Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Institutes of Health aan JHR (#R01 5R01HD081266 en #R01GM141493). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). We willen Pradeep Joshi (UCSB) bedanken voor zijn redactionele inbreng. Statistische raadpleging door het UCSB DATALAB.

De stammen die in deze studie worden gebruikt zijn C. elegans (N2) en C. briggsae (AF16) (zie Materiaaltabel). Voor elke test werd een populatie van dauers van gemengd geslacht gebruikt.
1. Kamervoorbereiding
<ol><li>Werk in een zuurkast. Richt de werkruimte in met een Bunsen-brander, 1-2 scheermesjes, tangen, pincetten en een plastic snijoppervlak (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Verzamel voor elke kamer twee serologische p...

<ol>
	<li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+for+human+balance+control.">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li><li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates.">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).</li><li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors.">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li><li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis.">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li><li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway.">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391 (2014).</li><li>Fr&#233;zal, L., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+outside+the+Petri+dish.">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans,+is+regulated+by+IL2+neurons.">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li><li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae.">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li><li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans.">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>H&#228;der, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitaxis+in+Euglena.">Gravitaxis in Euglena.</a> Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston's+organ.">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li><li>Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis.">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+chemotaxis+assay.">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans.">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493 (2015).</li><li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals.">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae.">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).</li><li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+dauer+larvae.">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li><li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn's+test.">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li><li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+a+sensible+model+for+sensory+biology.">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li><li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li><li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound.">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li><li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans.">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).</li><li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans.">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).</li><li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels.">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li><li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron.">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).</li><li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear.">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li><li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+the+vestibular+system.">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li><li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+vestibular+syndromes.">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li><li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders.">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).</li><li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hearing+and+balance.">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567 (2019).</li></ol>

Vergelijking met eerdere methoden In tegenstelling tot chemotaxis kan gravitaxis bij Caenorhabditis niet betrouwbaar worden waargenomen met behulp van een traditioneel experimenteel ontwerp van de agarplaat. Een standaard petrischaal heeft een diameter van 150 mm, wat resulteert in slechts 75 mm beschikbaar in beide richtingen voor dauers om gravitaxis-voorkeur aan te tonen. Hoewel de oriëntatievoorkeur van C. elegans kan worden getest in oplossing12, is deze...

Het voelen van de zwaartekracht van de aarde is cruciaal voor de oriëntatie, beweging, coördinatie en balans van veel organismen. De moleculaire mechanismen en neurocircuits van zwaartekrachtsensatie zijn echter slecht begrepen in vergelijking met andere zintuigen. Bij dieren werkt het zwaartekrachtgevoel samen met en kan het worden weggeconcurreerd door andere stimuli om gedrag te beïnvloeden. Visuele signalen, proprioceptieve feedback en vestibulaire informatie kunnen worden geïntegreerd om een gevoel van lichaamsbewustzijn te genereren ten opzichte van de omgeving van een dier 1,2. Omgekeerd kan de gravitactische voorkeur worden gewijzigd in aanwezigheid van andere stimuli 3,4,5. Daarom is gravitactisch gedrag ideaal voor het bestuderen van zwaartekrachtsensatie en het begrijpen van de complexe sensorische integratie en besluitvorming van het zenuwstelsel.
C. elegans is een bijzonder nuttig modelorganisme voor het bestuderen van gravitaxis vanwege zijn polyfenische levenscyclus. Bij blootstelling aan stressoren tijdens de ontwikkeling, waaronder hitte, overbevolking of een gebrek aan voedsel, ontwikkelen C. elegans-larven zich tot dauers, die zeer stressbestendig zijn6. Als dauers voeren wormen kenmerkend gedrag uit, zoals nictatie, waarbij wormen op hun staart "staan" en met hun hoofd zwaaien, wat verspreiding naar betere habitats kan vergemakkelijken7. Gravitaxis-assays van C. elegans en C. japonica suggereren dat dauerlarven negatief gravitax zijn, en dat dit gedrag gemakkelijker wordt waargenomen bij dauers dan bij volwassenen 8,9. Het testen van gravitaxis in andere Caenorhabditis-stammen kan natuurlijke variatie in gravitactisch gedrag onthullen.
Mechanismen voor zwaartekrachtsensatie zijn gekarakteriseerd in Euglena, Drosophila, Ciona en verschillende andere soorten met behulp van gravitaxis-assays 3,10,11. Ondertussen leverden gravitaxisstudies in Caenorhabditis aanvankelijk gemengde resultaten op. Een studie van C. elegans oriëntatievoorkeur wees uit dat wormen zich oriënteren met hun hoofd naar beneden in oplossing, wat een positieve gravitactische voorkeur suggereert12. Ondertussen, hoewel C. japonica dauers al vroeg werden geïdentificeerd als negatief gravitactisch8, is dit gedrag pas onlangs beschreven in C. elegans9. Verschillende uitdagingen doen zich voor bij het ontwikkelen van een representatieve gravitaxis-test in wormen. Caenorhabditis stammen worden onderhouden op agar platen; om deze reden gebruiken gedragstests meestal agarplaten als onderdeel van hun experimentele ontwerp 13,14,15. De vroegst gerapporteerde gravitaxistest bij Caenorhabditis werd uitgevoerd door een plaat op zijn kant te laten staan in een hoek van 90° ten opzichte van de horizontale controleplaat8. Gravitaxis-gedrag is echter niet altijd robuust onder deze omstandigheden. Hoewel volwassen wormen in oplossing12 kunnen worden getest op oriëntatievoorkeur, kan deze richtingsvoorkeur ook contextafhankelijk zijn, wat leidt tot ander gedrag als de wormen kruipen in plaats van zwemmen. Bovendien is C. elegans gevoelig voor andere stimuli, waaronder licht en elektromagnetische velden16,17, die interfereren met hun reacties op zwaartekracht9. Daarom is een bijgewerkte gravitaxis-test die beschermt tegen andere omgevingsvariabelen belangrijk voor het ontleden van de mechanismen van dit sensorische proces.
In dit protocol wordt een test voor het observeren van Caenorhabditis gravitaxis beschreven. De opzet voor deze studie is deels gebaseerd op een methode die is ontwikkeld om neuromusculaire integriteit tebestuderen 18,19. Dauerlarven worden gekweekt en geïsoleerd met behulp van standaardprocedures20. Ze worden vervolgens geïnjecteerd in kamers gemaakt van twee serologische pipetten van 5 ml gevuld met agar. Deze kamers kunnen verticaal of horizontaal worden georiënteerd en gedurende 12-24 uur in een donkere kooi van Faraday worden geplaatst om te beschermen tegen licht en elektromagnetische velden. De locatie van elke worm in de kamers wordt geregistreerd en vergeleken met de verticale taxi's van een referentiestam zoals C. elegans N2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

Zwaartekrachtsensatie is een belangrijk en relatief onderbelicht proces. Het waarnemen van de zwaartekracht stelt dieren in staat om door hun omgeving te navigeren en vergemakkelijkt beweging. Bovendien is het zwaartekrachtgevoel, dat optreedt in het binnenoor van het zoogdier, nauw verwant aan het gehoor - dus het begrijpen van dit proces heeft implicaties voor auditief en vestibulair onderzoek. Gravitaxis-assays bestaan voor sommige modelorganismen, waaronder Drosophila. Enkele wormen zijn eerder getest op hun oriëntatievoorkeur terwijl ze zich in oplossing vestigen. Een betrouwbare en robuuste test voor Caenorhabditis gravitaxis is echter niet beschreven. Het huidige protocol schetst een procedure voor het uitvoeren van gravitaxis-assays die kunnen worden gebruikt om honderden Caenorhabditis dauers tegelijk te testen. Deze grootschalige, langeafstandstest maakt gedetailleerde gegevensverzameling mogelijk, waarbij fenotypen worden onthuld die mogelijk worden gemist op een standaard op platen gebaseerde test. Dauer-beweging langs de verticale as wordt vergeleken met horizontale bedieningselementen om ervoor te zorgen dat directionele vertekening te wijten is aan de zwaartekracht. Gravitactische voorkeur kan dan worden vergeleken tussen stammen of experimentele omstandigheden. Deze methode kan moleculaire, cellulaire en omgevingsvereisten voor gravitaxis in wormen bepalen.

Gravitaxis vergelijken tussen soorten Volgens de hierboven beschreven procedure kan C. briggsae dauer gravitaxis worden vergeleken met C. elegans gravitaxis en horizontale controles. De verticale verdeling (kastanjebruin) van C. briggsae dauers is scheef naar de toppen van de kamers, waarbij een groot percentage wormen +7 bereikt (figuur 2A). In tegenstelling tot horizontale bedieningselementen (aqua), waarbij dauers in een ruwweg klokvormige cu...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Het huidige protocol schetst methoden voor het uitvoeren van een grootschalige gravitaxis-test met Caenorhabditis dauer-larven. Dit protocol zorgt voor een betere detectie van gravitaxis-gedrag in vergelijking met een op platen gebaseerde test.

Grootschalige Gravitaxis-test van Caenorhabditis Dauer-larven

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Deze high throughput assay kan worden gebruikt om robuust gravitactisch gedrag te observeren bij caenorhabditis dauer larven. Wormgedrag wordt waargenomen over grote afstanden in vergelijking met testen uitgevoerd op een petrischaaltje. Dit verhoogt de gevoeligheid van de test en maakt gedetailleerde gegevensanalyse mogelijk.Het bestuderen van gravitaxis-gedrag kan inzicht geven in hoe zwaartekrachtsensatie optreedt bij caenorhabditis, wat relevant is voor het begrijpen van het vestibulaire systeem van zoogdieren. Het maken van de gravitaxis-testkamers, het isoleren van dauers en het injecteren van de wormen in de kamers vergt oefening. U kunt tijd besparen door de dauers te isoleren en de kamers een dag van tevoren te maken.Begin met het opzetten van een Bunsen-brander, een tot twee scheermesjes, tangen, pincetten en een plastic snijoppervlak en een zuurkast. Om een kamer te maken, verzamelt u twee serologische pipetten van 5 milliliter en verwijdert u met een pincet de katoenen plug uit één pipet. Houd een scheermesje met een tang boven de Bunsen-brander tot het heet is.Gebruik het verwarmde mes om het taps toelopende uiteinde van de tweede pipet af te snijden, zodat de hele pipet een uniforme diameter heeft. Breng nu snel de twee gemodificeerde pipetuiteinden dicht bij de vlam en smelt ze lichtjes. Verbind deze uiteinden door ze stevig tegen elkaar te drukken, zodat de wanden van beide pipetten continu zijn.Als er na het samenvoegen openingen zichtbaar zijn, breek ze dan uit elkaar en herhaal deze stap. Bereid NGM voor met 4% agar volgens standaard wormprocedures en vul elke kamer door deze aan een serologische pipetter te bevestigen terwijl de agar nog steeds gesmolten is. Om eventuele variaties in de consistentie van de agar als gevolg van ongelijke koeling te minimaliseren, houdt u de pipetter parallel aan het bankblad terwijl u de agar opstelt.Trek vervolgens langzaam de oplossing en sluit de punt af met parafilm voordat u de kamer van de pipetter verwijdert. Leg de kamer plat om af te koelen en laat de agar uitharden voordat je gaat bewegen. Eenmaal afgekoeld, verwarm je een inbussleutel van drie millimeter boven een Bunsen-brander en maak je een kleine plastic opening door deze stevig in de wand van elke kamer te drukken, ongeveer vijf millimeter naar één kant van de middellijn.Gebruik vervolgens een verwarmd mes om de katoenen en taps toelopende uiteinden van de kamer te verwijderen en de uiteinden af te dichten met paraffinefilm. 10 tot 15 dagen voor het experiment, snijd elke stam op twee tot drie grote NGM-platen met OP50-bacteriën en wikkel de paraffinefilm. Verzamel wormen door de deksels en platen te spoelen met M9 Buffer en de oplossing te pipetteren in centrifugebuizen van 15 milliliter.Pellet de wormen door 30 tot 60 seconden op kamertemperatuur op 1600 x G te draaien en het grootste deel van de M9 Buffer op te zuigen met een pipet of vacuümaspirator. Voeg zeven milliliter 1% natriumdodecylsulfaatoplossing toe aan elke wormkorrel en laat de wormen er 30 minuten in zitten. Om beluchting mogelijk te maken, moet u de buizen gedurende deze tijd continu blijven draaien.Verwijder vervolgens het wasmiddel door het drie tot vijf keer te spoelen met M9. Voeg na toevoeging van vijf milliliter M9 vijf milliliter koud gefilterde 60% sucrose-oplossing toe. Meng grondig en creëer een scheidingsgradiënt door gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te centrifugeren op 1600 x G. Vul nieuwe centrifugebuizen van 15 milliliter met twee milliliter M9 Buffer.Verpletter nu de uiteinden van glazen Pasteur-pipetten om de boring te verbreden. En gebruik deze pipetten om de bovenste laag van de oplossing over te brengen van de sucrosegradiënt naar de nieuwe buizen. Spoel de dauers drie tot vijf keer af met M9 Buffer.Centrifugeer dauers bij 1600 x G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en zuig het grootste deel van de M9-oplossing aan met een pipet of vacuümaspirator. Schat vervolgens de wormdichtheid door handmatig het aantal wormen in drie afzonderlijke druppeltjes van 1 microliter onder een ontleedmicroscoop te tellen en gebruik het gemiddelde van deze tellingen om het aantal wormen per microliter te benaderen. Verbreed nu de tipboring door het uiteinde van 10, 20 of 200-microliter pipetpunten te snijden.Stel de micropipette in op een iets groter volume dan het beoogde aspiratievolume. Zuig ongeveer 1 tot 2 microliter van de geconcentreerde wormoplossing aan en laat een kleine hoeveelheid lucht in de punt komen. Duw de pipetpunt voorzichtig in de agar terwijl u de micropipet indrukt.Hierdoor ontstaat een injectieplaats zonder de punt te verstoppen. Laat de wormen los in de agar en gebruik paraffinefilm om de opening af te sluiten. Om zoveel mogelijk variabelen te elimineren zodra de kamers bij kamertemperatuur in een donkere kooi van Faraday zijn geplaatst, labelt u elke kamer en hangt u deze verticaal in de kooi van Faraday.Test horizontale controles gelijktijdig door sommige kamers plat te leggen binnen dezelfde omgevingsomstandigheden. Gebruik vervolgens de verticaal georiënteerde N2-wormen als een positieve controle en horizontaal georiënteerde kamers met N2 dauers als een extra negatieve controle tegen de experimentele stammen. Na een paar uur beginnen de dauerwormen zich van de startplaats te verspreiden en duurt het enkele uren om beide uiteinden van de kamer te bereiken.Laat de kamers gedurende deze tijd ongestoord en scoor binnen 12 tot 24 uur na injectie. Verwijder vervolgens de kamers één voor één en scoor gravitaxis door te zoeken naar levende dauers onder een ontleedmicroscoop en hun locaties met inkt te markeren. Scoor geen wormen binnen 2,5 centimeter aan weerszijden van de injectieplaats, omdat deze wormen waarschijnlijk geen richtingsvoorkeur vertonen.Vermijd ook het scoren van wormen die dood lijken of gevangen zitten in de vloeistof en gooi alle kamers weg die meer dan 50% dode of zwemmende wormen bevatten. Om de resultaten te kwantificeren, gebruikt u een marker om elke helft van de kamer te verdelen in zeven 3,5 centimeter, beginnend op 2,5 centimeter afstand van de injectieplaats. Gebruik een handmatige telteller om het aantal wormen te tellen dat in elke sectie is waargenomen.Bij caenorhabditis briggsae vertoonde een groot percentage dauerwormen migratie naar de bovenkant van de kamers. De horizontale controles toonden echter verdeling rond het midden van de kamers, wat wijst op negatief zwaartekrachtsgedrag. Ook vertoonden de verticale verdelingen van caenorhabditis briggsae en caenorhabditis elegans geen verschil, wat suggereert dat caenorhabditis briggsae dauers een negatief gravitaxis-gedrag vertonen dat vergelijkbaar is met caenorhabditis elegans dauers.Paralytische middelen zoals natriumazide worden niet gebruikt in dit protocol. Daarom is het belangrijk om de gravitaxiskamers te scoren zodra ze uit de kooi van Faraday zijn verwijderd. Deze test leidde tot de ontdekking van negatief gravitaxisgedrag bij c.elegans.Door verschillende mutante stammen te testen, onthulde het ook genetische en neurale vereisten voor gravitaxis in wormen.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Asymmetrische Gang: A Novel Behavioral Assay voor Studie asymmetrische Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

Een eenvoudige en goedkope Assay voor het meten van Ambulation in muismodellen van spierdystrofie

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Een gravende/Tunneling Assay voor het opsporen van hypoxie in Drosophila melanogaster larven

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Zwemmen geïnduceerde verlamming te beoordelen Dopamine signalering in Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calciumbeeldvorming bij vrij gedragen caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Een verbeterde test en tools voor het meten van mechanische nociceptie in Drosophila-larven

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Een high throughput microplate feeder assay voor kwantificering van consumptie in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...