Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af forskningsbevillinger fra National Institutes of Health til JHR (#R01 5R01HD081266 og #R01GM141493). Nogle stammer blev leveret af CGC, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi vil gerne anerkende Pradeep Joshi (UCSB) for hans redaktionelle input. Statistisk konsultation leveret af UCSB DATALAB.

De stammer, der anvendes i denne undersøgelse, er C. elegans (N2) og C. briggsae (AF16) (se materialeoversigt). En blandet køn population af dauers blev brugt til hver analyse.
1. Forberedelse af kammeret
<ol><li>Arbejd i en røghætte. Indstil arbejdsområdet med en Bunsen-brænder, 1-2 barberblade, tang, pincet og en plastskæreflade (se Materialetabel).</li>
	<li>For hvert kammer samles to 5 ml serologiske pipetter. Fj...

<ol>
	<li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+for+human+balance+control.">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li><li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates.">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).</li><li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors.">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li><li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis.">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li><li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway.">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391 (2014).</li><li>Fr&#233;zal, L., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+outside+the+Petri+dish.">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans,+is+regulated+by+IL2+neurons.">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li><li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae.">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li><li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans.">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>H&#228;der, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitaxis+in+Euglena.">Gravitaxis in Euglena.</a> Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston's+organ.">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li><li>Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis.">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+chemotaxis+assay.">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans.">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493 (2015).</li><li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals.">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae.">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).</li><li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+dauer+larvae.">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li><li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn's+test.">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li><li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+a+sensible+model+for+sensory+biology.">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li><li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li><li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound.">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li><li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans.">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).</li><li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans.">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).</li><li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels.">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li><li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron.">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).</li><li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear.">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li><li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+the+vestibular+system.">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li><li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+vestibular+syndromes.">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li><li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders.">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).</li><li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hearing+and+balance.">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567 (2019).</li></ol>

Sammenligning med tidligere metoder I modsætning til kemotaxis kan gravitaxis i Caenorhabditis ikke pålideligt observeres ved hjælp af et traditionelt agarpladeeksperimentelt design. En standard petriskål er 150 mm i diameter, hvilket resulterer i, at der kun er 75 mm til rådighed i begge retninger for dauers at demonstrere gravitaxispræference. Selvom C. elegans orienteringspræference kan analyseres i opløsning12, er denne metode lav gennemstrømning,...

At mærke Jordens tyngdekraft er afgørende for mange organismers orientering, bevægelse, koordination og balance. Imidlertid er de molekylære mekanismer og neurokredsløb af tyngdekraftsfornemmelse dårligt forstået sammenlignet med andre sanser. Hos dyr interagerer tyngdekraftsfornemmelsen med og kan udkonkurreres af andre stimuli for at påvirke adfærd. Visuelle signaler, proprioceptiv feedback og vestibulær information kan integreres for at skabe en følelse af kropsbevidsthed i forhold til et dyrs omgivelser 1,2. Omvendt kan gravitaktisk præference ændres i nærværelse af andre stimuli 3,4,5. Derfor er gravitaktisk adfærd ideel til at studere tyngdekraftsfornemmelse og forstå nervesystemets komplekse sensoriske integration og beslutningstagning.
C. elegans er en særlig nyttig modelorganisme til undersøgelse af gravitakse på grund af dens polyphene livscyklus. Når de udsættes for stressfaktorer under udvikling, herunder varme, overbelægning eller mangel på mad, udvikler C. elegans larver sig til dauers, som er meget stressresistente6. Som dauers udfører orme karakteristisk adfærd, såsom nictation, hvor orme "står" på halen og vinker med hovedet, hvilket kan lette spredningen til bedre levesteder7. Gravitaxis assays af C. elegans og C. japonica tyder på, at dauer larver negativt gravitax, og at denne adfærd er lettere observeret hos dauers end hos voksne 8,9. Test af gravitaxis i andre Caenorhabditis-stammer kan afsløre naturlig variation i gravitatisk adfærd.
Mekanismer til tyngdekraftsfornemmelse er blevet karakteriseret i Euglena, Drosophila, Ciona og forskellige andre arter ved hjælp af gravitaxisassays 3,10,11. I mellemtiden gav gravitakseundersøgelser i Caenorhabditis oprindeligt blandede resultater. En undersøgelse af C. elegans orienteringspræference viste, at orme orienterer sig med hovedet nedad i opløsning, hvilket tyder på positiv gravitaktisk præference12. I mellemtiden, selvom C. japonica dauers tidligt blev identificeret som værende negativt gravitaktisk8, er denne adfærd først for nylig blevet beskrevet i C. elegans9. Der opstår flere udfordringer ved at udvikle et repræsentativt gravitaxis-assay i orme. Caenorhabditis stammer opretholdes på agar plader; Af denne grund bruger adfærdsmæssige assays typisk Agar-plader som en del af deres eksperimentelle design13,14,15. Det tidligste rapporterede gravitaxis-assay i Caenorhabditis blev udført ved at stå en plade på siden i en vinkel på 90° i forhold til den vandrette kontrolplade8. Imidlertid er gravitakseadfærd ikke altid robust under disse forhold. Mens voksne orme kan analyseres for orienteringspræference i løsning12, kan denne retningsbestemte præference også være kontekstafhængig, hvilket fører til forskellig adfærd, hvis ormene kravler snarere end svømning. Derudover er C. elegans følsom over for andre stimuli, herunder lys og elektromagnetiske felter16,17, som forstyrrer deres reaktioner på tyngdekraften9. Derfor er et opdateret gravitakseassay, der beskytter mod andre miljøvariabler, vigtigt for at dissekere mekanismerne i denne sensoriske proces.
I denne protokol beskrives et assay til observation af Caenorhabditis gravitaxis. Opsætningen af denne undersøgelse er delvist baseret på en metode udviklet til at studere neuromuskulær integritet18,19. Dauerlarver dyrkes og isoleres ved hjælp af standardprocedurer20. De injiceres derefter i kamre fremstillet af to 5 ml serologiske pipetter fyldt med agar. Disse kamre kan orienteres lodret eller vandret og placeres i et mørkt Faraday-bur i 12-24 timer for at beskytte mod lys og elektromagnetiske felter. Placeringen af hver orm i kamrene registreres og sammenlignes med de lodrette taxaer for en referencestamme som C. elegans N2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

Tyngdekraftsfornemmelse er en vigtig og relativt undervurderet proces. At mærke tyngdekraften gør det muligt for dyr at navigere i deres omgivelser og letter bevægelse. Derudover er tyngdekraftsfornemmelse, der forekommer i pattedyrs indre øre, tæt forbundet med hørelse - således har forståelse af denne proces konsekvenser for auditiv og vestibulær forskning. Gravitaxis assays findes for nogle modelorganismer, herunder Drosophila. Enkelte orme er tidligere blevet analyseret for deres orienteringspræference, når de sætter sig i opløsning. Imidlertid er et pålideligt og robust assay for Caenorhabditis gravitaxis ikke blevet beskrevet. Den nuværende protokol skitserer en procedure til udførelse af gravitaxisassays, der kan bruges til at teste hundredvis af Caenorhabditis dauers ad gangen. Dette store langdistanceassay giver mulighed for detaljeret dataindsamling, der afslører fænotyper, der kan gå glip af på et standardpladebaseret assay. Dauer-bevægelse langs den lodrette akse sammenlignes med vandrette kontroller for at sikre, at retningsbestemt bias skyldes tyngdekraften. Gravitaktisk præference kan derefter sammenlignes mellem stammer eller eksperimentelle forhold. Denne metode kan bestemme molekylære, cellulære og miljømæssige krav til gravitaxis i orme.

Sammenligning af gravitaxis på tværs af arter Efter den ovenfor beskrevne procedure kan C. briggsae dauer gravitaxis sammenlignes med C. elegans gravitaxis og vandrette kontroller. Den lodrette fordeling (rødbrun) af C. briggsae dauers er skæv mod toppen af kamrene, hvor en stor procentdel af ormene når +7 (figur 2A). I modsætning til vandrette kontroller (aqua), hvor dauers fordeles i en groft klokkeformet kurve omkring midten af kamrene,...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Den nuværende protokol skitserer metoder til udførelse af et stort gravitaxisassay med Caenorhabditis dauer larver. Denne protokol giver mulighed for bedre påvisning af gravitakseadfærd sammenlignet med et pladebaseret assay.

Storstilet gravitaxis-analyse af Caenorhabditis Dauer-larver

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Dette assay med høj kapacitet kan bruges til at observere robust gravitatisk adfærd i caenorhabditis dauer larver. Ormadfærd observeres over store afstande sammenlignet med assays udført på en petriskål. Dette forbedrer analysens følsomhed og giver mulighed for detaljeret dataanalyse.At studere gravitaxis adfærd kan give indsigt i, hvordan tyngdekraft sensation opstår i caenorhabditis, hvilket har relevans for at forstå pattedyrs vestibulære system. Oprettelse af gravitaxis-analysekamrene, isolering af dauers og injektion af ormene i kamrene kræver øvelse. Du kan spare tid ved at isolere dauers og oprette kamrene en dag i forvejen.Begynd med at opsætte en Bunsen-brænder, et til to barberblade, en tang, pincet og en plastskæreflade og en røghætte. For at lave et kammer skal du samle to 5 ml serologiske pipetter og fjerne bomuldsstikket fra en pipette med en pincet. Hold et barberblad med en tang over Bunsen-brænderen, indtil den er varm.Brug det opvarmede blad til at skære den tilspidsede ende af den anden pipette af, så hele pipetten har en ensartet diameter. Bring nu hurtigt de to modificerede pipetteender tæt på flammen og smelt dem lidt. Deltag i disse ender ved at trykke dem fast sammen og sikre, at væggene i begge pipetter er kontinuerlige.Hvis der er synlige huller efter sammenføjning, skal du bryde dem fra hinanden og gentage dette trin. Forbered NGM med 4% agar i henhold til standard ormprocedurer, og fyld hvert kammer ved at fastgøre det til en serologisk pipetter, mens agaren stadig smeltes. For at minimere eventuelle variationer i agarens konsistens på grund af ujævn afkøling skal du holde pipetteren parallelt med bordpladen, mens du trækker agaren op.Træk derefter langsomt opløsningen og forsegl spidsen med parafilm, før kammeret fjernes fra pipetten. Læg kammeret fladt for at afkøle, og lad agaren hærde, før den flyttes. Når den er afkølet, opvarmes en tre millimeter hex-nøgle over en Bunsen-brænder og skaber en lille plaståbning ved at trykke den fast ind i væggen i hvert kammer cirka fem millimeter til den ene side af midterlinjen.Brug derefter et opvarmet blad til at fjerne bomulden og de tilspidsede ender af kammeret og forsegle enderne med paraffinfilm. 10 til 15 dage før eksperimentet klumpes hver stamme på to til tre store NGM-plader med OP50-bakterier og pakkes paraffinfilmen ind. Saml orme ved at skylle låg og plader med M9 Buffer og pipettere opløsningen i 15 milliliter centrifugerør.Pellet ormene ved at dreje ved 1600 x G i 30 til 60 sekunder ved stuetemperatur og opsuge det meste af M9 Buffer med en pipette eller vakuumaspirator. Tilsæt syv milliliter 1% natriumdodecylsulfatopløsning til hver ormpille og lad ormene stå i den i 30 minutter. For at tillade beluftning skal du fortsætte med at rotere rørene kontinuerligt i løbet af denne tid.Fjern derefter vaskemidlet ved at skylle det tre til fem gange med M9. Efter tilsætning af fem milliliter M9 tilsættes fem milliliter koldfiltreret 60% saccharoseopløsning. Bland grundigt og skab en separationsgradient ved centrifugering ved 1600 x G i fem minutter ved stuetemperatur. Fyld nye 15 milliliter centrifugerør med to milliliter M9 Buffer.Knus nu enderne af glas Pasteur-pipetter for at udvide boringen. Og brug disse pipetter til at overføre det øverste lag af opløsningen fra saccharosegradienten til de nye rør. Skyl dauers tre til fem gange med M9 Buffer.Centrifuge-dauers ved 1600 x G i fem minutter ved stuetemperatur og opsugede det meste af M9-opløsningen med en pipette eller vakuumaspirator. Derefter estimeres ormtætheden ved manuelt at tælle antallet af orme i tre separate 1-mikroliter dråber under et dissekeringsmikroskop, og brug gennemsnittet af disse tællinger til at tilnærme antallet af orme pr. Mikroliter. Udvid nu spidsboringen ved at skære enden af 10, 20 eller 200 mikroliter pipettespidser.Indstil mikropipetten til et lidt større volumen end det tilsigtede aspirationsvolumen. Aspirer ca. 1 til 2 mikroliter af den koncentrerede ormopløsning og lad en lille mængde luft komme ind i spidsen. Skub forsigtigt pipettespidsen ind i agaren, mens mikropipetten trykkes ned.Dette vil skabe et injektionssted uden tilstopning af spidsen. Slip ormene i agaren og brug paraffinfilm til at forsegle åbningen. For at eliminere så mange variabler som muligt, når kamrene er placeret i et mørkt Faraday-bur ved stuetemperatur, skal du mærke hvert kammer og hænge det lodret i Faraday-buret.Test vandrette kontroller samtidigt ved at lægge nogle kamre fladt inden for de samme miljøforhold. Brug derefter de vertikalt orienterede N2-orme som en positiv kontrol og vandret orienterede kamre indeholdende N2-dauers som en yderligere negativ kontrol mod de eksperimentelle stammer. Efter et par timer begynder dauerormene at sprede sig fra startstedet og tage flere timer at nå hver ende af kammeret.Lad kamrene være uforstyrrede i løbet af denne tid og score inden for 12 til 24 timer efter injektion. Fjern derefter kamrene en ad gangen og score gravitaxis ved at lede efter levende dauers under et dissekerende mikroskop og markere deres placeringer med blæk. Snes ikke orme inden for 2,5 centimeter til hver side af injektionsstedet, da disse orme sandsynligvis ikke viser en retningspræference.Undgå også at score orme, der ser døde ud eller er fanget i væsken, og kassér kamre, der indeholder mere end 50% døde eller svømmende orme. For at kvantificere resultaterne skal du bruge en markør til at opdele hver halvdel af kammeret i syv 3,5 centimeter, startende 2,5 centimeter væk fra injektionsstedet. Brug en manuel tælletæller til at tælle antallet af orme, der observeres i hvert afsnit.I caenorhabditis briggsae viste en stor procentdel af dauer orme migration mod toppen af kamrene. Imidlertid viste de vandrette kontroller fordeling omkring midten af kamrene, hvilket indikerer negativ gravitaktisk adfærd. De lodrette fordelinger af caenorhabditis briggsae og caenorhabditis elegans viste heller ingen forskel, hvilket tyder på, at caenorhabditis briggsae dauers viser en negativ gravitaxisadfærd svarende til caenorhabditis elegans dauers.Paralytiske midler såsom natriumazid anvendes ikke i denne protokol. Derfor er det vigtigt at score gravitaksekamrene, så snart de er fjernet fra Faraday-buret. Dette assay førte til opdagelsen af negativ gravitaxis adfærd hos c.elegans.Gennem test af flere mutante stammer afslørede det også genetiske og neurale krav til gravitaxis i orme.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Asymmetrisk Walkway: A Novel Behavioral Assay til at studere Asymmetrisk Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Automatiseret analyse af en Nematode Befolkningsbaseret Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Profilering Anti-Neu5Gc IgG i humant serum med en Sialoglycan Microarray Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

En enkel og billig analyse til måling af Ambulation i musemodeller af Muskelsvindfonden

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

En gravende/Tunneling Assay til påvisning af hypoxi i Drosophila melanogaster larver

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Svømning induceret lammelse at vurdere dopamin signalering i Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calciumbilleddannelse i frit opførende caenorhabditis elegans med velkontrolleret, ikke-lokaliseret vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

En forbedret analyse og værktøjer til måling af mekanisk nociception i Drosophila Larver

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Sammenlignende analyse af eksperimentelle metoder til kvantificering af dyrs aktivitet i Caenorhabditis elegans Modeller af Mitokondriesygdom

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

En høj gennemløb Mikroplade Feeder Assay til kvantificering af forbruget i Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...