Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde ao JHR (#R01 5R01HD081266 e #R01GM141493). Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Gostaríamos de reconhecer Pradeep Joshi (UCSB) por sua contribuição editorial. Consulta estatística fornecida pelo UCSB DATALAB.

As cepas utilizadas no presente estudo são C. elegans (N2) e C. briggsae (AF16) (ver Tabela de Materiais). Uma população de dauers de sexo misto foi usada para cada ensaio.
1. Preparação da câmara
<ol><li>Trabalhe em um capuz de fumaça. Configure o espaço de trabalho com um queimador Bunsen, 1-2 lâminas de barbear, alicates, pinças e uma superfície de corte de plástico (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Para c...

<ol>
	<li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+for+human+balance+control.">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li><li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates.">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).</li><li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors.">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li><li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis.">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li><li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway.">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391 (2014).</li><li>Fr&#233;zal, L., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+outside+the+Petri+dish.">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans,+is+regulated+by+IL2+neurons.">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li><li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae.">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li><li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans.">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>H&#228;der, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitaxis+in+Euglena.">Gravitaxis in Euglena.</a> Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston's+organ.">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li><li>Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals.">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Ow, M. C., Hall, S. 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(47), e2293 (2011).</li><li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+dauer+larvae.">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li><li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn's+test.">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li><li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. 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D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron.">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).</li><li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear.">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li><li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+the+vestibular+system.">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li><li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. 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Comparação com métodos anteriores Ao contrário da quimiotaxis, a gravitaxis em Caenorhabditis não pode ser observada de forma confiável usando um design experimental tradicional de placa de ágar. Uma placa de Petri padrão tem 150 mm de diâmetro, resultando em apenas 75 mm disponíveis em qualquer direção para dauers demonstrarem preferência gravitaxis. Embora a preferência orientacional de C. elegans possa ser avaliada na solução12, este método...

Sentir a atração gravitacional da Terra é crucial para a orientação, movimento, coordenação e equilíbrio de muitos organismos. No entanto, os mecanismos moleculares e o neurocircuito da sensação gravitacional são mal compreendidos em comparação com outros sentidos. Em animais, a sensação de gravidade interage e pode ser superada por outros estímulos para influenciar o comportamento. Pistas visuais, feedback proprioceptivo e informações vestibulares podem ser integrados para gerar uma sensação de consciência corporal em relação ao entorno de um animal 1,2. Por outro lado, a preferência gravitactica pode ser alterada na presença de outros estímulos 3,4,5. Portanto, o comportamento gravitactic é ideal para estudar a sensação da gravidade e entender a complexa integração sensorial e a tomada de decisões do sistema nervoso.
C. elegans é um organismo modelo especialmente útil para estudar gravitaxis devido ao seu ciclo de vida polifenóico. Quando expostas a estressores durante o desenvolvimento, incluindo calor, superlotação ou falta de alimentos, as larvas C. elegans se desenvolvem em dauers, que são altamente resistentes ao estresse6. Como dauers, os vermes realizam comportamentos característicos, como a nictação, em que os vermes "ficam" em suas caudas e acenam com a cabeça, o que pode facilitar a dispersão para melhores habitats7. Ensaios gravitaxis de C. elegans e C. japonica sugerem que larvas dauer negativamente gravitax, e que este comportamento é mais facilmente observado em dauers do que em adultos 8,9. Testar gravitaxis em outras cepas de Caenorhabditis pode revelar variação natural no comportamento gravitacático.
Mecanismos para a sensação gravitacional têm sido caracterizados em Euglena, Drosophila, Ciona, e várias outras espécies usando ensaios gravitaxis 3,10,11. Enquanto isso, estudos de gravitaxis em Caenorhabditis inicialmente forneceram resultados mistos. Um estudo da preferência orientacional de C. elegans descobriu que os vermes orientam com a cabeça para baixo em solução, sugerindo preferência gravitactica positiva12. Enquanto isso, embora os dauers C. japonica tenham sido identificados no início como sendo negativamente gravitactic8, este comportamento só foi recentemente descrito em C. elegans9. Vários desafios surgem no desenvolvimento de um ensaio representativo de gravitaxis em vermes. As cepas de caenorhabditis são mantidas em placas de ágar; por essa razão, ensaios comportamentais normalmente usam placas de ágar como parte de seu projeto experimental 13,14,15. O ensaio gravitaxis mais antigo relatado em Caenorhabditis foi realizado de pé uma placa ao seu lado em um ângulo de 90° para a placa de controle horizontal8. No entanto, o comportamento gravitaxis nem sempre é robusto nessas condições. Embora os vermes adultos possam ser avaliados para preferência orientacional na solução12, essa preferência direcional também pode ser dependente do contexto, levando a diferentes comportamentos se os vermes estiverem engatinhando em vez de nadar. Além disso, C. elegans é sensível a outros estímulos, incluindo campos leves e eletromagnéticos16,17, que interferem com suas respostas à gravidade9. Portanto, um ensaio gravitaxis atualizado que protege contra outras variáveis ambientais é importante para dissecar os mecanismos desse processo sensorial.
No presente protocolo, é descrito um ensaio para observar caenorhabditis gravitaxis. A configuração deste estudo baseia-se, em parte, em um método desenvolvido para estudar a integridade neuromuscular18,19. As larvas dauer são cultivadas e isoladas usando procedimentos padrão20. Eles são então injetados em câmaras feitas de duas pipetas sorológicas de 5 mL cheias de ágar. Estas câmaras podem ser orientadas vertical ou horizontalmente e colocadas dentro de uma gaiola escura de Faraday por 12-24 h para proteger contra campos claros e eletromagnéticos. A localização de cada verme nas câmaras é registrada e comparada com os táxis verticais de uma cepa de referência como C. elegans N2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

A sensação da gravidade é um processo importante e relativamente subestudado. A percepção da gravidade permite que os animais naveguem em seus arredores e facilite o movimento. Além disso, a sensação gravitacional, que ocorre no ouvido interno dos mamíferos, está intimamente relacionada à audição - assim, entender esse processo tem implicações para pesquisas auditivas e vestibulares. Ensaios gravitaxis existem para alguns organismos modelo, incluindo drosophila. Worms únicos já foram avaliados por sua preferência de orientação à medida que se instalam em solução. No entanto, um ensaio confiável e robusto para caenorhabditis gravitaxis não foi descrito. O presente protocolo descreve um procedimento para a realização de ensaios gravitaxis que podem ser usados para testar centenas de dauers caenorhabditis de cada vez. Este ensaio de longa distância e em larga escala permite a coleta detalhada de dados, revelando fenótipos que podem ser perdidos em um ensaio padrão baseado em placas. O movimento de Dauer ao longo do eixo vertical é comparado com controles horizontais para garantir que o viés direcional seja devido à gravidade. A preferência gravitactic pode então ser comparada entre cepas ou condições experimentais. Este método pode determinar requisitos moleculares, celulares e ambientais para gravitaxis em vermes.

Comparando gravitaxis entre espécies Seguindo o procedimento descrito acima, C. briggsae dauer gravitaxis pode ser comparado com C. elegans gravitaxis e controles horizontais. A distribuição vertical (marrom) de dauers C. briggsae é inclinada em direção ao topo das câmaras, com uma grande porcentagem de vermes atingindo +7 (Figura 2A). Contrastada com controles horizontais (aqua), em que os dauers são distribuídos em uma curva em forma ...

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Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

O presente protocolo descreve métodos para a realização de um ensaio gravitaxis em larga escala com larvas dauer Caenorhabditis . Este protocolo permite uma melhor detecção do comportamento gravitaxis em comparação com um ensaio baseado em placas.

Ensaio gravitaxis em larga escala de Larvas de Caenorhabditis Dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Este ensaio de alto rendimento pode ser usado para observar um comportamento gracástico robusto em larvas de caenorhabditis dauer. O comportamento do verme é observado em grandes distâncias em comparação com ensaios realizados em uma placa de petri. Isso aumenta a sensibilidade do ensaio e permite uma análise detalhada dos dados.Estudar o comportamento da gravitaxis pode fornecer uma visão de como a sensação da gravidade ocorre na caenorhabdite, que tem relevância para a compreensão do sistema vestibular de mamíferos. Criar as câmaras de ensaio gravitaxis, isolar os promotores e injetar os vermes nas câmaras requer prática. Você pode economizar tempo isolando os dauers e criando as câmaras com um dia de antecedência.Comece montando um queimador Bunsen, uma a duas lâminas de barbear, alicate, pinças e uma superfície de corte de plástico, e um capô de fumaça. Para fazer uma câmara, reúna duas pipetas sorológicas de 5 mililitros, e com pinças, retire o plugue de algodão de uma pipeta. Segure uma lâmina de barbear usando alicate sobre o queimador Bunsen até ficar quente.Use a lâmina aquecida para cortar a extremidade afilada da segunda pipeta para que toda a pipeta tenha um diâmetro uniforme. Agora, leve rapidamente as duas extremidades modificadas de pipeta perto da chama e derreta-as ligeiramente. Junte essas extremidades pressionando-as firmemente, garantindo que as paredes de ambas as pipetas sejam contínuas.Se alguma lacuna for visível após a adesão, separe-as e repita esta etapa. Prepare o NGM com 4% de ágar de acordo com os procedimentos padrão de vermes e encha cada câmara anexando-o a uma pipetter sorológica enquanto o ágar ainda está derretido. Para minimizar quaisquer variações na consistência do ágar devido ao resfriamento irregular, segure a pipeta paralela à parte superior do banco enquanto elabora o ágar.Em seguida, desenhe lentamente a solução e sele a ponta com parafilme antes de remover a câmara da pipeta. Coloque a câmara plana para esfriar e deixe o ágar endurecer antes de se mover. Uma vez resfriado, aqueça uma chave de hex de três milímetros sobre um queimador de Bunsen e crie uma pequena abertura de plástico pressionando-a firmemente na parede de cada câmara cerca de cinco milímetros para um lado da linha média.Em seguida, use uma lâmina aquecida para remover o algodão e extremidades afiladas da câmara e selar as extremidades com filme de parafina. 10 a 15 dias antes do experimento, empeque cada tensão em duas a três grandes placas de NGM com bactérias OP50 e enrole o filme de parafina. Colete vermes enxaguando as tampas e placas com tampão M9 e pipetando a solução em tubos de centrífugas de 15 mililitros.Pelota os vermes girando a 1600 x G por 30 a 60 segundos em temperatura ambiente e aspire a maior parte do Tampão M9 com uma pipeta ou aspirador de vácuo. Adicione sete mililitros de 1% de sulfato de dodecyl de sódio a cada pelota de verme e deixe os vermes nele por 30 minutos. Para permitir a aeração, continue girando os tubos continuamente durante este tempo.Em seguida, remova o detergente enxaguando-o três a cinco vezes com M9. Depois de adicionar cinco mililitros M9, adicione cinco mililitros de solução de sacarose filtrada a frio de 60%. Misture bem e crie um gradiente de separação centrifugando a 1600 x G por cinco minutos à temperatura ambiente. Encha novos tubos de centrífugas de 15 mililitros com dois mililitros de Tampão M9.Agora esmague as pontas das pipetas pasteur de vidro para ampliar o furo. E use essas pipetas para transferir a camada superior da solução do gradiente de sacarose para os novos tubos. Enxágüe os dauers três a cinco vezes com M9 Buffer.Dauers centrífugas a 1600 x G por cinco minutos à temperatura ambiente e aspiram a maior parte da solução M9 com uma pipeta ou aspirador de vácuo. Em seguida, estime a densidade de vermes contando manualmente o número de vermes em três gotículas 1-microliter separadas sob um microscópio dissecando, e use a média dessas contagens para aproximar o número de vermes por microliter. Agora amplie o furo de ponta cortando o final de 10, 20 ou 200 dicas de pipeta de 200 microliter.Ajuste a micropipette em um volume ligeiramente maior do que o volume de aspiração pretendido. Aspire aproximadamente 1 a 2 microliters da solução concentrada de vermes e permita que uma pequena quantidade de ar entre na ponta. Empurre suavemente a ponta da pipeta para dentro do ágar enquanto deprimi a micro pipeta.Isso criará um site de injeção sem entupir a ponta. Solte os vermes no ágar e use o filme de parafina para selar a abertura. Para eliminar o maior número possível de variáveis, uma vez que as câmaras são colocadas dentro de uma gaiola escura de Faraday à temperatura ambiente, rotule cada câmara e pendure-a verticalmente dentro da gaiola de Faraday.Teste controles horizontais simultaneamente colocando algumas câmaras planas dentro das mesmas condições ambientais. Em seguida, use os worms N2 orientados verticalmente como um controle positivo e câmaras orientadas horizontalmente contendo dauers N2 como um controle negativo adicional contra as cepas experimentais. Depois de algumas horas, os vermes dauer começam a se dispersar do local de partida e levam várias horas para chegar a ambos os lados da câmara.Deixe as câmaras intactas durante este período e marque dentro de 12 a 24 horas após a injeção. Em seguida, remova as câmaras uma de cada vez e marque gravitaxis procurando dauers vivos sob um microscópio dissecando e marcando suas localizações com tinta. Não marque vermes dentro de 2,5 centímetros para ambos os lados do local de injeção, pois esses vermes não estão demonstrando uma preferência direcional.Além disso, evite marcar vermes que pareçam mortos ou estão presos no líquido e descarte quaisquer câmaras contendo mais de 50% de vermes mortos ou nadando. Para quantificar os resultados, use um marcador para dividir cada metade da câmara em sete centímetros e 3,5 centímetros, a partir de 2,5 centímetros do local da injeção. Use um contador de contagem manual para contabilizar o número de worms observados em cada seção.Na caenorhabditis briggsae, uma grande porcentagem de vermes dauer mostrou migração para o topo das câmaras. No entanto, os controles horizontais mostraram distribuição ao redor do centro das câmaras, indicando comportamento gravitativo negativo. Além disso, as distribuições verticais de caenorhabditis briggsae e caenorhabditis elegans não mostraram qualquer diferença sugerindo que caenorhabditis briggsae dauers mostram um comportamento gravitaxis negativo semelhante ao caenorhabditis elegans dauers.Agentes paralíticos como o azida de sódio não são usados neste protocolo. Portanto, é importante pontuar as câmaras gravitacionais assim que forem removidas da jaula de Faraday. Este ensaio levou à descoberta de um comportamento gravitaxis negativo em c.elegans.Através do teste de várias cepas mutantes, também revelou requisitos genéticos e neurais para gravitaxis em vermes.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Asymmetric Passagem: A Novel de Ensaio Comportamental de Estudos de Asymmetric Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Comportamento

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

Um ensaio simples e de baixo custo para medir a deambulação em modelos de Mouse de Distrofia Muscular

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Um ensaio de buraqueira/Tunneling para deteção de hipóxia em larvas de Drosophila melanogaster

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Paralisia induzida de natação para avaliar a sinalização de dopamina em Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Imagem de cálcio em caenorhabditis livremente comportada elegans com vibração bem controlada e não localizada

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Um ensaio e ferramentas aprimoradas para medir o nocicepção mecânico em larvas de Drosophila

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Um ensaio alimentador de microplaco de alta produtividade para quantificação do consumo em Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...