Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Это исследование было поддержано исследовательскими грантами от Национальных институтов здравоохранения для JHR (#R01 5R01HD081266 и #R01GM141493). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Мы хотели бы поблагодарить Прадипа Джоши (UCSB) за его редакционный вклад. Статистические консультации, предоставляемые UCSB DATALAB.

Штаммами, используемыми в настоящем исследовании, являются C. elegans (N2) и C. briggsae (AF16) (см. Таблицу материалов). Для каждого анализа использовалась разнополая популяция дауэров.
1. Подготовка камеры
<ol><li>Работайте в вытяжном шкафу. Настройте рабочее...

<ol>
	<li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+for+human+balance+control.">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li><li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates.">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).</li><li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors.">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li><li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis.">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li><li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway.">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391 (2014).</li><li>Fr&#233;zal, L., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+outside+the+Petri+dish.">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans,+is+regulated+by+IL2+neurons.">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li><li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae.">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li><li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans.">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>H&#228;der, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitaxis+in+Euglena.">Gravitaxis in Euglena.</a> Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston's+organ.">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li><li>Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis.">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+chemotaxis+assay.">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans.">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493 (2015).</li><li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals.">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae.">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).</li><li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+dauer+larvae.">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li><li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn's+test.">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li><li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+a+sensible+model+for+sensory+biology.">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li><li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li><li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound.">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li><li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans.">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).</li><li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans.">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).</li><li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels.">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li><li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron.">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).</li><li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear.">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li><li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+the+vestibular+system.">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li><li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+vestibular+syndromes.">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li><li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders.">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).</li><li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hearing+and+balance.">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567 (2019).</li></ol>

Сравнение с предыдущими методами В отличие от хемотаксиса, гравитаксис при кенорхабдите не может быть надежно обнаружен с использованием традиционной экспериментальной конструкции агаровой пластины. Стандартная чашка Петри имеет диаметр 150 мм, в результате чего тольк...

Ощущение гравитационного притяжения Земли имеет решающее значение для ориентации, движения, координации и равновесия многих организмов. Однако молекулярные механизмы и нейросхема гравитационного ощущения плохо изучены по сравнению с другими органами чувств. У животных гравитационное ощущение взаимодействует и может быть вытеснено другими стимулами для влияния на поведение. Визуальные сигналы, проприоцептивная обратная связь и вестибулярная информация могут быть интегрированы для создания чувства осознания тела относительно окружения животного 1,2. И наоборот, гравитактическое предпочтение может быть изменено при наличии других раздражителей 3,4,5. Таким образом, гравитактическое поведение идеально подходит для изучения гравитационного ощущения и понимания сложной сенсорной интеграции нервной системы и принятия решений.
C. elegans является особенно полезным модельным организмом для изучения гравитаксиса из-за его полифенического жизненного цикла. При воздействии стрессоров во время развития, включая тепло, перенаселенность или недостаток пищи, личинки C. elegans развиваются в дауэров, которые очень устойчивы к стрессу6. Как дауэры, черви выполняют характерное поведение, такое как придирка, при которой черви «стоят» на хвостах и машут головой, что может способствовать расселению в лучшие места обитания7. Анализы Гравитаксиса C. elegans и C. japonica позволяют предположить, что личинки дауэра отрицательно гравитакс, и что такое поведение легче наблюдается у дауэров, чем у взрослых 8,9. Тестирование гравитаксиса в других штаммах Caenorhabditis может выявить естественные изменения в гравитактическом поведении.
Механизмы гравитационного ощущения были охарактеризованы у Euglena, Drosophila, Ciona и различных других видов с использованием анализов гравитаксиса 3,10,11. Между тем, исследования гравитаксиса при caenorhabditis первоначально дали смешанные результаты. Исследование ориентационного предпочтения C. elegans показало, что черви ориентируются с опущенной головой в растворе, предполагая положительное гравитактическое предпочтение12. Между тем, хотя C. japonica dauers были идентифицированы на ранней стадии как отрицательно гравитактические8, это поведение только недавно было описано в C. elegans9. Несколько проблем возникает при разработке репрезентативного анализа гравитаксиса у червей. Штаммы Caenorhabditis сохраняются на агаровых пластинах; по этой причине поведенческие анализы обычно используют агаровые пластины как часть их экспериментального дизайна 13,14,15. Самый ранний зарегистрированный анализ гравитаксиса в Caenorhabditis был выполнен путем стояния пластины на боку под углом 90° к горизонтальной управляющей пластине8. Однако поведение гравитаксиса не всегда устойчиво в этих условиях. В то время как взрослые черви могут быть проанализированы на предмет ориентационного предпочтения в решении12, это направленное предпочтение также может зависеть от контекста, что приводит к различному поведению, если черви ползают, а не плавают. Кроме того, C. elegans чувствителен к другим раздражителям, включая свет и электромагнитные поля16,17, которые мешают их реакциям на гравитацию9. Поэтому обновленный анализ гравитаксиса, который защищает от других переменных окружающей среды, важен для анализа механизмов этого сенсорного процесса.
В настоящем протоколе описан анализ для наблюдения Caenorhabditis gravitaxis. Установка для этого исследования частично основана на методе, разработанном для изучения нервно-мышечной целостности18,19. Личинки Dauer культивируют и изолируют с помощью стандартных процедур20. Затем они вводятся в камеры, изготовленные из двух серологических пипеток по 5 мл, наполненных агаром. Эти камеры могут быть ориентированы вертикально или горизонтально и помещены в темную клетку Фарадея на 12-24 часа для защиты от света и электромагнитных полей. Местоположение каждого червя в камерах регистрируется и сравнивается с вертикальными такси эталонного штамма, такого как C. elegans N2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

Ощущение гравитации является важным и относительно недостаточно изученным процессом. Ощущение гравитации позволяет животным ориентироваться в окружающей среде и облегчает движение. Кроме того, гравитационное ощущение, которое возникает во внутреннем ухе млекопитающих, тесно связано со слухом - таким образом, понимание этого процесса имеет значение для слуховых и вестибулярных исследований. Гравитаксисовые анализы существуют для некоторых модельных организмов, включая дрозофилу. Одиночные черви ранее были проанализированы на предмет их предпочтения ориентации, когда они оседают в растворе. Тем не менее, надежный и надежный анализ для Caenorhabditis gravitaxis не был описан. Настоящий протокол описывает процедуру выполнения гравитаксис-анализов, которые могут быть использованы для тестирования сотен caenorhabditis dauers одновременно. Этот крупномасштабный, дальний анализ позволяет собирать подробные данные, выявляя фенотипы, которые могут быть пропущены в стандартном анализе на основе пластин. Движение Dauer вдоль вертикальной оси сравнивается с горизонтальными элементами управления, чтобы гарантировать, что направленное смещение обусловлено гравитацией. Затем гравитактическое предпочтение можно сравнить между штаммами или экспериментальными условиями. Этот метод может определить молекулярные, клеточные и экологические требования к гравитакси у червей.

Сравнение гравитаксиса между видами Следуя процедуре, описанной выше, C. briggsae dauer gravitaxis можно сравнить с C. elegans gravitaxis и горизонтальными регуляторами. Вертикальное распределение (бордовый) C. briggsae dauers наклонено к вершинам камер, при этом большой процент червей дос?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

В настоящем протоколе изложены методы проведения крупномасштабного гравитаксисового анализа с личинками Caenorhabditis dauer. Этот протокол позволяет лучше обнаруживать поведение гравитаксиса по сравнению с анализом на основе пластин.

Крупномасштабный гравитационный анализ личинок Caenorhabditis Dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Этот высокопроизводительный анализ может быть использован для наблюдения за устойчивым гравитактическим поведением у личинок caenorhabditis dauer. Поведение червей наблюдается на больших расстояниях по сравнению с анализами, выполняемыми на чашке Петри. Это повышает чувствительность анализа и позволяет проводить детальный анализ данных.Изучение поведения гравитаксиса может дать представление о том, как гравитационное ощущение происходит при канорхабдите, что имеет отношение к пониманию вестибулярной системы млекопитающих. Создание камер гравитаксиса, изоляция дауэров и введение червей в камеры требует практики. Вы можете сэкономить время, изолировав дауэры и создав камеры за день вперед.Начните с установки горелки Бунзена, от одного до двух лезвий бритвы, плоскогубцев, пинцетов, пластиковой режущей поверхности и вытяжного капюшона. Чтобы сделать камеру, соберите две 5-миллилитровые серологические пипетки, а пинцетом снимите хлопчатобумажную пробку с одной пипетки. Держите лезвие бритвы плоскогубцами над горелкой Бунзена до горячего состояния.Используйте нагретое лезвие, чтобы отрезать конический конец второй пипетки так, чтобы вся пипетка имела равномерный диаметр. Теперь быстро поднесите два модифицированных конца пипетки близко к пламени и слегка расплавите их. Соедините эти концы, крепко прижав их друг к другу, гарантируя, что стенки обеих пипеток непрерывны.Если после соединения видны какие-либо пробелы, разбейте их на части и повторите этот шаг. Приготовьте NGM с 4%-агаром в соответствии со стандартными процедурами для червей и заполните каждую камеру, прикрепив ее к серологическому пипетке, пока агар еще расплавлен. Чтобы свести к минимуму любые изменения консистенции агара из-за неравномерного охлаждения, держите пипетку параллельно столешнице при вытягивании агара.Затем медленно вытяните раствор и запечатайте наконечник парапленкой перед извлечением камеры из трубоукладчика. Положите камеру плоско, чтобы остыть, и дайте агару затвердеть перед перемещением. После охлаждения нагрейте трехмиллиметровый шестигранный ключ над горелкой Бунзена и создайте небольшое пластиковое отверстие, плотно вдавливая его в стенку каждой камеры примерно на пять миллиметров к одной стороне средней линии.Затем используйте нагретое лезвие, чтобы удалить хлопчатобумажные и конические концы камеры и запечатать концы парафиновой пленкой. За 10-15 дней до эксперимента разложите каждый штамм на две-три большие пластины NGM с бактериями OP50 и оберните парафиновую пленку. Собирайте червей, промыв крышки и пластины с помощью буфера M9 и пипетки раствора в 15-миллилитровые центрифужные трубки.Гранулируйте червей, вращаясь при 1600 x G в течение 30-60 секунд при комнатной температуре, и аспирируйте большую часть буфера M9 пипеткой или вакуумным аспиратором. Добавьте семь миллилитров 1% раствора додецилсульфата натрия в каждую гранулу червя и оставьте червей в ней на 30 минут. Чтобы обеспечить аэрацию, продолжайте непрерывно вращать трубки в течение этого времени.Затем удалите моющее средство, промыв его три-пять раз С M9. После добавления пяти миллилитров М9 добавляют пять миллилитров холодного фильтрованного 60%-ного раствора сахарозы. Тщательно перемешайте и создайте градиент разделения путем центрифугирования при 1600 x G в течение пяти минут при комнатной температуре. Заполните новые 15-миллилитровые центрифужные трубки двумя миллилитрами M9 Buffer.Теперь раздавите концы стеклянных пипеток Пастера, чтобы расширить отверстие. И используйте эти пипетки для переноса верхнего слоя раствора с градиента сахарозы на новые трубки. Промойте дауэры три-пять раз с помощью буфера M9.Центрифуги выдерживают при 1600 x G в течение пяти минут при комнатной температуре и аспирируют большую часть раствора M9 пипеткой или вакуумным аспиратором. Затем оцените плотность червя, вручную подсчитывая количество червей в трех отдельных каплях по 1 микролитр под рассекающим микроскопом, и используйте среднее значение этих подсчетов для аппроксимации количества червей на микролитр. Теперь расширьте отверстие наконечника, разрезав конец наконечников пипетки объемом 10, 20 или 200 микролитров.Установите микропипетку на немного больший объем, чем предполагаемый объем аспирации. Аспирировать приблизительно 1-2 микролитра концентрированного раствора червя и дать небольшому количеству воздуха проникнуть в наконечник. Осторожно вдавите наконечник пипетки в агар, одновременно нажимая на микропипетку.Это позволит создать место инъекции, не засоряя наконечник. Отпустите червей в агар и используйте парафиновую пленку, чтобы запечатать отверстие. Чтобы устранить как можно больше переменных после того, как камеры помещены в темную клетку Фарадея при комнатной температуре, маркируйте каждую камеру и повесьте ее вертикально в клетку Фарадея.Одновременное тестирование горизонтальных органов управления путем укладки некоторых камер в одинаковых условиях окружающей среды. Затем используйте вертикально ориентированные черви N2 в качестве положительного контроля и горизонтально ориентированные камеры, содержащие N2 dauers, в качестве дополнительного отрицательного контроля против экспериментальных штаммов. Через несколько часов черви dauer начинают рассеиваться от места старта и им требуется несколько часов, чтобы достичь любого конца камеры.Оставьте камеры нетронутыми в течение этого времени и наберите в течение 12-24 часов после инъекции. Затем удаляйте камеры по одной и оценивайте гравитаксию, ища живых дауэров под рассекающим микроскопом и отмечая их местоположение чернилами. Не забивайте червей в пределах 2,5 сантиметров по обе стороны от места инъекции, так как эти черви вряд ли продемонстрируют направленное предпочтение.Кроме того, избегайте забивания червей, которые кажутся мертвыми или попадают в ловушку в жидкости, и выбрасывайте любые камеры, содержащие более 50% мертвых или плавающих червей. Чтобы количественно оценить результаты, используйте маркер, чтобы разделить каждую половину камеры на семь 3,5 сантиметра, начиная с 2,5 сантиметров от места инъекции. Используйте ручной счетчик подсчета, чтобы подсчитать количество червей, наблюдаемых в каждом разделе.При caenorhabditis briggsae большой процент червей dauer показал миграцию к верхней части камер. Тем не менее, горизонтальные элементы управления показали распределение вокруг центра камер, что указывает на отрицательное гравитактическое поведение. Кроме того, вертикальные распределения caenorhabditis briggsae и caenorhabditis elegans не показали никаких различий, предполагая, что caenorhabditis briggsae dauers демонстрируют отрицательное поведение гравитаксиса, похожее на caenorhabditis elegans dauers.Паралитические агенты, такие как азид натрия, не используются в этом протоколе. Поэтому важно забить камеры гравитаксиса, как только они будут удалены из клетки Фарадея. Этот анализ привел к обнаружению негативного поведения гравитаксиса у c.elegans.Путем тестирования нескольких мутантных штаммов он также выявил генетические и нейронные требования к гравитакси у червей.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Асимметричная дорожка: Роман Поведенческая Анализ по изучению Asymmetric Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Автоматизированный анализ хемосенсорного предпочтения на основе нематод

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Профилирование IgG против Neu5Gc в человеческой сыворотке с помощью анализа сиалогликанового микрочипа

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

Простой и недорогой Assay для измерения передвигаться в моделях мыши мышечной дистрофии

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Assay Берроуинг/туннелирования для выявления гипоксии в Drosophila melanogaster личинки

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Плавательный паралич индуцированных для оценки допамина сигнализации в Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Визуализация кальция у свободно ведущих себя caenorhabditis elegans с хорошо контролируемой, нелокализованной вибрацией

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Улучшенный анализ и инструменты для измерения механического ноцицепции в Drosophila Larvae

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Сравнительный анализ экспериментальных методов количественной оценки активности животных в моделях митохондриальной болезни Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Высокопроизводительный анализ микропластинчатого питателя для количественной оценки потребления дрозофилы

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...