Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
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本研究は、米国国立衛生研究所からJHRへの研究助成金(#R01 5R01HD081266および#R01GM141493)の支援を受けて行われました。一部の菌株は、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されているCGCによって提供されました。プラディープ・ジョシ(UCSB)の編集上の意見に感謝します。UCSB DATALABが提供する統計コンサルティング。

本研究で使用した菌株は、C. エレガンス (N2)と C.ブリグサエ (AF16)です( 資料表を参照)。ダウアーの男女混合集団を各アッセイに使用した。
1. チャンバーの準備
<ol><li>ドラフトで作業します。ブンゼンバーナー、1〜2個のかみそりの刃、ペンチ、ピンセット、およびプラスチック製の切断面を使用してワークスペースをセットアップ...

<ol>
	<li>Peterka, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. 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従来工法との比較 走化性とは異なり、 カエノラブディティス のグラビタキシスは、従来の寒天プレート実験デザインを使用して確実に観察することはできません。標準的なペトリ皿は直径150mmで、ダウアーが重力の好みを示すためにどちらの方向にも75mmしか利用できません。 C. elegansの 配向選好は溶液12でアッセイできますが、この方法はワー...

地球の引力を感知することは、多くの生物の方向、動き、調整、およびバランスにとって非常に重要です。しかし、重力感覚の分子機構や神経回路は、他の感覚に比べてよくわかっていません。動物では、重力感覚は相互作用し、行動に影響を与えるために他の刺激と競争することができます。視覚的手がかり、固有受容感覚的フィードバック、および前庭情報を統合して、動物の周囲に対する身体意識の感覚を生成することができる1,2。逆に、重量性嗜好は、他の刺激の存在下で変化させることができる3、4、5。したがって、重力行動は、重力感覚を研究し、神経系の複雑な感覚統合と意思決定を理解するのに理想的です。
C. elegansは、そのポリフェニックライフサイクルのために、グラビタキシスを研究するための特に有用なモデル生物です。発育中に熱、過密、食物不足などのストレッサーにさらされると、C.エレガンスの幼虫はストレス耐性の高いダウアーに成長します6。ダウアーとして、ワームは、ワームが尾に「立ち」、頭を振るニクテーションなどの特徴的な行動を実行し、より良い生息地への分散を促進する可能性があります7。C. elegansとC. japonicaのGravitaxisアッセイは、ダウアー幼虫が負の重力を負にすることを示唆しており、この行動は成虫よりもダウアーでより容易に観察されます8,9。他のカエノラブディティス株でグラビタキシスをテストすると、重力作用の自然な変化が明らかになる可能性があります。.
重力感覚のメカニズムは、ユーグレナ、ショウジョウバエ、シオナ、およびその他のさまざまな種で、グラビタキシスアッセイ3、10、11を使用して特徴付けられています。一方、カエノラブディティスのグラビタキシス研究では、当初はさまざまな結果が得られました。C. elegansの配向選好に関する研究では、ワームは溶液中で頭を下にして配向し、正の重力嗜好を示唆していることがわかりました12。一方、C. japonica dauersは早い段階で負の重力8であることが確認されていましたが、この行動はC. elegans9で最近記述されたばかりです。ワームの代表的なグラビタキシスアッセイの開発には、いくつかの課題が生じます。カエノラブディティス株は寒天プレート上で維持されます。このため、行動アッセイは通常、実験デザインの一部として寒天プレートを使用します13、14、15。カエノラブディティスで最も早く報告された重力試験は、水平コントロールプレート8に対して90°の角度でプレートを横に立てることによって実行されました。ただし、重力タクシーの挙動は、これらの条件下で常に堅牢であるとは限りません。.成虫は溶液12で向きの好みをアッセイできますが、この方向の好みは状況に依存する可能性があり、ワームが泳ぐのではなく這っている場合は異なる行動につながります。さらに、C.エレガンスは、重力9に対するそれらの応答を妨げる光および電磁場16,17を含む他の刺激に敏感である。したがって、他の環境変数から保護する最新の重力試験は、この感覚プロセスのメカニズムを分析するために重要です。
本プロトコールでは、カラビタキシスを観察するためのアッセイが記載されている。この研究のセットアップは、神経筋の完全性を研究するために開発された方法に部分的に基づいています18,19。ダウアー幼虫を培養し、標準的な手順20を用いて単離する。次に、寒天で満たされた2つの5 mL血清学的ピペットから作られたチャンバーに注入されます。これらのチャンバーは、垂直または水平に向けることができ、暗いファラデーケージ内に12〜24時間配置して、光および電磁界から遮蔽することができます。チャンバー内の各ワームの位置が記録され、C.エレガンスN2などの基準株の垂直タクシーと比較されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

重力感覚は重要で比較的研究されていないプロセスです。重力を感知することで、動物は周囲をナビゲートし、動きを容易にすることができます。さらに、哺乳類の内耳で発生する重力感覚は聴覚と密接に関連しているため、このプロセスを理解することは、聴覚および前庭研究に影響を及ぼします。グラビタキシスアッセイは、 ショウジョウバエを含むいくつかのモデル生物に存在します。単一のワームは、溶液に定着する際の配向の好みについて以前にアッセイされています。ただし、 カエノラブディティス グラビタキシスの信頼性が高く堅牢なアッセイは記載されていません。.本プロトコルは、一度に数百の カエノラブディティス ダウアーを試験するために使用できるグラビタキシスアッセイを実行するための手順を概説しています。この大規模な長距離アッセイにより、詳細なデータ収集が可能になり、標準的なプレートベースのアッセイでは見逃される可能性のある表現型が明らかになります。垂直軸に沿ったダウアーの動きを水平コントロールと比較し、方向バイアスが重力によるものであることを確認します。次いで、重力選好を、菌株間または実験条件間で比較することができる。この方法は、ワームの重力症の分子、細胞、および環境要件を決定できます。

種間の重力差の比較 上記の手順に従って、 C. briggsae dauer gravitaxisは、 C. elegans gravitaxisおよび水平コントロールと比較することができる。 C. briggsae dauersの垂直分布(あずき色)はチャンバーの上部に偏っており、ワームの大部分は+7に達します(図2A)。ダウアーがチャンバーの中心の周りにほぼ釣鐘型の曲線で分布している水平コントロー?...

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Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

本プロトコルは、 カエノラブディティス ・ダウアー幼虫を用いて大規模な重力試験を実施するための方法を概説する。このプロトコルにより、プレートベースのアッセイと比較して、グラビタキシスの挙動をより適切に検出できます。

ダウアー幼虫の大規模グラビタキシスアッセイ

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

このハイスループットアッセイは、カエノラブディティス・ダウアー幼虫の堅牢な重量行動を観察するために使用できます。ワームの挙動は、シャーレで行われたアッセイと比較して、長距離にわたって観察されます。これにより、アッセイの感度が向上し、詳細なデータ分析が可能になります。重力作用を研究することで、盲腸炎で重力感覚がどのように発生するかについての洞察が得られ、哺乳類の前庭系を理解するのに役立ちます。グラビタキシスアッセイチャンバーの作成、ダウアーの分離、チャンバーへのワームの注入には練習が必要です。ダウアーを隔離し、前日にチャンバーを作成することで時間を節約できます。ブンゼンバーナー、1〜2個のかみそりの刃、ペンチ、ピンセット、プラスチック製の切断面、およびドラフトを設置することから始めます。チャンバーを作るには、2つの5ミリリットルの血清学的ピペットを集め、ピンセットで1つのピペットから綿プラグを取り外します。ペンチを使用してかみそりの刃をブンゼンバーナーの上に熱くなるまで保持します。加熱されたブレードを使用して、ピペット全体の直径が均一になるように、2番目のピペットのテーパー端を切り取ります。次に、2つの変更されたピペットの端をすばやく炎に近づけ、わずかに溶かします。両端をしっかりと押し合わせて接合し、両方のピペットの壁が連続していることを確認します。結合後にギャップが見える場合は、それらを分解してこの手順を繰り返します。標準的なワーム手順に従って4%寒天でNGMを調製し、寒天がまだ溶けている間に血清学的ピペッターに取り付けて各チャンバーを満たします。不均一な冷却による寒天の粘稠度の変動を最小限に抑えるために、寒天を引き上げながらピペッターをベンチトップと平行に保持します。次に、溶液をゆっくりと吸引し、チップをパラフィルムで密封してから、チャンバーをピペッターから取り出します。チャンバーを平らに置いて冷却し、寒天を硬化させてから移動します。冷却したら、ブンゼンバーナーで3ミリメートルの六角レンチを加熱し、正中線の片側に約5ミリメートルの各チャンバーの壁にしっかりと押し込んで小さなプラスチック開口部を作成します。次に、加熱されたブレードを使用して、チャンバーの綿と先細りの端を取り除き、端をパラフィンフィルムで密封します。実験の10〜15日前に、各菌株をOP50細菌を含む2〜3個の大きなNGMプレートにチャンクし、パラフィンフィルムを包みます。蓋とプレートをM9バッファーですすぎ、溶液を15ミリリットルの遠沈管にピペッティングして、ワームを収集します。1600 x Gで室温で30〜60秒間回転させてワームをペレット化し、ピペットまたは真空アスピレーターでM9バッファーの大部分を吸引します。各ワームペレットに7ミリリットルの1%ドデシル硫酸ナトリウム溶液を加え、その中にワームを30分間放置します。曝気を可能にするために、この間チューブを継続的に回転させ続けます。次に、洗剤をM9で3〜5回すすいで取り除きます。5ミリリットルのM9を加えた後、5ミリリットルの冷濾過された60%スクロース溶液を加える。十分に混合し、室温で1600 x Gで5分間遠心分離することにより、分離勾配を作成します。新しい15ミリリットルの遠心分離機チューブに2ミリリットルのM9バッファーを充填します。次に、ガラスパスツールピペットの端をつぶして、穴を広げます。そして、これらのピペットを使用して、溶液の最上層をスクロース勾配から新しいチューブに移します。M9バッファーでダウアーを3〜5回すすぎます。1600 x Gの遠心分離機で室温で5分間遠心分離し、ピペットまたは真空アスピレーターでM9溶液の大部分を吸引します。次に、解剖顕微鏡下で3つの別々の1マイクロリットルの液滴中のワームの数を手動でカウントすることによってワーム密度を推定し、これらのカウントの平均を使用してマイクロリットルあたりのワームの数を概算します。次に、10、20、または200マイクロリットルのピペットチップの端を切断して、チップボアを広げます。マイクロピペットを意図した吸引量よりわずかに大きい容量に設定します。約1〜2マイクロリットルの濃縮ワーム溶液を吸引し、少量の空気が先端に入るようにします。マイクロピペットを押し下げながら、ピペットチップを寒天にそっと押し込みます。これにより、先端を詰まらせることなく注射部位が作成されます。ワームを寒天に放出し、パラフィンフィルムを使用して開口部を密閉します。チャンバーが室温の暗いファラデーケージ内に置かれた後、できるだけ多くの変数を排除するには、各チャンバーにラベルを付け、ファラデーケージ内で垂直に吊るします。同じ環境条件内でいくつかのチャンバーを平らに置くことにより、水平制御を同時にテストします。次に、垂直方向のN2ワームをポジティブコントロールとして使用し、N2ダウアーを含む水平方向のチャンバーを実験株に対する追加のネガティブコントロールとして使用します。数時間後、ダウアーワームは開始場所から分散し始め、チャンバーの両端に到達するまでに数時間かかります。この間、チャンバーを邪魔せずに放置し、注射後12〜24時間以内にスコアを付けます。次に、チャンバーを一度に1つずつ取り外し、解剖顕微鏡で生きているダウアーを探し、その場所にインクで印を付けて、重力タクシーをスコアリングします。注射部位の両側から2.5センチメートル以内のワームは、方向の好みを示している可能性が低いため、スコアを付けないでください。また、死んでいるように見えるワームや液体に閉じ込められているワームのスコアリングを避け、50%を超える死んだワームや泳いでいるワームを含むチャンバーは廃棄してください。結果を定量化するには、マーカーを使用して、チャンバーの各半分を注射部位から2.5センチメートル離れたところから始めて、7つの3.5センチメートルに分割します。手動集計カウンターを使用して、各セクションで観察されたワームの数を集計します。カエノラブディティス・ブリッグサエでは、ダウアーワームの大部分がチャンバーの上部に向かって移動を示しました。しかし、水平コントロールはチャンバーの中心付近に分布を示し、負の重力挙動を示しました。また、カエノラブディティス・ブリグサエとカエノラブディティス・エレガンスの鉛直分布は差を示さず、カエノラブディティス・ブリグサエ・ダウアーはカエノラブディティス・エレガンス・ダウアーと同様の負の重力作用を示すことが示唆された。アジ化ナトリウムなどの麻痺剤は、このプロトコルでは使用されません。したがって、重力槽がファラデーケージから取り外されたらすぐにスコアを付けることが重要です。このアッセイは、c.elegansにおける負の重力作用の発見につながりました。いくつかの変異株をテストすることにより、ワームのグラビタキシスの遺伝的および神経的要件も明らかにしました。

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

非対称遊歩道：非対称歩行研究のための新しい行動アッセイ

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

筋ジストロフィーのマウス ・ モデルで歩行を測定するためのシンプルで低コスト分析

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

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潜入/トンネル用キイロショウジョウバエ幼虫における低酸素の検出

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるドーパミン伝達を評価するスイミング麻痺

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

自由に行動する カエノルハブディティス・エレガンス におけるカルシウムイメージングと、十分に制御された非局在振動

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

ショウジョウバエ幼虫における機械的な結知を測定するための改善されたアッセイとツール

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

ミトコンドリア病の ケノハブディティス・エレガンス モデルにおける動物活動量の定量化に関する実験法の比較分析

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

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ショウジョウバエの消費定量化のための高スループットマイクロプレートフィーダアッセイ

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...