Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta da borse di ricerca del National Institutes of Health al JHR (#R01 5R01HD081266 e #R01GM141493). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440). Vorremmo ringraziare Pradeep Joshi (UCSB) per il suo contributo editoriale. Consulenza statistica fornita dall'UCSB DATALAB.

I ceppi utilizzati nel presente studio sono C. elegans (N2) e C. briggsae (AF16) (vedi tabella dei materiali). Per ogni test è stata utilizzata una popolazione mista di dauers.
1. Preparazione della camera
<ol><li>Lavora in una cappa aspirante. Impostare l'area di lavoro con un bruciatore Bunsen, 1-2 lamette da barba, pinze, pinzette e una superficie di taglio in plastica (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Per ogni ...

<ol>
	<li>Peterka, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. 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Confronto con i metodi precedenti A differenza della chemiotassi, la gravitassi in Caenorhabditis non può essere osservata in modo affidabile utilizzando un tradizionale progetto sperimentale di piastra di agar. Una capsula di Petri standard ha un diametro di 150 mm, risultando in soli 75 mm disponibili in entrambe le direzioni per i dauers per dimostrare la preferenza per la gravitaxi. Sebbene la preferenza orientativa di C. elegans possa essere saggiata nella soluzione<sup class="...

Percepire l'attrazione gravitazionale della Terra è cruciale per l'orientamento, il movimento, la coordinazione e l'equilibrio di molti organismi. Tuttavia, i meccanismi molecolari e i neurocircuiti della sensazione di gravità sono poco compresi rispetto ad altri sensi. Negli animali, la sensazione di gravità interagisce e può essere superata da altri stimoli per influenzare il comportamento. Segnali visivi, feedback propriocettivi e informazioni vestibolari possono essere integrati per generare un senso di consapevolezza del corpo rispetto all'ambiente circostante di un animale 1,2. Al contrario, la preferenza gravitattica può essere alterata in presenza di altri stimoli 3,4,5. Pertanto, il comportamento gravitattico è ideale per studiare la sensazione di gravità e comprendere la complessa integrazione sensoriale e il processo decisionale del sistema nervoso.
C. elegans è un organismo modello particolarmente utile per lo studio della gravitassi a causa del suo ciclo di vita polifenico. Se esposte a fattori di stress durante lo sviluppo, tra cui calore, sovraffollamento o mancanza di cibo, le larve di C. elegans si sviluppano in dauers, che sono altamente resistenti allo stress6. Come dauers, i vermi svolgono comportamenti caratteristici, come la nictazione, in cui i vermi "stanno in piedi" sulla coda e agitano la testa, che possono facilitare la dispersione verso habitat migliori7. I saggi di gravitaxis di C. elegans e C. japonica suggeriscono che le larve di dauer gravitassano negativamente e che questo comportamento è più facilmente osservato nei pazienti che negli adulti 8,9. Il test della gravitassi in altri ceppi di Caenorhabditis può rivelare variazioni naturali nel comportamento gravitattico.
I meccanismi per la sensazione di gravità sono stati caratterizzati in Euglena, Drosophila, Ciona e varie altre specie usando i saggi di gravitaxis 3,10,11. Nel frattempo, gli studi sulla gravitaxis a Caenorhabditis inizialmente hanno fornito risultati contrastanti. Uno studio sulla preferenza orientativa di C. elegans ha scoperto che i vermi si orientano a testa bassa in soluzione, suggerendo una preferenza gravitattica positiva12. Nel frattempo, sebbene i dauers di C. japonica siano stati identificati precocemente come gravitattici negativi8, questo comportamento è stato descritto solo recentemente in C. elegans9. Diverse sfide sorgono nello sviluppo di un saggio di gravitaxis rappresentativo nei vermi. I ceppi di Caenorhabditis sono mantenuti su piastre di agar; Per questo motivo, i saggi comportamentali utilizzano tipicamente piastre di agar come parte del loro disegno sperimentale13,14,15. Il primo test di gravitassi riportato in Caenorhabditis è stato eseguito posizionando una piastra su un lato con un angolo di 90 ° rispetto alla piastra di controllo orizzontale8. Tuttavia, il comportamento della gravitassi non è sempre robusto in queste condizioni. Mentre i vermi adulti possono essere saggiati per la preferenza orientativa nella soluzione12, questa preferenza direzionale può anche essere dipendente dal contesto, portando a comportamenti diversi se i vermi strisciano piuttosto che nuotare. Inoltre, C. elegans è sensibile ad altri stimoli, tra cui la luce e i campi elettromagnetici16,17, che interferiscono con le loro risposte alla gravità9. Pertanto, un test di gravitassi aggiornato che scherma contro altre variabili ambientali è importante per sezionare i meccanismi di questo processo sensoriale.
Nel presente protocollo viene descritto un saggio per l'osservazione della Caenorhabditis gravitaxis. La configurazione di questo studio si basa in parte su un metodo sviluppato per studiare l'integrità neuromuscolare18,19. Le larve di Dauer sono coltivate e isolate con procedure standard20. Vengono quindi iniettati in camere costituite da due pipette sierologiche da 5 ml riempite con agar. Queste camere possono essere orientate verticalmente o orizzontalmente e posizionate all'interno di una gabbia di Faraday buia per 12-24 ore per schermare dalla luce e dai campi elettromagnetici. La posizione di ciascun verme nelle camere viene registrata e confrontata con i taxi verticali di un ceppo di riferimento come C. elegans N2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

La sensazione di gravità è un processo importante e relativamente poco studiato. Il rilevamento della gravità consente agli animali di navigare nell'ambiente circostante e facilita il movimento. Inoltre, la sensazione di gravità, che si verifica nell'orecchio interno dei mammiferi, è strettamente correlata all'udito - quindi, la comprensione di questo processo ha implicazioni per la ricerca uditiva e vestibolare. Esistono saggi di gravitassi per alcuni organismi modello, tra cui Drosophila. I singoli vermi sono stati precedentemente analizzati per la loro preferenza di orientamento mentre si depositano in soluzione. Tuttavia, non è stato descritto un test affidabile e robusto per Caenorhabditis gravitaxis. Il presente protocollo delinea una procedura per l'esecuzione di saggi di gravitasi che possono essere utilizzati per testare centinaia di caenorhabditis alla volta. Questo test su larga scala e a lunga distanza consente una raccolta dettagliata dei dati, rivelando fenotipi che potrebbero non essere rilevati in un test standard basato su piastra. Il movimento Dauer lungo l'asse verticale viene confrontato con i controlli orizzontali per garantire che la polarizzazione direzionale sia dovuta alla gravità. La preferenza gravitattica può quindi essere confrontata tra ceppi o condizioni sperimentali. Questo metodo può determinare i requisiti molecolari, cellulari e ambientali per la gravitassi nei vermi.

Confronto tra gravitassi tra specie Seguendo la procedura sopra descritta, C. briggsae dauer gravitaxis può essere confrontato con C. elegans gravitaxis e controlli orizzontali. La distribuzione verticale (marrone) dei dauers di C. briggsae è inclinata verso le sommità delle camere, con una grande percentuale di vermi che raggiunge +7 (Figura 2A). In contrasto con i controlli orizzontali (aqua), in cui i dauers sono distribuiti in una curva a...

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Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Il presente protocollo delinea i metodi per condurre un test gravitazionale su larga scala con larve di Caenorhabditis dauer. Questo protocollo consente una migliore rilevazione del comportamento della gravitassi rispetto a un test basato su piastra.

Saggio gravitazionale su larga scala delle larve di Caenorhabditis dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Questo test ad alto rendimento può essere utilizzato per osservare un robusto comportamento gravitattico nelle larve di caenorhabditis dauer. Il comportamento del verme è osservato su grandi distanze rispetto ai saggi eseguiti su una capsula di Petri. Ciò migliora la sensibilità del test e consente un'analisi dettagliata dei dati.Lo studio del comportamento della gravitassi può fornire informazioni su come si verifica la sensazione di gravità nella caenorhabditis, che ha rilevanza per la comprensione del sistema vestibolare dei mammiferi. Creare le camere di analisi della gravitaxi, isolare i dauers e iniettare i vermi nelle camere richiede pratica. È possibile risparmiare tempo isolando i dauers e creando le camere con un giorno di anticipo.Inizia installando un bruciatore Bunsen, una o due lamette da barba, pinze, pinzette e una superficie di taglio in plastica e una cappa aspirante. Per creare una camera, raccogliere due pipette sierologiche da 5 millilitri e, con una pinzetta, rimuovere il tappo di cotone da una pipetta. Tenere una lametta usando una pinza sul bruciatore Bunsen fino a quando non è caldo.Utilizzare la lama riscaldata per tagliare l'estremità conica della seconda pipetta in modo che l'intera pipetta abbia un diametro uniforme. Ora, avvicinare rapidamente le due estremità della pipetta modificate alla fiamma e scioglierle leggermente. Unire queste estremità premendole saldamente, assicurandosi che le pareti di entrambe le pipette siano continue.Se sono visibili degli spazi vuoti dopo l'unione, spezzarli e ripetere questo passaggio. Preparare NGM con il 4% di agar secondo le procedure standard di verme e riempire ogni camera collegandola a un pipetter sierologico mentre l'agar è ancora fuso. Per ridurre al minimo eventuali variazioni nella consistenza dell'agar dovute a un raffreddamento non uniforme, tenere il pipetter parallelo al piano del banco mentre si disegna l'agar.Quindi aspirare lentamente la soluzione e sigillare la punta con parafilm prima di rimuovere la camera dal pipetter. Appoggiare la camera piatta per raffreddare e lasciare che l'agar si indurisca prima di muoversi. Una volta raffreddato, riscaldare una chiave esagonale da tre millimetri su un bruciatore Bunsen e creare una piccola apertura di plastica premendola saldamente nella parete di ciascuna camera a circa cinque millimetri da un lato della linea mediana.Quindi, utilizzare una lama riscaldata per rimuovere il cotone e le estremità affusolate della camera e sigillare le estremità con pellicola di paraffina. Da 10 a 15 giorni prima dell'esperimento, suddividere ogni ceppo su due o tre grandi piastre NGM con batteri OP50 e avvolgere il film di paraffina. Raccogliere i vermi sciacquando i coperchi e le piastre con M9 Buffer e pipettando la soluzione in provette da centrifuga da 15 millilitri.Pellettare i vermi ruotando a 1600 x G per 30-60 secondi a temperatura ambiente e aspirare la maggior parte del tampone M9 con una pipetta o un aspiratore a vuoto. Aggiungere sette millilitri di soluzione di dodecilsolfato di sodio all'1% a ciascun pellet di verme e lasciare i vermi in esso per 30 minuti. Per consentire l'aerazione, continuare a ruotare continuamente i tubi durante questo periodo.Quindi, rimuovere il detergente risciacquandolo da tre a cinque volte con M9. Dopo aver aggiunto cinque millilitri di M9, aggiungere cinque millilitri di soluzione di saccarosio filtrata a freddo al 60%. Mescolare accuratamente e creare un gradiente di separazione centrifugando a 1600 x G per cinque minuti a temperatura ambiente. Riempire nuovi tubi da centrifuga da 15 millilitri con due millilitri di M9 Buffer.Ora schiacciare le estremità delle pipette Pasteur di vetro per allargare il foro. E utilizzare queste pipette per trasferire lo strato superiore della soluzione dal gradiente di saccarosio ai nuovi tubi. Risciacquare i dauers da tre a cinque volte con M9 Buffer.Centrifugare a 1600 x G per cinque minuti a temperatura ambiente e aspirare la maggior parte della soluzione M9 con una pipetta o un aspiratore a vuoto. Quindi, stimare la densità dei vermi contando manualmente il numero di vermi in tre goccioline separate da 1 microlitro al microscopio da dissezione e utilizzare la media di questi conteggi per approssimare il numero di vermi per microlitro. Ora allargare il foro della punta tagliando l'estremità delle punte delle pipette da 10, 20 o 200 microlitri.Impostare la micropipetta su un volume leggermente maggiore rispetto al volume di aspirazione previsto. Aspirare circa 1-2 microlitri della soluzione concentrata di vite senza fine e lasciare entrare una piccola quantità di aria nella punta. Spingere delicatamente la punta della pipetta nell'agar mentre si preme la micropipetta.Questo creerà un sito di iniezione senza intasare la punta. Rilasciare i vermi nell'agar e utilizzare la pellicola di paraffina per sigillare l'apertura. Per eliminare il maggior numero possibile di variabili una volta che le camere sono posizionate all'interno di una gabbia di Faraday buia a temperatura ambiente, etichettare ogni camera e appenderla verticalmente all'interno della gabbia di Faraday.Testare i controlli orizzontali contemporaneamente posizionando alcune camere piatte nelle stesse condizioni ambientali. Quindi utilizzare i vermi N2 orientati verticalmente come controllo positivo e le camere orientate orizzontalmente contenenti Dauers N2 come ulteriore controllo negativo contro i ceppi sperimentali. Dopo alcune ore, i vermi dauer iniziano a disperdersi dal sito di partenza e impiegano diverse ore per raggiungere entrambe le estremità della camera.Lasciare le camere indisturbate durante questo periodo e segnare entro 12-24 ore dopo l'iniezione. Quindi, rimuovere le camere una alla volta e valutare i gravitassi cercando i dauers vivi al microscopio da dissezione e contrassegnando le loro posizioni con l'inchiostro. Non segnare i vermi entro 2,5 centimetri da entrambi i lati del sito di iniezione poiché è improbabile che questi vermi dimostrino una preferenza direzionale.Inoltre, evitare di segnare vermi che sembrano morti o intrappolati nel liquido e scartare tutte le camere contenenti più del 50% di vermi morti o nuotatori. Per quantificare i risultati, utilizzare un marcatore per dividere ciascuna metà della camera in sette 3,5 centimetri, a partire da 2,5 centimetri di distanza dal sito di iniezione. Utilizzare un contatore di conteggio manuale per calcolare il numero di worm osservati in ogni sezione.In caenorhabditis briggsae, una grande percentuale di vermi dauer ha mostrato una migrazione verso la parte superiore delle camere. Tuttavia, i controlli orizzontali hanno mostrato una distribuzione attorno al centro delle camere, indicando un comportamento gravitattico negativo. Inoltre, le distribuzioni verticali di caenorhabditis briggsae e caenorhabditis elegans non hanno mostrato alcuna differenza, suggerendo che i caenorhabditis briggsae dauers mostrino un comportamento gravitasico negativo simile a quello di caenorhabditis elegans dauers.Gli agenti paralitici come l'azoturo di sodio non sono utilizzati in questo protocollo. Pertanto, è importante segnare le camere gravitassi non appena vengono rimosse dalla gabbia di Faraday. Questo test ha portato alla scoperta del comportamento gravitazionale negativo nei c.elegans.Attraverso il test di diversi ceppi mutanti, ha anche rivelato requisiti genetici e neurali per la gravitassi nei vermi.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

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Comportamento

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A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

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Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

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An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

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Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

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