Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av forskningsmidler fra National Institutes of Health til JHR (#R01 5R01HD081266 og #R01GM141493). Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi vil gjerne anerkjenne Pradeep Joshi (UCSB) for hans redaksjonelle innspill. Statistisk konsultasjon levert av UCSB DATALAB.

Stammene som er brukt i denne studien er C. elegans (N2) og C. briggsae (AF16) (se materialtabell). En blandet kjønn befolkning av dauers ble brukt for hver analyse.
1. Kammer forberedelse
<ol><li>Arbeid i en avtrekksvifte. Sett opp arbeidsområdet med en Bunsen-brenner, 1-2 barberblader, tang, pinsett og en skjæreflate i plast (se Materialfortegnelse).</li>
	<li>For hvert kammer samles to 5 ml serologiske pipetter. Fjern...

<ol>
	<li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+for+human+balance+control.">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li><li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates.">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).</li><li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors.">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li><li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis.">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li><li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway.">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391 (2014).</li><li>Fr&#233;zal, L., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+outside+the+Petri+dish.">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans,+is+regulated+by+IL2+neurons.">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li><li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae.">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li><li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans.">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>H&#228;der, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitaxis+in+Euglena.">Gravitaxis in Euglena.</a> Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston's+organ.">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li><li>Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis.">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+chemotaxis+assay.">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans.">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493 (2015).</li><li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals.">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae.">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).</li><li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+dauer+larvae.">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li><li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn's+test.">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li><li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+a+sensible+model+for+sensory+biology.">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li><li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li><li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound.">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li><li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans.">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).</li><li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans.">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).</li><li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels.">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li><li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron.">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).</li><li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear.">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li><li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+the+vestibular+system.">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li><li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+vestibular+syndromes.">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li><li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders.">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).</li><li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hearing+and+balance.">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567 (2019).</li></ol>

Sammenligning med tidligere metoder I motsetning til kjemotaksi kan gravitakse i Caenorhabditis ikke observeres pålitelig ved hjelp av en tradisjonell agarplate eksperimentell design. En standard petriskål er 150 mm i diameter, noe som resulterer i bare 75 mm tilgjengelig i begge retninger for dauers for å demonstrere gravitaxis preferanse. Selv om C. elegans orienteringspreferanse kan analyseres i løsning12, er denne metoden lav gjennomstrømning da ormer...

Å føle jordens gravitasjonskraft er avgjørende for mange organismers orientering, bevegelse, koordinering og balanse. Imidlertid er de molekylære mekanismene og nevrokretsene av tyngdekraftfølelse dårlig forstått sammenlignet med andre sanser. Hos dyr samhandler tyngdekraften med og kan utkonkurreres av andre stimuli for å påvirke atferd. Visuelle signaler, proprioceptiv tilbakemelding og vestibulær informasjon kan integreres for å generere en følelse av kroppsbevissthet i forhold til dyrets omgivelser 1,2. Omvendt kan gravitaktisk preferanse endres i nærvær av andre stimuli 3,4,5. Derfor er gravitaktisk oppførsel ideell for å studere tyngdekraftfølelse og forstå nervesystemets komplekse sensoriske integrasjon og beslutningstaking.
C. elegans er en spesielt nyttig modellorganisme for å studere gravitakse på grunn av sin polyfeniske livssyklus. Når de utsettes for stressorer under utvikling, inkludert varme, overbefolkning eller mangel på mat, utvikler C. elegans larver seg til dauers, som er svært stressbestandige6. Som dauers utfører ormer karakteristisk oppførsel, for eksempel nictation, der ormer "står" på halene og vinker hodet, som kan lette spredning til bedre habitater7. Gravitaxisanalyser av C. elegans og C. japonica antyder at dauer larver negativt gravitax, og at denne oppførselen lettere observeres hos dauers enn hos voksne 8,9. Testing av gravitakse i andre Caenorhabditis-stammer kan avsløre naturlig variasjon i gravitaktisk oppførsel.
Mekanismer for gravitasjonsfølelse har blitt karakterisert i Euglena, Drosophila, Ciona og forskjellige andre arter ved hjelp av gravitaxisanalyser 3,10,11. I mellomtiden ga gravitaxisstudier i Caenorhabditis i utgangspunktet blandede resultater. En studie av C. elegans orienteringspreferanse fant at ormer orienterer seg med hodet ned i løsning, noe som tyder på positiv gravitaktisk preferanse12. I mellomtiden, selv om C. japonica dauers tidlig ble identifisert som negativt gravitactic8, har denne oppførselen bare nylig blitt beskrevet i C. elegans9. Flere utfordringer oppstår ved å utvikle en representativ gravitakseanalyse i ormer. Caenorhabditis stammer opprettholdes på agar plater; Av denne grunn bruker atferdsanalyser vanligvis agarplater som en del av deres eksperimentelle design13,14,15. Den tidligste rapporterte gravitaxisanalysen i Caenorhabditis ble utført ved å stå en plate på siden i en 90 ° vinkel mot den horisontale kontrollplaten8. Gravitaksisadferd er imidlertid ikke alltid robust under disse forholdene. Mens voksne ormer kan analyseres for orienteringspreferanse i løsning12, kan denne retningspreferansen også være kontekstavhengig, noe som fører til forskjellig atferd hvis ormene kryper i stedet for å svømme. I tillegg er C. elegans følsom for andre stimuli, inkludert lys og elektromagnetiske felt16,17, som forstyrrer deres respons på tyngdekraften9. Derfor er en oppdatert gravitakseanalyse som skjold mot andre miljøvariabler viktig for å dissekere mekanismene i denne sensoriske prosessen.
I denne protokollen er en analyse for å observere Caenorhabditis gravitaxis beskrevet. Oppsettet for denne studien er delvis basert på en metode utviklet for å studere nevromuskulær integritet18,19. Dauerlarver dyrkes og isoleres ved hjelp av standardprosedyrer20. De injiseres deretter i kamre laget av to 5 ml serologiske pipetter fylt med agar. Disse kamrene kan orienteres vertikalt eller horisontalt og plasseres i et mørkt Faraday-bur i 12-24 timer for å beskytte mot lys og elektromagnetiske felt. Plasseringen av hver orm i kamrene registreres og sammenlignes med de vertikale taksisene til en referansestamme som C. elegans N2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

Gravitasjonsfølelse er en viktig og relativt understudert prosess. Å føle tyngdekraften gjør det mulig for dyr å navigere i omgivelsene og letter bevegelsen. I tillegg er tyngdekraften, som oppstår i pattedyrets indre øre, nært knyttet til hørsel - og dermed har forståelse av denne prosessen implikasjoner for auditiv og vestibulær forskning. Gravitaxisanalyser finnes for noen modellorganismer, inkludert Drosophila. Enkle ormer har tidligere blitt analysert for deres orienteringspreferanse når de bosetter seg i løsning. En pålitelig og robust analyse for Caenorhabditis gravitaxis er imidlertid ikke beskrevet. Denne protokollen skisserer en prosedyre for å utføre gravitakseanalyser som kan brukes til å teste hundrevis av Caenorhabditis dauers om gangen. Denne storskala, langdistanseanalysen tillater detaljert datainnsamling, og avslører fenotyper som kan gå glipp av på en standard platebasert analyse. Dauer-bevegelse langs den vertikale aksen sammenlignes med horisontale kontroller for å sikre at retningsskjevhet skyldes tyngdekraften. Gravitaktisk preferanse kan deretter sammenlignes mellom stammer eller eksperimentelle forhold. Denne metoden kan bestemme molekylære, cellulære og miljømessige krav til gravitakse i ormer.

Sammenligning av gravitakse på tvers av arter Etter prosedyren som er skissert ovenfor, kan C. briggsae dauer gravitaxis sammenlignes med C. elegans gravitakse og horisontale kontroller. Den vertikale fordelingen (rødbrun) av C. briggsae dauers er skjev mot toppen av kamrene, med en stor prosentandel ormer som når +7 (figur 2A). I motsetning til horisontale kontroller (aqua), der dauers er fordelt i en omtrent klokkeformet kurve rundt midten ...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Denne protokollen skisserer metoder for å gjennomføre en storskala gravitakseanalyse med Caenorhabditis dauer larver. Denne protokollen muliggjør bedre påvisning av gravitaksisoppførsel sammenlignet med en platebasert analyse.

Storskala gravitakseanalyse av Caenorhabditis dauer larver

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Denne analysen med høy gjennomstrømning kan brukes til å observere robust gravitaktisk oppførsel i caenorhabditis dauer larver. Ormens oppførsel observeres over store avstander sammenlignet med analyser utført på en petriskål. Dette forbedrer sensitiviteten til analysen og gir mulighet for detaljert dataanalyse.Studier av gravitaksisadferd kan gi innsikt i hvordan gravitasjonsfølelse oppstår ved caenorhabditis, som har relevans for å forstå pattedyrs vestibulære system. Å lage gravitaxisanalysekamrene, isolere dauers og injisere ormene i kamrene krever øvelse. Du kan spare tid ved å isolere dauers og lage kamrene en dag i forveien.Begynn med å sette opp en Bunsen-brenner, ett til to barberblad, tang, pinsett og en skjæreflate i plast og en avtrekkshette. For å lage et kammer, samle to 5 milliliter serologiske pipetter, og fjern bomullspluggen fra en pipette med pinsett. Hold et barberblad med tang over Bunsen-brenneren til det er varmt.Bruk det oppvarmede bladet til å skjære av den koniske enden av den andre pipetten slik at hele pipetten har en jevn diameter. Nå, ta raskt de to modifiserte pipetteendene nær flammen og smelt dem litt. Bli med i disse endene ved å trykke dem godt sammen, slik at veggene i begge pipettene er kontinuerlige.Hvis noen hull er synlige etter at du har blitt med, bryter du dem fra hverandre og gjentar dette trinnet. Forbered NGM med 4% agar i henhold til standard ormprosedyrer og fyll hvert kammer ved å feste det til en serologisk pipetter mens agar fortsatt er smeltet. For å minimere eventuelle variasjoner i konsistensen av agar på grunn av ujevn avkjøling, hold pipetteren parallelt med benken mens du trekker opp agaren.Trekk deretter løsningen sakte og forsegle spissen med parafilm før du fjerner kammeret fra pipeteren. Legg kammeret flatt for å avkjøle og la agaren herdes før du beveger deg. Når den er avkjølt, varm en tre millimeter sekskantnøkkel over en Bunsen-brenner og lag en liten plaståpning ved å trykke den godt inn i veggen i hvert kammer omtrent fem millimeter til den ene siden av midtlinjen.Bruk deretter et oppvarmet blad for å fjerne bomull og koniske ender av kammeret og forsegle endene med parafinfilm. 10 til 15 dager før eksperimentet, blingsen hver belastning på to til tre store NGM-plater med OP50-bakterier og pakk parafinfilmen. Samle ormer ved å skylle lokkene og platene med M9 Buffer og pipettere løsningen i 15 milliliter sentrifugerør.Pellet ormene ved å spinne ved 1600 x G i 30 til 60 sekunder ved romtemperatur og aspirere det meste av M9 Buffer med en pipette eller vakuumaspirator. Tilsett syv milliliter 1% natriumdodecylsulfatløsning til hver ormpellet og la ormene ligge i den i 30 minutter. For å tillate lufting, fortsett å rotere rørene kontinuerlig i løpet av denne tiden.Fjern deretter vaskemiddelet ved å skylle det tre til fem ganger med M9. Etter å ha tilsatt fem milliliter M9, tilsett fem milliliter kaldfiltrert 60% sukroseløsning. Bland grundig og lag en separasjonsgradient ved sentrifugering ved 1600 x G i fem minutter ved romtemperatur. Fyll nye 15 milliliter sentrifugerør med to milliliter M9 Buffer.Knus nå endene av glass Pasteur-pipetter for å utvide boringen. Og bruk disse pipettene til å overføre det øverste laget av løsningen fra sukrosegradienten til de nye rørene. Skyll dauers tre til fem ganger med M9 Buffer.Sentrifugerdauer ved 1600 x G i fem minutter ved romtemperatur og aspirerer det meste av M9-løsningen med pipette eller vakuumaspirator. Deretter estimerer du ormtettheten ved å manuelt telle antall ormer i tre separate 1-mikroliterdråper under et dissekeringsmikroskop, og bruk gjennomsnittet av disse tellingene til å tilnærme antall ormer per mikroliter. Nå utvider du spissboringen ved å kutte enden av 10, 20 eller 200 mikroliter pipettespisser.Still mikropipetten til et litt større volum enn det tiltenkte aspirasjonsvolumet. Aspirer ca. 1 til 2 mikroliter av den konsentrerte ormoppløsningen og la en liten mengde luft komme inn i spissen. Skyv pipettespissen forsiktig inn i agaren mens du trykker mikropipetten ned.Dette vil skape et injeksjonssted uten å tette spissen. Slipp ormene i agar og bruk parafinfilm for å forsegle åpningen. For å eliminere så mange variabler som mulig når kamrene er plassert i et mørkt Faraday-bur ved romtemperatur, merk hvert kammer og heng det vertikalt i Faraday-buret.Test horisontale kontroller samtidig ved å legge noen kamre flatt innenfor de samme miljøforholdene. Bruk deretter de vertikalt orienterte N2-ormene som en positiv kontroll og horisontalt orienterte kamre som inneholder N2 dauers som en ekstra negativ kontroll mot eksperimentelle stammer. Etter noen timer begynner dauerormene å spre seg fra startstedet og tar flere timer å nå hver ende av kammeret.La kamrene være uforstyrret i løpet av denne tiden og score innen 12 til 24 timer etter injeksjon. Deretter fjerner du kamrene en om gangen og scorer gravitakse ved å lete etter levende dauers under et dissekeringsmikroskop og markere deres steder med blekk. Ikke score ormer innen 2,5 centimeter til hver side av injeksjonsstedet, da disse ormene sannsynligvis ikke viser retningsbestemt preferanse.Unngå også å score ormer som ser ut til å være døde eller er fanget i væsken, og kast kamre som inneholder mer enn 50% døde eller svømmende ormer. For å kvantifisere resultatene, bruk en markør for å dele hver halvdel av kammeret i syv 3,5 centimeter, som starter 2,5 centimeter fra injeksjonsstedet. Bruk en manuell telleteller for å telle antall ormer som er observert i hver seksjon.I caenorhabditis briggsae viste en stor andel dauerormer migrasjon mot toppen av kamrene. Imidlertid viste de horisontale kontrollene distribusjon rundt midten av kamrene, noe som indikerer negativ gravitaktisk oppførsel. De vertikale fordelingene av caenorhabditis briggsae og caenorhabditis elegans viste heller ingen forskjell som tyder på at caenorhabditis briggsae dauers viser en negativ gravitaxisadferd som ligner på caenorhabditis elegans dauers.Paralytiske midler som natriumazid brukes ikke i denne protokollen. Derfor er det viktig å score gravitaksiskamrene så snart de er fjernet fra Faraday-buret. Denne analysen førte til oppdagelsen av negativ gravitaksisadferd i c.elegans.Gjennom testing av flere mutantstammer avslørte den også genetiske og nevrale krav til gravitakse i ormer.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Asymmetrisk Walkway: A Novel Behavioral analyse for å studere asymmetrisk Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Automatisert analyse av en nematode-populasjonsbasert kjemosensorisk preferanseanalyse

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Profiling Anti-Neu5Gc IgG i Human Sera med Sialoglycan Microarray Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

En enkel og rimelig analysen for å måle Ambulation i musen modeller av muskeldystrofi

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

En Burrowing/Tunneling analysen for gjenkjenning av oksygenmangel i Drosophila melanogaster larver

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Svømming indusert lammelse å vurdere dopamin signalering i Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Kalsiumavbildning i fritt oppførende caenorhabditt elegans med godt kontrollert, ikke-lokalisert vibrasjon

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

En forbedret analyse og verktøy for måling av mekanisk nociception i Drosophila Larver

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Komparativ analyse av eksperimentelle metoder for å kvantifisere dyreaktivitet i Caenorhabditis elegans Modeller av mitokondriesykdom

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

En mikroplatemateranalyse med høy gjennomstrømning for kvantifisering av forbruk i Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...