Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקי מחקר של המכונים הלאומיים לבריאות ל- JHR (#R01 5R01HD081266 ו- #R01GM141493). חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440). ברצוננו להודות לפראדיפ ג'ושי (UCSB) על תגובת המערכת שלו. ייעוץ סטטיסטי הניתן על ידי UCSB DATALAB.

הזנים המשמשים במחקר הנוכחי הם C. elegans (N2) ו - C. briggsae (AF16) (ראו טבלת חומרים). אוכלוסייה מעורבת של דאוארים שימשה לכל בדיקה.
1. הכנת הלשכה
<ol><li>עבודה במכסה אדים. הגדר את סביבת העבודה עם מבער Bunsen, 1-2 סכיני גילוח, צבת, פינצטה ומשטח חיתוך מפלסטיק (ראה טבלת ח...

<ol>
	<li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+for+human+balance+control.">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li><li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates.">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).</li><li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors.">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li><li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis.">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li><li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway.">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391 (2014).</li><li>Fr&#233;zal, L., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+outside+the+Petri+dish.">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans,+is+regulated+by+IL2+neurons.">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li><li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae.">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li><li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans.">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>H&#228;der, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitaxis+in+Euglena.">Gravitaxis in Euglena.</a> Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston's+organ.">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li><li>Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis.">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+chemotaxis+assay.">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans.">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493 (2015).</li><li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals.">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae.">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).</li><li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+dauer+larvae.">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li><li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn's+test.">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li><li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+a+sensible+model+for+sensory+biology.">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li><li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li><li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound.">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li><li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans.">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).</li><li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans.">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).</li><li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels.">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li><li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron.">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).</li><li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear.">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li><li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+the+vestibular+system.">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li><li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+vestibular+syndromes.">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li><li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders.">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).</li><li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hearing+and+balance.">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567 (2019).</li></ol>

השוואה עם שיטות קודמות שלא כמו כימוטקסיס, לא ניתן לצפות באופן מהימן בגרביטקסיס בקאנורהבדיטיס באמצעות תכנון ניסיוני מסורתי של צלחת אגר. קוטרה של צלחת פטרי סטנדרטית הוא 150 מ"מ, וכתוצאה מכך רק 75 מ"מ זמינים בשני הכיוונים עבור דאוארים כדי להדגים את העדפת הגרביטקסיס. למרות שניתן ל...

חישת כוח המשיכה של כדור הארץ חיונית להתמצאות, לתנועה, לקואורדינציה ולאיזון של אורגניזמים רבים. עם זאת, המנגנונים המולקולריים והנוירו-מעגלים של תחושת הכבידה אינם מובנים היטב בהשוואה לחושים אחרים. אצל בעלי חיים, תחושת הכבידה מתקשרת עם גירויים אחרים ויכולה להיות מוגברת על ידי גירויים אחרים כדי להשפיע על ההתנהגות. ניתן לשלב רמזים חזותיים, משוב פרופריוצפטיבי ומידע שיווי משקל כדי ליצור תחושה של מודעות לגוף ביחס לסביבתו של בעל החיים 1,2. לעומת זאת, ניתן לשנות את העדפת הכבידה בנוכחות גירויים אחרים 3,4,5. לכן, התנהגות כבידתית היא אידיאלית לחקר תחושת הכבידה ולהבנת האינטגרציה החושית המורכבת של מערכת העצבים וקבלת ההחלטות.
C. elegans הוא אורגניזם מודל שימושי במיוחד לחקר גרביטקסיס בגלל מחזור החיים הפוליפני שלו. כאשר הם נחשפים לגורמי עקה במהלך ההתפתחות, כולל חום, צפיפות או מחסור במזון, זחלי C. elegans מתפתחים לדאוארים, שהם עמידים מאוד ללחץ6. בתור דאוארים, תולעים מבצעות התנהגויות אופייניות, כגון ניקוטציה, שבה תולעים "עומדות" על זנבן ומנופפות בראשן, שעשויות להקל על פיזור לבתי גידול טובים יותר7. מבחני גרביטקסיס של C. elegans ו- C. japonica מצביעים על כך שזחלי דאואר הם בעלי כבידה שלילית, וכי התנהגות זו נצפית בקלות רבה יותר אצל דאוארים מאשר אצל מבוגרים 8,9. בדיקת גרביטקסיס בזנים אחרים של Caenorhabditis עשויה לגלות שונות טבעית בהתנהגות הכבידה.
מנגנונים לתחושת הכבידה אופיינו באוגלנה, דרוזופילה, סיונה ומינים שונים אחרים באמצעות מבחני גרביטקסיס 3,10,11. בינתיים, מחקרי גרביטקסיס ב- Caenorhabditis סיפקו בתחילה תוצאות מעורבות. מחקר על העדפת האוריינטציה של C. elegans מצא כי תולעים מכוונות עם ראשן למטה בתמיסה, מה שמרמז על העדפה גרביטקטית חיובית12. בינתיים, למרות ש-C. japonica dauers זוהו בשלב מוקדם כבעלי כבידה שלילית8, התנהגות זו תוארה רק לאחרונה ב-C. elegans9. מספר אתגרים מתעוררים בפיתוח בדיקת גרביטקסיס מייצגת בתולעים. זני Caenorhabditis נשמרים על צלחות אגר; מסיבה זו, מבחנים התנהגותיים משתמשים בדרך כלל בלוחות אגר כחלק מתכנון הניסוישלהם 13,14,15. בדיקת הכבידה המוקדמת ביותר שדווחה ב- Caenorhabditis בוצעה על ידי העמדת צלחת על צדה בזווית של 90° ללוח הבקרה האופקי8. עם זאת, התנהגות גרביטקסיס אינה תמיד חזקה בתנאים אלה. בעוד שניתן לבחון תולעים בוגרות להעדפה אוריינטלית בתמיסה12, העדפה כיוונית זו עשויה להיות גם תלוית הקשר, מה שמוביל להתנהגויות שונות אם התולעים זוחלות במקום לשחות. בנוסף, C. elegans רגישים לגירויים אחרים, כולל אור ושדות אלקטרומגנטיים16,17, אשר מפריעים לתגובותיהם לכוח הכבידה9. לכן, מבחן גרביטקסיס מעודכן המגן מפני משתנים סביבתיים אחרים חשוב לניתוח המנגנונים של תהליך חושי זה.
בפרוטוקול הנוכחי מתוארת בדיקה לתצפית על Caenorhabditis gravitaxis. המערך למחקר זה מבוסס בחלקו על שיטה שפותחה כדי לחקור שלמות נוירומוסקולרית18,19. זחלי דאואר מתורבתים ומבודדים באמצעות נהלים סטנדרטיים20. לאחר מכן הם מוזרקים לתאים העשויים משני פיפטות סרולוגיות של 5 מ"ל מלאות באגר. תאים אלה יכולים להיות מכוונים אנכית או אופקית וממוקמים בתוך כלוב פאראדיי חשוך למשך 12-24 שעות כדי להגן מפני אור ושדות אלקטרומגנטיים. מיקומה של כל תולעת בתאים נרשם ומושווה למוניות האנכיות של זן ייחוס כגון C. elegans N2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

תחושת הכבידה היא תהליך חשוב ויחסית לא מובן מאליו. חישת כוח המשיכה מאפשרת לבעלי חיים לנווט בסביבתם ומקלה על התנועה. בנוסף, תחושת הכבידה, המתרחשת באוזן הפנימית של היונקים, קשורה קשר הדוק לשמיעה - ולכן, להבנת תהליך זה יש השלכות על מחקר שמיעתי ושיווי משקל. מבחני גרביטקסיס קיימים עבור כמה אורגניזמי מודל, כולל דרוזופילה. תולעים בודדות נבדקו בעבר על העדפת האוריינטציה שלהן כשהן שוקעות בתמיסה. עם זאת, בדיקה אמינה וחזקה עבור Caenorhabditis gravitaxis לא תואר. הפרוטוקול הנוכחי מתווה הליך לביצוע מבחני גרביטקסיס שניתן להשתמש בהם כדי לבחון מאות דאוארים של Caenorhabditis בכל פעם. בדיקה ארוכת טווח בקנה מידה גדול זו מאפשרת איסוף נתונים מפורט, וחושפת פנוטיפים שעלולים להתפספס בבדיקה סטנדרטית מבוססת צלחת. תנועת דאואר לאורך הציר האנכי מושווית לבקרות אופקיות כדי להבטיח שהטיית הכיוון נובעת מכוח הכבידה. לאחר מכן ניתן להשוות את העדפת הכבידה בין זנים או תנאי ניסוי. שיטה זו יכולה לקבוע דרישות מולקולריות, תאיות וסביבתיות עבור גרביטקסיס בתולעים.

השוואת גרביטקסיס בין מינים שונים בעקבות ההליך המתואר לעיל, C. briggsae dauer gravitaxis ניתן להשוות עם C. elegans gravitaxis ובקרות אופקיות. ההתפלגות האנכית (maroon) של C . briggsae dauers מוטה לכיוון צמרות התאים, כאשר אחוז גדול של תולעים מגיע ל-+7 (איור 2A). בניגוד לבקרות אופקיות (אקוו...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטות לביצוע בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול עם זחלי Caenorhabditis dauer. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי טוב יותר של התנהגות גרביטקסיס בהשוואה לבדיקה מבוססת צלחת.

בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי Caenorhabditis Dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

ניתן להשתמש בבדיקת תפוקה גבוהה זו כדי לצפות בהתנהגות גרביטקטית חזקה בזחלי caenorhabditis dauer. התנהגות התולעים נצפית על פני מרחקים גדולים בהשוואה למבחנים המבוצעים על צלחת פטרי. זה משפר את הרגישות של הבדיקה ומאפשר ניתוח נתונים מפורט.חקר התנהגות גרביטקסיס יכול לספק תובנה לגבי האופן שבו תחושת הכבידה מתרחשת בקאנורהבדיטיס, שיש לה רלוונטיות להבנת מערכת שיווי המשקל של יונקים. יצירת תאי הבדיקה של גרביטקסיס, בידוד דאוארים והזרקת התולעים לתוך התאים דורשת תרגול. אתה יכול לחסוך זמן על ידי בידוד הדאוארים ויצירת התאים יום מראש.התחילו בהתקנת מבער בונזן, סכין גילוח אחד עד שניים, צבתות, פינצטה, משטח חיתוך מפלסטיק ומכסה אדים. כדי ליצור תא, לאסוף שני פיפטות סרולוגיות 5 מיליליטר, ועם פינצטה, להסיר את תקע כותנה מפיפטה אחת. החזיקו סכין גילוח באמצעות צבת מעל מבער הבונזן עד לקבלת תערובת חמה.השתמש בלהב המחומם כדי לחתוך את הקצה המחודד של הפיפטה השנייה, כך שלפיפטה כולה יהיה קוטר אחיד. כעת, קרבו במהירות את שני קצוות הפיפטה המותאמים ללהבה והמיסו אותם מעט. חברו את הקצוות הללו על ידי לחיצה חזקה עליהם, כדי להבטיח שהקירות של שני הפיפטות יהיו רציפים.אם רווחים כלשהם גלויים לאחר ההצטרפות, נתק אותם זה מזה וחזור על שלב זה. הכינו NGM עם 4% אגר על פי נהלי התולעת הסטנדרטיים ומלאו כל תא על ידי חיבורו לפיפטר סרולוגי בזמן שהאגר עדיין מותך. כדי למזער את כל השינויים בעקביות של האגר עקב קירור לא אחיד, החזיקו את הפייפטר במקביל לחלק העליון של הספסל תוך כדי שרטוט האגר.לאחר מכן לאט לאט לצייר את הפתרון ולאטום את הקצה עם parafilm לפני הסרת החדר מן pipetter. הניחו את התא שטוח כדי להתקרר ותנו לאגר להתקשות לפני התנועה. לאחר הקירור, מחממים מפתח הקסדצימלי של שלושה מילימטרים מעל מבער בונזן ויוצרים פתח פלסטיק קטן על ידי לחיצה חזקה לתוך הקיר של כל תא כחמישה מילימטרים לצד אחד של קו האמצע.לאחר מכן, השתמש בלהב מחומם כדי להסיר את הכותנה ואת הקצוות מחודדים של התא ולאטום את הקצוות עם סרט פרפין. 10 עד 15 ימים לפני הניסוי, חתכו כל זן על שתיים עד שלוש צלחות NGM גדולות עם חיידקי OP50 ועטפו את סרט הפרפין. אסוף תולעים על ידי שטיפת המכסים והצלחות עם M9 Buffer והזרמת התמיסה לצינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר.גלולו את התולעים על ידי סיבוב ברזולוציה של 1600 x G למשך 30 עד 60 שניות בטמפרטורת החדר ושאפו את רוב מאגר M9 עם פיפטה או שואף ואקום. הוסף שבעה מיליליטר של 1% נתרן דודציל סולפט פתרון לכל כדור תולעת ולהשאיר את התולעים בו במשך 30 דקות. כדי לאפשר אוורור, המשיכו לסובב את הצינורות ברציפות במהלך תקופה זו.לאחר מכן, הסר את חומר הניקוי על ידי שטיפתו שלוש עד חמש פעמים עם M9. לאחר הוספת חמישה מיליליטר M9, הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת 60% סוכרוז מסוננת קרה. מערבבים היטב ויוצרים שיפוע הפרדה על ידי צנטריפוגה ברזולוציה של 1600 x G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מלא צינורות צנטריפוגה חדשים של 15 מיליליטר בשני מיליליטר של M9 Buffer.עכשיו למחוץ את הקצוות של פיפטות פסטר זכוכית כדי להרחיב את הבור. ולהשתמש פיפטות אלה כדי להעביר את השכבה העליונה של התמיסה מן שיפוע סוכרוז אל הצינורות החדשים. שטפו את הדאוארים שלוש עד חמש פעמים עם M9 Buffer.צנטריפוגה מתנדנדת ברזולוציה של 1600 x G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ושואפת את רוב תמיסת ה-M9 באמצעות פיפטה או שואב אבק. לאחר מכן, הערך את צפיפות התולעים על ידי ספירה ידנית של מספר התולעים בשלוש טיפות נפרדות של 1 מיקרוליטר תחת מיקרוסקופ מנתח, והשתמש בממוצע של ספירות אלה כדי להעריך את מספר התולעים למיקרוליטר. כעת הרחיבו את הקצה על ידי חיתוך הקצה של 10, 20 או 200 קצוות פיפטה מיקרוליטר.הגדר את המיקרופיפטה לנפח מעט גדול יותר מנפח השאיפה המיועד. שאפו כ 1 עד 2 microliters של תמיסת תולעת מרוכזת ולאפשר כמות קטנה של אוויר להיכנס לקצה. דחפו בעדינות את קצה הפיפטה לתוך האגר תוך כדי לחיצה על המיקרו פיפטה.פעולה זו תיצור אתר הזרקה מבלי לסתום את הקצה. שחררו את התולעים לתוך האגר והשתמשו בסרט פרפין כדי לאטום את הפתח. כדי למנוע כמה שיותר משתנים ברגע שהתאים ממוקמים בתוך כלוב פאראדיי חשוך בטמפרטורת החדר, תייג כל תא ותלה אותו אנכית בתוך כלוב פאראדיי.בדוק בקרות אופקיות במקביל על ידי הנחת חלק מהתאים שטוחים באותם תנאים סביבתיים. לאחר מכן השתמש בתולעי N2 בעלות האוריינטציה האנכית כבקרה חיובית ובתאים בעלי אוריינטציה אופקית המכילים דאוארים N2 כבקרה שלילית נוספת כנגד זני הניסוי. לאחר מספר שעות, תולעי הדאואר מתחילות להתפזר מאתר ההתחלה ולוקח כמה שעות להגיע לשני קצות החדר.יש להשאיר את התאים ללא הפרעה במהלך תקופה זו ולהבקיע תוך 12 עד 24 שעות לאחר ההזרקה. לאחר מכן, הסר את התאים בזה אחר זה והבקיע גרביטקסיס על ידי חיפוש דאוארים חיים תחת מיקרוסקופ מנתח וסימון מיקומם בדיו. אין להבקיע תולעים בטווח של 2.5 ס"מ לאף אחד מהצדדים של אתר ההזרקה, שכן תולעים אלה אינן צפויות להפגין העדפה כיוונית.כמו כן, הימנעו מתולעי ניקוד שנראות מתות או לכודות בנוזל והשליכו תאים המכילים יותר מ-50% תולעים מתות או תולעים שוחות. כדי לכמת את התוצאות, השתמש בסמן כדי לחלק כל מחצית של התא לשבעה 3.5 ס"מ, החל 2.5 ס"מ ממקום ההזרקה. השתמש במונה ידני כדי לספור את מספר התולעים שנצפו בכל סעיף.ב-caenorhabditis briggsae, אחוז גדול של תולעי דאואר הראה נדידה לכיוון החלק העליון של התאים. עם זאת, הבקרות האופקיות הראו התפלגות סביב מרכז התאים, מה שמעיד על התנהגות גרביטקטית שלילית. כמו כן, ההתפלגויות האנכיות של caenorhabditis briggsae ו- caenorhabditis elegans לא הראו שום הבדל המצביע על כך ש- caenorhabditis briggsae dauers מראים התנהגות גרביטקסיס שלילית הדומה לזו של caenorhabditis elegans dauers.סוכנים משותקים כגון נתרן אזיד אינם משמשים בפרוטוקול זה. לכן, חשוב להבקיע את תאי הגרביטקסיס ברגע שהם מוסרים מכלוב פאראדיי. בדיקה זו הובילה לגילוי התנהגות גרביטקסיס שלילית ב- c.elegans.באמצעות בדיקת מספר זנים מוטנטיים, הוא גם חשף דרישות גנטיות ועצביות לגרביטקסיס בתולעים.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

א-סימטרי טיילת: רומן התנהגות Assay עבור לימוד אסימטרית תנועה

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

פרופילינג נגד Neu5Gc IgG ב Sera האדם עם Assay Microarray Sialoglycan

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

ופשוט נמוכים Assay למדידת Ambulation במודלים של העכבר של ניוון

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

וזמינותו נובר/למנהור עבור זיהוי של היפוקסיה ב הזחלים דרוזופילה melanogaster

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

שחייה המושרה שיתוק כדי להעריך דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

הדמיית סידן באלגנים של Caenorhabditis המתנהגים בחופשיות עם רטט מבוקר היטב, שאינו מלוטש

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

מאכיל מיקרו-תפוקה גבוהה לבדיקה לכימות הצריכה בדרוסופילה

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...