Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

이 연구는 국립 보건원에서 JHR (#R01 5R01HD081266 및 #R01GM141493)에 대한 연구 보조금으로 지원되었습니다. 일부 균주는 NIH 연구 인프라 프로그램 사무소 (P40 OD010440)가 자금을 지원하는 CGC에서 제공했습니다. 우리는 Pradeep Joshi (UCSB)의 편집 의견에 감사드립니다. UCSB DATALAB에서 제공하는 통계 상담.

본 연구에 사용된 균주는 C. 엘레간스 (N2) 및 C. 브릭스새( AF16)입니다( 재료 표 참조). dauers의 혼합 성별 집단이 각 분석에 사용되었습니다.
1. 챔버 준비
<ol><li>흄 후드에서 작업하십시오. 분젠 버너, 면도날 1-2개, 펜치, 핀셋 및 플라스틱 절단 표면으로 작업 공간을 설정합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>각 챔버에 대해 두 개의 5...

<ol>
	<li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+for+human+balance+control.">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li><li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates.">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).</li><li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors.">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li><li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis.">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li><li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway.">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391 (2014).</li><li>Fr&#233;zal, L., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+outside+the+Petri+dish.">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans,+is+regulated+by+IL2+neurons.">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li><li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae.">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li><li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans.">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>H&#228;der, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitaxis+in+Euglena.">Gravitaxis in Euglena.</a> Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston's+organ.">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li><li>Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis.">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+chemotaxis+assay.">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans.">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493 (2015).</li><li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals.">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae.">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).</li><li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+dauer+larvae.">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li><li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn's+test.">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li><li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+a+sensible+model+for+sensory+biology.">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li><li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li><li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound.">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li><li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans.">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).</li><li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans.">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).</li><li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels.">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li><li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron.">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).</li><li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear.">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li><li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+the+vestibular+system.">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li><li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+vestibular+syndromes.">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li><li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders.">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).</li><li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hearing+and+balance.">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567 (2019).</li></ol>

이전 방법과의 비교 화학주성과는 달리, Caenorhabditis 의 중력은 전통적인 한천 플레이트 실험 설계를 사용하여 안정적으로 관찰할 수 없습니다. 표준 페트리 접시는 직경이 150mm이므로 다우어가 중력 선호도를 입증하기 위해 어느 방향으로든 75mm만 사용할 수 있습니다. C. elegans의 방향 선호도는 용액12에서 분석할 수 있지만 이 방법은 웜을 한 번에 하?...

지구의 중력을 감지하는 것은 많은 유기체의 방향, 움직임, 조정 및 균형에 매우 중요합니다. 그러나 중력 감각의 분자 메커니즘과 신경 회로는 다른 감각에 비해 잘 이해되지 않습니다. 동물에서 중력 감각은 행동에 영향을 미치는 다른 자극과 상호 작용하고 경쟁할 수 있습니다. 시각적 단서, 고유 감각 피드백 및 전정 정보를 통합하여 동물의 주변 환경에 대한 신체 인식 감각을 생성 할 수 있습니다 1,2. 반대로, 중력 선호도는 다른 자극 3,4,5의 존재 하에서 변경 될 수있다. 따라서 중력 행동은 중력 감각을 연구하고 신경계의 복잡한 감각 통합 및 의사 결정을 이해하는 데 이상적입니다.
C. elegans는 polyphenic 수명주기 때문에 중력을 연구하는 데 특히 유용한 모델 유기체입니다. 발달 중 더위, 과밀 또는 식량 부족을 포함한 스트레스 요인에 노출되면 C. elegans 유충은 스트레스에 강한 다우어로 발달합니다6. dauers로서, 벌레는 벌레가 꼬리에 "서서"머리를 흔드는 nictation과 같은 특징적인 행동을 수행하여 더 나은 서식지로 분산을 촉진 할 수 있습니다7. C. elegans와 C. japonica의 중력 분석은 dauer 유충이 부정적인 중력을 시사하며, 이러한 행동은 성인보다 dauers에서 더 쉽게 관찰됩니다 8,9. 다른 Caenorhabditis 균주에서 중력을 테스트하면 중력 행동의 자연적 변화가 나타날 수 있습니다.
중력 감각에 대한 메커니즘은 유글레나, 초파리, 시오나 및 중력 분석 3,10,11을 사용하는 다양한 다른 종에서 특성화되었습니다. 한편, Caenorhabditis에 대한 중력 연구는 처음에 혼합 된 결과를 제공했습니다. C. elegans 방향 선호도에 대한 연구에 따르면 벌레는 용액에서 머리를 아래로 향하게 하여 긍정적인 중력 선호도를 시사합니다12. 한편, C. japonica dauers는 초기에 음의 중력8로 확인되었지만,이 행동은 최근에야 C. elegans9에서 설명되었습니다. 웜에서 대표적인 중력 분석을 개발하는 데 몇 가지 문제가 발생합니다. Caenorhabditis 균주는 한천 플레이트에서 유지됩니다. 이러한 이유로 행동 분석은 일반적으로 실험 설계13,14,15의 일부로 한천 플레이트를 사용합니다. Caenorhabditis에서 가장 초기에 보고된 중력 분석은 수평 대조군플레이트(8)에 대해 90° 각도로 플레이트를 측면에 세워서 수행되었습니다. 그러나 중력 거동이 이러한 조건에서 항상 견고한 것은 아닙니다. 솔루션12에서 성인 웜의 방향 선호도를 분석할 수 있지만 이 방향 기본 설정은 상황에 따라 달라질 수 있으므로 웜이 수영하지 않고 크롤링하는 경우 다른 동작이 발생할 수 있습니다. 또한, C. elegans는 중력에 대한 반응을 방해하는 빛과 전자기장(16,17)을 포함한 다른 자극에 민감하다9. 따라서 다른 환경 변수로부터 보호하는 업데이트된 중력 분석은 이 감각 과정의 메커니즘을 해부하는 데 중요합니다.
본 프로토콜에서, Caenorhabditis 중력을 관찰하기 위한 분석법이 기재되어 있다. 이 연구의 설정은 부분적으로 신경근 무결성18,19를 연구하기 위해 개발 된 방법을 기반으로합니다. Dauer 유충은 표준 절차20을 사용하여 배양 및 분리됩니다. 그런 다음 한천으로 채워진 두 개의 5mL 혈청 학적 피펫으로 만든 챔버에 주입됩니다. 이 챔버는 수직 또는 수평으로 배향 될 수 있으며 빛과 전자기장으로부터 보호하기 위해 12-24 시간 동안 어두운 패러데이 케이지 내에 배치 할 수 있습니다. 챔버에서 각 웜의 위치가 기록되고 C. elegans N2와 같은 기준 균주의 수직 택시와 비교됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

중력 감각은 중요하고 상대적으로 덜 연구된 과정입니다. 중력을 감지하면 동물이 주변을 탐색하고 움직임을 용이하게 할 수 있습니다. 또한 포유류의 내이에서 발생하는 중력 감각은 청각과 밀접한 관련이 있으므로 이 과정을 이해하는 것은 청각 및 전정 연구에 영향을 미칩니다. 중력 분석은 초파리를 포함한 일부 모델 유기체에 대해 존재합니다. 단일 웜은 이전에 용액에 정착 할 때 방향 선호도에 대해 분석되었습니다. 그러나, Caenorhabditis 중력에 대한 신뢰할 수 있고 강력한 분석은 기술되지 않았다. 본 프로토콜은 한 번에 수백 개의 Caenorhabditis dauers를 시험하는데 사용될 수 있는 중력 분석을 수행하는 절차를 간략하게 설명한다. 이 대규모 장거리 분석은 상세한 데이터 수집을 허용하여 표준 플레이트 기반 분석에서 놓칠 수 있는 표현형을 밝힙니다. 수직 축을 따라 다우어 움직임을 수평 컨트롤과 비교하여 방향 바이어스가 중력에 의한 것임을 확인합니다. 그런 다음 중력 선호도를 균주 또는 실험 조건 간에 비교할 수 있습니다. 이 방법은 웜의 중력에 대한 분자, 세포 및 환경 요구 사항을 결정할 수 있습니다.

종 간 중력 비교 위에서 설명한 절차에 따라 C. briggsae dauer 중력은 C. elegans 중력 및 수평 제어와 비교할 수 있습니다. C. briggsae dauers의 수직 분포 (적갈색)는 챔버의 상단쪽으로 치우쳐 있으며 많은 비율의 벌레가 +7에 도달합니다 (그림 2A). dauers가 챔버 중심 주위에 대략 종 모양의 곡선으로 분포하는 수평 제어 (아쿠아)와 대조적으로,이 경향...

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Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

본 프로토콜은 Caenorhabditis dauer 유충으로 대규모 중력 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 플레이트 기반 분석과 비교하여 중력 거동을 더 잘 감지할 수 있습니다.

Caenorhabditis dauer 유충의 대규모 중력 분석

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

이 고처리량 분석은 caenorhabditis dauer 유충에서 강력한 중력 행동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 웜 거동은 페트리 접시에서 수행 된 분석과 비교하여 먼 거리에서 관찰됩니다. 이를 통해 분석의 감도가 향상되고 상세한 데이터 분석이 가능합니다.중력 행동을 연구하면 포유류의 전정 시스템을 이해하는 것과 관련이있는 caenorhabditis에서 중력 감각이 어떻게 발생하는지에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 중력 분석 챔버를 만들고, 다우어를 분리하고, 웜을 챔버에 주입하는 것은 연습이 필요합니다. dauers를 격리하고 하루 전에 챔버를 만들어 시간을 절약 할 수 있습니다.분젠 버너, 면도날 1-2개, 펜치, 핀셋, 플라스틱 절단 표면, 흄 후드를 설정하는 것으로 시작합니다. 챔버를 만들려면 두 개의 5 밀리리터 혈청 학적 피펫을 모으고 핀셋으로 하나의 피펫에서면 플러그를 제거하십시오. 분젠 버너 위에 펜치를 사용하여 면도날을 뜨거울 때까지 잡습니다.가열된 블레이드를 사용하여 두 번째 피펫의 테이퍼 끝을 잘라 전체 피펫의 직경이 균일하도록 합니다. 이제 두 개의 수정된 피펫 끝을 화염에 빠르게 가까이 가져와 약간 녹입니다. 이 끝을 단단히 눌러 결합하여 두 피펫의 벽이 연속적이되도록합니다.조인 후 간격이 보이면 간격을 분리하고 이 단계를 반복합니다. 표준 웜 절차에 따라 4%한천으로 NGM을 준비하고 한천이 아직 녹은 상태에서 혈청학적 피피터에 부착하여 각 챔버를 채웁니다. 고르지 않은 냉각으로 인한 한천의 일관성 변화를 최소화하려면 한천을 그리는 동안 배관공을 벤치 상단과 평행하게 잡으십시오.그런 다음 천천히 용액을 뽑고 피펫터에서 챔버를 제거하기 전에 파라필름으로 팁을 밀봉합니다. 챔버를 평평하게 놓아 식히고 움직이기 전에 한천이 굳도록 합니다. 냉각되면 분젠 버너 위에 3mm 육각 키를 가열하고 정중선의 한쪽으로 약 5mm 떨어진 각 챔버의 벽에 단단히 눌러 작은 플라스틱 구멍을 만듭니다.다음으로, 가열 된 블레이드를 사용하여면과 챔버의 테이퍼 진 끝을 제거하고 끝을 파라핀 필름으로 밀봉하십시오. 실험 10-15일 전에 각 균주를 OP50 박테리아가 있는 2-3개의 큰 NGM 플레이트에 덩어리로 만들고 파라핀 필름을 감쌉니다. M9 버퍼로 뚜껑과 플레이트를 헹구고 용액을 15밀리리터 원심분리 튜브에 피펫팅하여 벌레를 수집합니다.실온에서 30-60초 동안 1600 x G에서 회전하여 벌레를 펠릿화하고 대부분의 M9 버퍼를 피펫 또는 진공 흡인기로 흡입합니다. 각 웜 펠릿에 1 % 나트륨 도데 실 설페이트 용액 7 밀리리터를 넣고 웜을 30 분 동안 그대로 두십시오. 폭기를 허용하려면 이 시간 동안 튜브를 계속 회전시키십시오.그런 다음 M9로 3-5 회 헹구어 세제를 제거하십시오. 5 밀리리터 M9를 첨가 한 후, 5 밀리리터의 냉간 여과 된 60 % 자당 용액을 첨가한다. 철저히 혼합하고 실온에서 5분 동안 1600 x G에서 원심분리하여 분리 구배를 만듭니다. 새 15 밀리리터 원심 분리기 튜브에 2 밀리리터의 M9 버퍼를 채 웁니다.이제 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 부수어 구멍을 넓 힙니다. 그리고이 피펫을 사용하여 용액의 최상층을 자당 구배에서 새 튜브로 옮깁니다. M9 버퍼로 다우어를 3-5회 헹굽니다.실온에서 5 분 동안 1600 x G에서 원심 분리하고 피펫 또는 진공 흡인기로 대부분의 M9 용액을 흡인합니다. 다음으로, 해부 현미경으로 3개의 개별 1마이크로리터 방울에 있는 벌레의 수를 수동으로 계산하여 벌레 밀도를 추정하고 이러한 수의 평균을 사용하여 마이크로리터당 벌레 수를 근사화합니다. 이제 10, 20 또는 200마이크로리터 피펫 팁의 끝을 절단하여 팁 보어를 넓힙니다.마이크로 피펫을 의도 된 흡인 부피보다 약간 큰 부피로 설정하십시오. 약 1-2 마이크로 리터의 농축 된 웜 용액을 흡입하고 소량의 공기가 팁으로 들어가도록합니다. 마이크로 피펫을 누르면서 피펫 팁을 한천에 부드럽게 밀어 넣습니다.이렇게하면 팁이 막히지 않고 주사 부위가 생성됩니다. 웜을 한천에 넣고 파라핀 필름을 사용하여 개구부를 밀봉하십시오. 챔버를 실온의 어두운 패러데이 케이지 안에 넣은 후 가능한 한 많은 변수를 제거하려면 각 챔버에 레이블을 지정하고 패러데이 케이지 내에 수직으로 걸어 놓습니다.동일한 환경 조건 내에서 일부 챔버를 평평하게 놓아 수평 제어를 동시에 테스트합니다. 그런 다음 수직 배향 N2 웜을 양성 대조군으로 사용하고 N2 다우어를 포함하는 수평 배향 챔버를 실험 균주에 대한 추가 음성 대조군으로 사용합니다. 몇 시간 후, dauer 웜은 시작 사이트에서 분산되기 시작하고 챔버의 양쪽 끝에 도달하는 데 몇 시간이 걸립니다.이 시간 동안 챔버를 방해하지 않고 주사 후 12-24 시간 이내에 점수를 매기십시오. 다음으로, 챔버를 한 번에 하나씩 제거하고 해부 현미경으로 살아있는 다우어를 찾고 잉크로 위치를 표시하여 중력을 채점합니다. 주사 부위의 양쪽으로 2.5cm 이내의 웜은 방향 선호도를 나타낼 가능성이 없으므로 점수를 매기지 마십시오.또한 죽은 것처럼 보이거나 액체에 갇힌 웜을 피하고 50 % 이상 죽은 또는 수영 웜이 포함 된 챔버를 폐기하십시오. 결과를 정량화하려면 마커를 사용하여 챔버의 각 절반을 주사 부위에서 2.5cm 떨어진 곳에서 시작하여 7 개의 3.5cm로 나눕니다. 수동 집계 카운터를 사용하여 각 섹션에서 관찰된 웜 수를 집계합니다.caenorhabditis briggsae에서, 많은 비율의 dauer 벌레가 챔버의 상단으로 이동하는 것으로 나타났습니다. 그러나 수평 대조군은 챔버 중심 주변의 분포를 보여 부정적인 중력 거동을 나타냅니다. 또한, caenorhabditis briggsae와 caenorhabditis elegans의 수직 분포는 어떠한 차이도 나타내지 않았으며, 이는 caenorhabditis briggsae dauers가 caenorhabditis elegans dauers와 유사한 음의 중력 거동을 보인다는 것을 시사한다.아지드화 나트륨과 같은 마비 작용제는 이 프로토콜에서 사용되지 않습니다. 따라서 중력실이 패러데이 케이지에서 제거되는 즉시 점수를 매기는 것이 중요합니다. 이 분석은 c.elegans에서 음의 중력 행동의 발견으로 이어졌습니다.여러 돌연변이 균주를 테스트하여 웜의 중력에 대한 유전 적 및 신경 요구 사항도 밝혀 냈습니다.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

비대칭 산책로 : 비대칭 로코 유학을위한 소설 행동 분석

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

연구

행동분석학

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Sialoglycan Microarray Assay를 사용하여 Human Sera에서 Anti-Neu5Gc IgG 프로파일 링

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

근이 영양 증의 마우스 모델에서 Ambulation를 측정 하기 위한 간단 하 고 저렴 한 비용 분석 결과

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

초파리 melanogaster 애벌레에서 Hypoxia의 검출에 대 한 분석 결과 내/터널링

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 에서 도파민 신호 평가에 수영 유도 마비

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

드로소필라 애벌레의 기계적 고치절 측정을 위한 향상된 분석 및 도구

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

드로소필라에서 소비의 정량화를 위한 높은 처리량 마이크로 플레이트 피더 분석

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...