوصات Gravitaxis ل C. elegans و C. japonica إلى أن يرقات dauer تجاذب بشكل سلبي ، وأن هذا السلوك يتم ملاحظته بسهولة أكبر في dauers منه في البالغين 8,9. قد يكشف اختبار محور الجاذبية في سلالات التهاب Caenorhabditis الأخرى عن تباين طبيعي في السلوك الثقالي.
تم تمييز آليات الإحساس بالجاذبية في Euglena و Drosophila و Ciona وأنواع أخرى مختلفة باستخدام مقايسات الجاذبية3،10،11. وفي الوقت نفسه ، قدمت دراسات محور الجاذبية في Caenorhabditis في البداية نتائج مختلطة. وجدت دراسة للتفضيل التوجيهي C. elegans أن الديدان تتجه مع رؤوسها لأسفل في المحلول ، مما يشير إلى تفضيل إيجابي للجاذبية12. وفي الوقت نفسه ، على الرغم من أن C. japonica dauers تم تحديده في وقت مبكر على أنه سلبيالجاذبية 8 ، إلا أن هذا السلوك لم يتم وصفه إلا مؤخرا في C. elegans9. تنشأ العديد من التحديات في تطوير اختبار محور الجاذبية التمثيلي في الديدان. يتم الحفاظ على سلالات Caenorhabditis على لوحات أجار. لهذا السبب ، تستخدم الفحوصات السلوكية عادة لوحات أجار كجزء من تصميمها التجريبي13،14،15. تم إجراء أول فحص لمحور الجاذبية المبلغ عنه في Caenorhabditis عن طريق وضع لوحة على جانبها بزاوية 90 درجة إلى لوحة التحكم الأفقية8. ومع ذلك ، فإن سلوك محور الجاذبية ليس دائما قويا في ظل هذه الظروف. في حين يمكن فحص الديدان البالغة للتفضيل التوجيهي في الحل12 ، قد يكون هذا التفضيل الاتجاهي معتمدا أيضا على السياق ، مما يؤدي إلى سلوكيات مختلفة إذا كانت الديدان تزحف بدلا من السباحة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن C. elegans حساسة للمحفزات الأخرى ، بما في ذلك الضوء والمجالات الكهرومغناطيسية 16,17 ، والتي تتداخل مع استجاباتها للجاذبية9. لذلك ، فإن فحص محور الجاذبية المحدث الذي يحمي من المتغيرات البيئية الأخرى مهم لتشريح آليات هذه العملية الحسية.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف فحص لمراقبة Caenorhabditis gravitaxis. يعتمد الإعداد لهذه الدراسة جزئيا على طريقة تم تطويرها لدراسة السلامة العصبية العضلية18,19. يتم استزراع يرقات داور وعزلها باستخدام الإجراءات القياسية20. ثم يتم حقنها في غرف مصنوعة من ماصتين مصليتين سعة 5 مل مملوءتين بالأجار. يمكن توجيه هذه الغرف عموديا أو أفقيا ووضعها داخل قفص فاراداي مظلم لمدة 12-24 ساعة للحماية من الضوء والمجالات الكهرومغناطيسية. يتم تسجيل موقع كل دودة في الغرف ومقارنتها بسيارات الأجرة الرأسية لسلالة مرجعية مثل C. elegans N2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

الإحساس بالجاذبية هو عملية مهمة وغير مدروسة نسبيا. استشعار الجاذبية يمكن الحيوانات من التنقل في محيطها ويسهل الحركة. بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط الإحساس بالجاذبية ، الذي يحدث في الأذن الداخلية للثدييات ، ارتباطا وثيقا بالسمع - وبالتالي ، فإن فهم هذه العملية له آثار على الأبحاث السمعية والدهليزية. توجد اختبارات Gravitaxis لبعض الكائنات الحية النموذجية ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة. تم فحص الديدان المفردة سابقا لتفضيل اتجاهها أثناء استقرارها في المحلول. ومع ذلك ، لم يتم وصف فحص موثوق وقوي لمحور الجاذبية Caenorhabditis . يحدد هذا البروتوكول إجراء لإجراء مقايسات محور الجاذبية التي يمكن استخدامها لاختبار المئات من كاورات Caenorhabditis في وقت واحد. يسمح هذا الفحص الواسع النطاق لمسافات طويلة بجمع بيانات مفصلة ، والكشف عن الأنماط الظاهرية التي قد يتم تفويتها في الفحص القياسي القائم على اللوحة. تتم مقارنة حركة داور على طول المحور الرأسي مع عناصر التحكم الأفقية لضمان أن التحيز الاتجاهي يرجع إلى الجاذبية. يمكن بعد ذلك مقارنة تفضيل الجاذبية بين السلالات أو الظروف التجريبية. يمكن لهذه الطريقة تحديد المتطلبات الجزيئية والخلوية والبيئية لمحور الجاذبية في الديدان.

مقارنة محور الجاذبية عبر الأنواع باتباع الإجراء الموضح أعلاه ، يمكن مقارنة محور الجاذبية C. briggsae dauer مع محور الجاذبية C. elegans والضوابط الأفقية. يميل التوزيع الرأسي (المارون) ل C. briggsae dauers نحو قمم الغرف ، مع وصول نسبة كبيرة من الديدان إلى +7 (الشكل 2A). على ...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

يحدد هذا البروتوكول طرق إجراء فحص محور الجاذبية على نطاق واسع باستخدام يرقات Caenorhabditis dauer. يسمح هذا البروتوكول بالكشف بشكل أفضل عن سلوك محور الجاذبية مقارنة بالفحص القائم على اللوحة.

فحص Gravitaxis على نطاق واسع من يرقات Caenorhabditis Dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

يمكن استخدام هذا الفحص عالي الإنتاجية لمراقبة سلوك الجاذبية القوي في يرقات caenorhabditis dauer. لوحظ سلوك الدودة على مسافات كبيرة مقارنة بالفحوصات التي أجريت على طبق بتري. هذا يعزز حساسية الفحص ويسمح بتحليل البيانات التفصيلية.يمكن أن توفر دراسة سلوك محور الجاذبية نظرة ثاقبة حول كيفية حدوث الإحساس بالجاذبية في التهاب كاينورهابديتيس ، والذي له صلة بفهم النظام الدهليزي للثدييات. يتطلب إنشاء غرف فحص محور الجاذبية ، وعزل الداورز ، وحقن الديدان في الغرف ممارسة. يمكنك توفير الوقت عن طريق عزل dauers وإنشاء الغرف قبل يوم واحد.ابدأ بإعداد موقد بنسن ، وشفرة حلاقة واحدة إلى شفرتين ، وكماشة ، وملاقط ، وسطح قطع بلاستيكي ، وغطاء دخان. لإنشاء غرفة ، اجمع ماصتين مصليتين سعة 5 ملليلتر ، ومع ملاقط ، قم بإزالة قابس القطن من ماصة واحدة. أمسك شفرة حلاقة باستخدام كماشة فوق موقد بنسن حتى يسخن.استخدم الشفرة المسخنة لتقطيع الطرف المدبب من الماصة الثانية بحيث يكون للماصة بأكملها قطر موحد. الآن ، بسرعة جلب اثنين من نهايات ماصة معدلة بالقرب من اللهب وتذوب لهم قليلا. انضم إلى هذه النهايات عن طريق الضغط عليها معا بإحكام ، مما يضمن استمرار جدران كلا الماصتين.إذا كانت هناك أي فجوات مرئية بعد الانضمام ، فقم بتقسيمها وكرر هذه الخطوة. تحضير NGM مع 4٪ أجار وفقا لإجراءات الدودة القياسية وملء كل غرفة عن طريق إرفاقها بماصة مصلية بينما لا يزال الأجار منصهرا. لتقليل أي اختلافات في اتساق الأجار بسبب التبريد غير المتساوي ، أمسك الماصة بالتوازي مع سطح المقعد أثناء إعداد الأجار.ثم ارسم المحلول ببطء وأغلق الطرف باستخدام parafilm قبل إزالة الغرفة من جهاز السحب. ضع الغرفة بشكل مسطح لتبرد واترك الأجار يتصلب قبل التحرك. بمجرد تبريده ، قم بتسخين مفتاح سداسي عشري بطول ثلاثة ملليمترات فوق موقد بنسن وإنشاء فتحة بلاستيكية صغيرة عن طريق الضغط عليه بقوة في جدار كل غرفة حوالي خمسة ملليمترات إلى جانب واحد من خط الوسط.بعد ذلك ، استخدم شفرة ساخنة لإزالة القطن والنهايات المدببة للغرفة وختم النهايات بفيلم البارافين. قبل 10 إلى 15 يوما من التجربة ، قم بتقطيع كل سلالة على لوحين إلى ثلاثة ألواح NGM كبيرة مع بكتيريا OP50 ولف فيلم البارافين. جمع الديدان عن طريق شطف الأغطية والألواح باستخدام M9 Buffer وسحب المحلول إلى أنابيب طرد مركزي 15 ملليلتر.قم بتكوير الديدان عن طريق الدوران بسرعة 1600 × G لمدة 30 إلى 60 ثانية في درجة حرارة الغرفة وشفط معظم M9 Buffer باستخدام ماصة أو شفاط فراغ. أضف سبعة ملليلترات من محلول كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 1٪ إلى كل حبيبة دودة واترك الديدان فيها لمدة 30 دقيقة. للسماح بالتهوية ، استمر في تدوير الأنابيب باستمرار خلال هذا الوقت.ثم قم بإزالة المنظف عن طريق شطفه ثلاث إلى خمس مرات باستخدام M9. بعد إضافة خمسة ملليلترات M9 ، أضف خمسة ملليلترات من محلول السكروز المصفى على البارد بنسبة 60٪. اخلطي جيدا واصنعي تدرج فصل عن طريق الطرد المركزي عند 1600 × G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. املأ أنابيب الطرد المركزي الجديدة سعة 15 ملليلتر بملليلترين من M9 Buffer.الآن سحق نهايات ماصات باستور الزجاجية لتوسيع التجويف. واستخدم هذه الماصات لنقل الطبقة العليا من المحلول من تدرج السكروز إلى الأنابيب الجديدة. اشطف الداورز ثلاث إلى خمس مرات باستخدام M9 Buffer.تعمل أجهزة الطرد المركزي على 1600 × G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتستنشق معظم محلول M9 باستخدام ماصة أو شفاط فراغ. بعد ذلك ، قم بتقدير كثافة الدودة عن طريق حساب عدد الديدان يدويا في ثلاث قطرات منفصلة من 1 ميكرولتر تحت مجهر تشريح ، واستخدم متوسط هذه الأعداد لتقريب عدد الديدان لكل ميكرولتر. الآن قم بتوسيع تجويف الطرف عن طريق قطع نهاية أطراف ماصة 10 أو 20 أو 200 ميكرولتر.اضبط الماصة الدقيقة على حجم أكبر قليلا من حجم الطموح المقصود. استنشاق ما يقرب من 1 إلى 2 ميكرولتر من محلول الدودة المركزة والسماح لكمية صغيرة من الهواء بدخول الطرف. ادفع طرف الماصة برفق إلى الآجار مع تثبيط الماصة الصغيرة.سيؤدي ذلك إلى إنشاء موقع حقن دون انسداد الطرف. أطلق الديدان في الأجار واستخدم فيلم البارافين لإغلاق الفتحة. للقضاء على أكبر عدد ممكن من المتغيرات بمجرد وضع الغرف داخل قفص فاراداي مظلم في درجة حرارة الغرفة ، قم بتسمية كل غرفة وتعليقها عموديا داخل قفص فاراداي .اختبر الضوابط الأفقية في وقت واحد عن طريق وضع بعض الغرف مسطحة داخل نفس الظروف البيئية. ثم استخدم ديدان N2 الموجهة رأسيا كعنصر تحكم إيجابي وغرف موجهة أفقيا تحتوي على Dauers N2 كعنصر تحكم سلبي إضافي ضد السلالات التجريبية. بعد بضع ساعات ، تبدأ ديدان dauer في التشتت من موقع البداية وتستغرق عدة ساعات للوصول إلى طرفي الغرفة.اترك الغرف دون إزعاج خلال هذا الوقت وسجل في غضون 12 إلى 24 ساعة بعد الحقن. بعد ذلك ، قم بإزالة الغرف واحدة تلو الأخرى وسجل محور الجاذبية من خلال البحث عن dauers الحية تحت مجهر تشريح ووضع علامات على مواقعها بالحبر. لا تسجل الديدان في حدود 2.5 سم على جانبي موقع الحقن لأن هذه الديدان من غير المحتمل أن تظهر تفضيلا اتجاهيا.أيضا ، تجنب تسجيل الديدان التي تبدو ميتة أو محاصرة في السائل وتخلص من أي غرف تحتوي على أكثر من 50٪ من الديدان الميتة أو السباحة. لتحديد النتائج كميا، استخدم علامة لتقسيم كل نصف من الغرفة إلى سبعة 3.5 سم، بدءا من 2.5 سم بعيدا عن موقع الحقن. استخدم عداد إحصاء يدوي لإحصاء عدد الديدان التي لوحظت في كل قسم.في caenorhabditis briggsae ، أظهرت نسبة كبيرة من ديدان داوير هجرة نحو الجزء العلوي من الغرف. ومع ذلك ، أظهرت الضوابط الأفقية توزيعا حول مركز الغرف ، مما يشير إلى سلوك الجاذبية السلبي. أيضا ، لم تظهر التوزيعات الرأسية ل caenorhabditis briggsae و caenorhabditis elegans أي فرق مما يشير إلى أن caenorhabditis briggsae dauers تظهر سلوكا سلبيا لمحور الجاذبية مشابها ل caenorhabditis elegans dauers.لا تستخدم العوامل المشلولة مثل أزيد الصوديوم في هذا البروتوكول. لذلك ، من المهم تسجيل غرف محور الجاذبية بمجرد إزالتها من قفص فاراداي. أدى هذا الفحص إلى اكتشاف سلوك محور الجاذبية السلبي في c.elegans.من خلال اختبار العديد من السلالات الطافرة ، كشفت أيضا عن المتطلبات الوراثية والعصبية لمحور الجاذبية في الديدان.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

غير المتماثلة ممشى: رواية السلوكية الفحص لدراسة غير المتماثلة الحركة

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

التحليل الآلي من النيماتودا القائم على السكان الحسية الكيميائية تفضيل التفضيل

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

التنميط المضادة لل Neu5Gc مفتش في المصل البشري مع سيالوغليكان ميكروأري الفحص

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

مقايسة بسيطة ومنخفضة التكلفة لقياس أمبوليشن في نماذج الماوس من ضمور العضلات

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

"مقايسة" Burrowing/النفقي "الكشف عن نقص" في اليرقات melanogaster المورفولوجية

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

الشلل الناجم عن السباحة "تقييم إشارات الدوبامين" في ايليجانس كاينورهابديتيس

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

تصوير الكالسيوم في سلوك حر Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه بشكل جيد

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

فحص محسن وأدوات لقياس النوسسيبل الميكانيكي في يرقات دروسوفيليا

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

تحليل مقارن للطرق التجريبية لقياس النشاط الحيواني في نماذج Elegans Caenorhabditis من مرض الميتوكوندريا

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A عالية الإنتاجية ميكروبليت المغذية المقايسة للقياس الكمي للاستهلاك في Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...