Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Cette recherche a été financée par des subventions de recherche des National Institutes of Health à JHR (#R01 5R01HD081266 et #R01GM141493). Certaines souches ont été fournies par la CCG, qui est financée par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Nous tenons à remercier Pradeep Joshi (UCSB) pour sa contribution éditoriale. Consultation statistique fournie par l’UCSB DATALAB.

Les souches utilisées dans la présente étude sont C. elegans (N2) et C. briggsae (AF16) (voir le tableau des matériaux). Une population mixte de dauers a été utilisée pour chaque essai.
1. Préparation de la chambre
<ol><li>Travailler dans une hotte. Configurez l’espace de travail avec un brûleur Bunsen, 1-2 lames de rasoir, des pinces, une pince à épiler et une surface de coupe en plastique (voir le tableau des matéria...

<ol>
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Comparaison avec les méthodes antérieures Contrairement à la chimiotaxie, la gravitaxie chez Caenorhabditis ne peut pas être observée de manière fiable à l’aide d’un plan expérimental traditionnel sur plaque d’agar. Une boîte de Petri standard mesure 150 mm de diamètre, ce qui donne seulement 75 mm disponibles dans les deux sens pour que les dauers puissent démontrer la préférence gravitaire. Bien que la préférence d’orientation de C. elegans puisse être dosé...

La détection de l’attraction gravitationnelle de la Terre est cruciale pour l’orientation, le mouvement, la coordination et l’équilibre de nombreux organismes. Cependant, les mécanismes moléculaires et les neurocircuits de la sensation de gravité sont mal compris par rapport à d’autres sens. Chez les animaux, la sensation de gravité interagit avec et peut être dépassée par d’autres stimuli pour influencer le comportement. Des indices visuels, une rétroaction proprioceptive et des informations vestibulaires peuvent être intégrés pour générer un sentiment de conscience corporelle par rapport à l’environnement d’un animal 1,2. Inversement, la préférence gravitactique peut être altérée en présence d’autres stimuli 3,4,5. Par conséquent, le comportement gravitactique est idéal pour étudier la sensation de gravité et comprendre l’intégration sensorielle complexe du système nerveux et la prise de décision.
C. elegans est un organisme modèle particulièrement utile pour étudier la gravitaxie en raison de son cycle de vie polyphénique. Lorsqu’elles sont exposées à des facteurs de stress pendant le développement, notamment la chaleur, le surpeuplement ou le manque de nourriture, les larves de C. elegans se transforment en dauers, qui sont très résistants au stress6. En tant que dauers, les vers adoptent des comportements caractéristiques, tels que la nictation, dans laquelle les vers « se tiennent » sur leur queue et agitent la tête, ce qui peut faciliter la dispersion vers de meilleurs habitats7. Les essais gravitaxis de C. elegans et de C. japonica suggèrent que les larves de dauer ont un gravitax négatif, et que ce comportement est plus facilement observé chez les dauers que chez les adultes 8,9. Le test de l’axe de gravité dans d’autres souches de Caenorhabditis peut révéler une variation naturelle du comportement gravitactique.
Les mécanismes de sensation de gravité ont été caractérisés chez Euglena, Drosophila, Ciona et diverses autres espèces en utilisant les essaisde gravité 3,10,11. Pendant ce temps, les études gravitaxis à Caenorhabditis ont initialement fourni des résultats mitigés. Une étude de la préférence d’orientation de C. elegans a révélé que les vers s’orientent la tête baissée en solution, suggérant une préférence gravitactique positive12. Pendant ce temps, bien que C. japonica dauers ait été identifié très tôt comme étant négativement gravitactique8, ce comportement n’a été décrit que récemment dans C. elegans9. Plusieurs défis se posent dans le développement d’un essai de gravité représentatif chez les vers. Les souches de Caenorhabditis sont maintenues sur des plaques de gélose; Pour cette raison, les tests comportementaux utilisent généralement des plaques de gélose dans le cadre de leur conception expérimentale13,14,15. Le premier essai d’axe gravitationnel signalé chez Caenorhabditis a été réalisé en plaçant une plaque sur le côté à un angle de 90° par rapport à la plaque de contrôle horizontale8. Cependant, le comportement de l’axe gravitationnel n’est pas toujours robuste dans ces conditions. Alors que les vers adultes peuvent être testés pour la préférence d’orientation dans la solution12, cette préférence directionnelle peut également dépendre du contexte, conduisant à des comportements différents si les vers rampent plutôt que de nager. De plus, C. elegans est sensible à d’autres stimuli, y compris la lumière et les champs électromagnétiques16,17, qui interfèrent avec leurs réponses à la gravité9. Par conséquent, un test gravitaxique mis à jour qui protège contre d’autres variables environnementales est important pour disséquer les mécanismes de ce processus sensoriel.
Dans le présent protocole, un essai d’observation de l’axe gravitationnel de Caenorhabditis est décrit. La configuration de cette étude est basée en partie sur une méthode développée pour étudier l’intégrité neuromusculaire18,19. Les larves de Dauer sont cultivées et isolées selon les procédures standard20. Ils sont ensuite injectés dans des chambres fabriquées à partir de deux pipettes sérologiques de 5 ml remplies d’agar-agar. Ces chambres peuvent être orientées verticalement ou horizontalement et placées dans une cage de Faraday sombre pendant 12-24 h pour se protéger contre la lumière et les champs électromagnétiques. L’emplacement de chaque ver dans les chambres est enregistré et comparé aux taxis verticaux d’une souche de référence telle que C. elegans N2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

La sensation de gravité est un processus important et relativement peu étudié. La détection de la gravité permet aux animaux de naviguer dans leur environnement et facilite les mouvements. De plus, la sensation de gravité, qui se produit dans l’oreille interne des mammifères, est étroitement liée à l’audition - ainsi, la compréhension de ce processus a des implications pour la recherche auditive et vestibulaire. Des essais gravitationnels existent pour certains organismes modèles, dont la drosophile. Les vers simples ont déjà été testés pour leur préférence d’orientation lorsqu’ils s’installent en solution. Cependant, un essai fiable et robuste pour Caenorhabditis gravitaxis n’a pas été décrit. Le présent protocole décrit une procédure pour effectuer des tests gravitaires qui peuvent être utilisés pour tester des centaines de Caenorhabditis dauers à la fois. Ce test à grande échelle et à longue distance permet une collecte de données détaillées, révélant des phénotypes qui peuvent être manqués sur un essai standard sur plaque. Le mouvement de Dauer le long de l’axe vertical est comparé aux commandes horizontales pour s’assurer que la polarisation directionnelle est due à la gravité. La préférence gravitactique peut alors être comparée entre les souches ou les conditions expérimentales. Cette méthode permet de déterminer les exigences moléculaires, cellulaires et environnementales pour la gravitaxie chez les vers.

Comparaison de la gravité entre les espèces En suivant la procédure décrite ci-dessus, la gravitaxie de C. briggsae dauer peut être comparée à l’axe gravitationnel et aux contrôles horizontaux de C. elegans . La distribution verticale (marron) de C. briggsae dauers est inclinée vers le sommet des chambres, avec un pourcentage élevé de vers atteignant +7 (Figure 2A). Contrairement aux contrôles horizontaux (aqua), dans lesquels les ...

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Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Le présent protocole décrit les méthodes permettant d’effectuer un essai gravitaire à grande échelle avec des larves de Caenorhabditis dauer. Ce protocole permet une meilleure détection du comportement de l’axe gravitationnel par rapport à un test sur plaque.

Essai gravitaire à grande échelle des larves de Caenorhabditis dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Ce test à haut débit peut être utilisé pour observer un comportement gravitactique robuste chez les larves de caenorhabditis dauer. Le comportement des vers est observé sur de grandes distances par rapport aux essais effectués sur une boîte de Pétri. Cela améliore la sensibilité du test et permet une analyse détaillée des données.L’étude du comportement de la gravitaxie peut donner un aperçu de la façon dont la sensation de gravité se produit dans la cénorhabdite, ce qui est pertinent pour comprendre le système vestibulaire des mammifères. Créer les chambres d’essai gravitaxies, isoler les dauers et injecter les vers dans les chambres demande de la pratique. Vous pouvez gagner du temps en isolant les dauers et en créant les chambres un jour à l’avance.Commencez par installer un brûleur Bunsen, une à deux lames de rasoir, une pince, une pince à épiler, une surface de coupe en plastique et une hotte anti-fumée. Pour faire une chambre, rassemblez deux pipettes sérologiques de 5 millilitres et, avec une pince à épiler, retirez le bouchon de coton d’une pipette. Tenez une lame de rasoir à l’aide d’une pince sur le brûleur Bunsen jusqu’à ce qu’il soit chaud.Utilisez la lame chauffée pour trancher l’extrémité effilée de la deuxième pipette afin que la pipette entière ait un diamètre uniforme. Maintenant, rapprochez rapidement les deux extrémités de pipette modifiées de la flamme et faites-les fondre légèrement. Joignez ces extrémités en les pressant fermement, en veillant à ce que les parois des deux pipettes soient continues.Si des espaces sont visibles après la jonction, séparez-les et répétez cette étape. Préparer NGM avec 4% de gélose selon les procédures standard de vers et remplir chaque chambre en l’attachant à un pipetter sérologique pendant que la gélose est encore fondue. Pour minimiser les variations de la consistance de la gélose dues à un refroidissement inégal, maintenez la pipette parallèle au dessus de la paillasse tout en tirant la géloseEnsuite, aspirez lentement la solution et scellez l’embout avec du parafilm avant de retirer la chambre de la pipette. Posez la chambre à plat pour refroidir et laissez la gélose durcir avant de la déplacer. Une fois refroidi, chauffez une clé hexagonale de trois millimètres sur un brûleur Bunsen et créez une petite ouverture en plastique en la pressant fermement dans la paroi de chaque chambre à environ cinq millimètres d’un côté de la ligne médiane.Ensuite, utilisez une lame chauffante pour enlever le coton et les extrémités effilées de la chambre et scellez les extrémités avec un film de paraffine. 10 à 15 jours avant l’expérience, coupez chaque souche sur deux à trois grandes plaques NGM avec des bactéries OP50 et enveloppez le film de paraffine. Recueillir les vers en rinçant les couvercles et les plaques avec M9 Buffer et en pipetant la solution dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres.Ensemencer les vers en les faisant tourner à 1600 x G pendant 30 à 60 secondes à température ambiante et aspirer la majeure partie du tampon M9 à l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur à vide. Ajouter sept millilitres de solution de dodécylsulfate de sodium à 1% à chaque pastille de ver et laisser les vers dedans pendant 30 minutes. Pour permettre l’aération, continuez à faire tourner les tubes en continu pendant ce temps.Ensuite, retirez le détergent en le rinçant trois à cinq fois avec du M9. Après avoir ajouté cinq millilitres M9, ajoutez cinq millilitres de solution de saccharose à 60% filtrée à froid. Bien mélanger et créer un gradient de séparation en centrifugeant à 1600 x G pendant cinq minutes à température ambiante. Remplissez les nouveaux tubes centrifuges de 15 millilitres avec deux millilitres de tampon M9.Maintenant, écrasez les extrémités des pipettes Pasteur en verre pour élargir l’alésage. Et utilisez ces pipettes pour transférer la couche supérieure de la solution du gradient de saccharose aux nouveaux tubes. Rincez les dauers trois à cinq fois avec M9 Buffer.Centrifuger les baraudes à 1600 x G pendant cinq minutes à température ambiante et aspirer la majeure partie de la solution M9 à l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur à vide. Ensuite, estimez la densité des vers en comptant manuellement le nombre de vers dans trois gouttelettes distinctes de 1 microlitre sous un microscope à dissection, et utilisez la moyenne de ces comptes pour estimer le nombre de vers par microlitre. Maintenant, élargissez l’alésage de la pointe en coupant l’extrémité des pointes de pipette de 10, 20 ou 200 microlitres.Réglez la micropipette à un volume légèrement supérieur au volume d’aspiration prévu. Aspirez environ 1 à 2 microlitres de la solution de ver concentrée et laissez entrer une petite quantité d’air dans la pointe. Poussez doucement l’embout de la pipette dans la gélose tout en appuyant sur la micro-pipette.Cela créera un site d’injection sans obstruer la pointe. Relâchez les vers dans la gélose et utilisez un film de paraffine pour sceller l’ouverture. Pour éliminer autant de variables que possible une fois que les chambres sont placées dans une cage de Faraday sombre à température ambiante, étiquetez chaque chambre et suspendez-la verticalement dans la cage de Faraday.Testez simultanément les contrôles horizontaux en posant certaines chambres à plat dans les mêmes conditions environnementales. Utilisez ensuite les vers N2 orientés verticalement comme témoin positif et les chambres orientées horizontalement contenant des dauers N2 comme contrôle négatif supplémentaire contre les souches expérimentales. Après quelques heures, les vers dauer commencent à se disperser à partir du site de départ et mettent plusieurs heures à atteindre chaque extrémité de la chambre.Laissez les chambres intactes pendant ce temps et notez dans les 12 à 24 heures suivant l’injection. Ensuite, retirez les chambres une à la fois et marquez l’axe de gravité en recherchant des dauers vivants sous un microscope à dissection et en marquant leurs emplacements avec de l’encre. Ne marquez pas les vers à moins de 2,5 centimètres de chaque côté du site d’injection, car il est peu probable que ces vers présentent une préférence directionnelle.En outre, évitez de marquer les vers qui semblent morts ou qui sont piégés dans le liquide et jetez toutes les chambres contenant plus de 50% de vers morts ou nageurs. Pour quantifier les résultats, utilisez un marqueur pour diviser chaque moitié de la chambre en sept de 3,5 centimètres, à partir de 2,5 centimètres du site d’injection. Utilisez un compteur de comptage manuel pour compter le nombre de vers observés dans chaque section.Chez Caenorhabditis briggsae, un grand pourcentage de vers dauer ont montré une migration vers le haut des chambres. Cependant, les contrôles horizontaux ont montré une distribution autour du centre des chambres, indiquant un comportement gravitactique négatif. En outre, les distributions verticales de caenorhabditis briggsae et caenorhabditis elegans n’ont montré aucune différence, ce qui suggère que caenorhabditis briggsae dauers montre un comportement gravitationnel négatif similaire à celui de caenorhabditis elegans dauers.Les agents paralytiques tels que l’azoture de sodium ne sont pas utilisés dans ce protocole. Par conséquent, il est important de noter les chambres de gravité dès qu’elles sont retirées de la cage de Faraday. Ce test a conduit à la découverte d’un comportement gravitationnel négatif chez c. elegans.En testant plusieurs souches mutantes, il a également révélé des besoins génétiques et neuronaux pour la gravitaxie chez les vers.

Research

JoVE Journal

Behavior

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