Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud a JHR (#R01 5R01HD081266 y #R01GM141493). Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Nos gustaría agradecer a Pradeep Joshi (UCSB) por su aporte editorial. Consulta estadística proporcionada por el DATALAB de UCSB.

Las cepas utilizadas en el presente estudio son C. elegans (N2) y C. briggsae (AF16) (ver Tabla de Materiales). Se utilizó una población mixta de dauers para cada ensayo.
1. Preparación de la cámara
<ol><li>Trabajar en una campana extractora. Configure el espacio de trabajo con un mechero Bunsen, 1-2 cuchillas de afeitar, alicates, pinzas y una superficie de corte de plástico (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<l...

<ol>
	<li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+for+human+balance+control.">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li><li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates.">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).</li><li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors.">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li><li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis.">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li><li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway.">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391 (2014).</li><li>Fr&#233;zal, L., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+outside+the+Petri+dish.">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans,+is+regulated+by+IL2+neurons.">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li><li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae.">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li><li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans.">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>H&#228;der, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitaxis+in+Euglena.">Gravitaxis in Euglena.</a> Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston's+organ.">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li><li>Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis.">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+chemotaxis+assay.">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans.">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493 (2015).</li><li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals.">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Ow, M. C., Hall, S. 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(47), e2293 (2011).</li><li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+dauer+larvae.">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li><li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn's+test.">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li><li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+a+sensible+model+for+sensory+biology.">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li><li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li><li>Iliff, A. 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D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron.">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).</li><li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear.">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li><li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+the+vestibular+system.">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li><li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+vestibular+syndromes.">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li><li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders.">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).</li><li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hearing+and+balance.">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567 (2019).</li></ol>

Comparación con métodos anteriores A diferencia de la quimiotaxis, el eje gravitacional en Caenorhabditis no se puede observar de manera confiable utilizando un diseño experimental tradicional de placa de agar. Una placa de Petri estándar tiene 150 mm de diámetro, lo que resulta en solo 75 mm disponibles en cualquier dirección para que los dauers demuestren la preferencia del eje gravitatorio. Aunque la preferencia orientativa de C. elegans se puede ensayar en la solución<sup ...

Detectar la atracción gravitacional de la Tierra es crucial para la orientación, el movimiento, la coordinación y el equilibrio de muchos organismos. Sin embargo, los mecanismos moleculares y los neurocircuitos de la sensación de gravedad son poco conocidos en comparación con otros sentidos. En los animales, la sensación de gravedad interactúa y puede ser superada por otros estímulos para influir en el comportamiento. Las señales visuales, la retroalimentación propioceptiva y la información vestibular pueden integrarse para generar un sentido de conciencia corporal en relación con el entorno de un animal 1,2. Por el contrario, la preferencia gravíctica puede ser alterada en presencia de otros estímulos 3,4,5. Por lo tanto, el comportamiento gravitáctico es ideal para estudiar la sensación de gravedad y comprender la compleja integración sensorial del sistema nervioso y la toma de decisiones.
C. elegans es un organismo modelo especialmente útil para estudiar el eje gravitacional debido a su ciclo de vida polifénico. Cuando se exponen a factores estresantes durante el desarrollo, incluyendo calor, hacinamiento o falta de alimentos, las larvas de C. elegans se convierten en dauers, que son altamente resistentes al estrés6. Como dauers, los gusanos realizan comportamientos característicos, como la nictación, en la que los gusanos "se paran" sobre sus colas y agitan sus cabezas, lo que puede facilitar la dispersión a mejores hábitats7. Los ensayos de gravitaxis de C. elegans y C. japonica sugieren que las larvas de dauer gravitan negativamente, y que este comportamiento se observa más fácilmente en dauers que en adultos 8,9. Las pruebas del eje gravitacional en otras cepas de Caenorhabditis pueden revelar una variación natural en el comportamiento gravitáctico.
Los mecanismos para la sensación de gravedad se han caracterizado en Euglena, Drosophila, Ciona y varias otras especies utilizando ensayos de eje gravitacional 3,10,11. Mientras tanto, los estudios del eje gravitacional en Caenorhabditis inicialmente proporcionaron resultados mixtos. Un estudio de la preferencia orientacional de C. elegans encontró que los gusanos se orientan con la cabeza hacia abajo en solución, sugiriendo una preferencia gravitáctica positiva12. Mientras tanto, aunque los dauers de C. japonica fueron identificados desde el principio como gravitácticos negativos8, este comportamiento solo recientemente se ha descrito en C. elegans9. Varios desafíos surgen en el desarrollo de un ensayo de gravitaxis representativo en gusanos. Las cepas de Caenorhabditis se mantienen en placas de agar; Por esta razón, los ensayos de comportamiento suelen utilizar placas de agar como parte de su diseño experimental13,14,15. El primer ensayo de eje gravitacional reportado en Caenorhabditis se realizó colocando una placa de lado en un ángulo de 90 ° con respecto a la placa de control horizontal8. Sin embargo, el comportamiento del eje gravitacional no siempre es robusto en estas condiciones. Mientras que los gusanos adultos pueden ser ensayados para la preferencia orientativa en la solución12, esta preferencia direccional también puede depender del contexto, lo que lleva a diferentes comportamientos si los gusanos se arrastran en lugar de nadar. Además, C. elegans es sensible a otros estímulos, incluyendo la luz y los campos electromagnéticos16,17, que interfieren con sus respuestas a la gravedad9. Por lo tanto, un ensayo de eje gravitacional actualizado que protege contra otras variables ambientales es importante para diseccionar los mecanismos de este proceso sensorial.
En el presente protocolo, se describe un ensayo para observar el eje gravitacional de Caenorhabditis. La configuración para este estudio se basa en parte en un método desarrollado para estudiar la integridad neuromuscular18,19. Las larvas de Dauer se cultivan y aíslan utilizando procedimientos estándar20. Luego se inyectan en cámaras hechas de dos pipetas serológicas de 5 ml llenas de agar. Estas cámaras pueden orientarse vertical u horizontalmente y colocarse dentro de una jaula de Faraday oscura durante 12-24 h para protegerse contra la luz y los campos electromagnéticos. La ubicación de cada gusano en las cámaras se registra y se compara con los taxis verticales de una cepa de referencia como C. elegans N2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

La sensación de gravedad es un proceso importante y relativamente poco estudiado. La detección de la gravedad permite a los animales navegar por su entorno y facilita el movimiento. Además, la sensación de gravedad, que ocurre en el oído interno de los mamíferos, está estrechamente relacionada con la audición, por lo tanto, comprender este proceso tiene implicaciones para la investigación auditiva y vestibular. Existen ensayos de gravitaxis para algunos organismos modelo, incluyendo Drosophila. Los gusanos individuales han sido previamente ensayados para determinar su preferencia de orientación a medida que se asientan en solución. Sin embargo, no se ha descrito un ensayo fiable y robusto para el eje gravititario de Caenorhabditis . El presente protocolo describe un procedimiento para realizar ensayos de eje gravitacional que se puede utilizar para probar cientos de dauers de Caenorhabditis a la vez. Este ensayo a gran escala y a larga distancia permite la recopilación detallada de datos, revelando fenotipos que pueden pasarse por alto en un ensayo estándar basado en placas. El movimiento de Dauer a lo largo del eje vertical se compara con los controles horizontales para garantizar que el sesgo direccional se deba a la gravedad. La preferencia gravitáctica se puede comparar entre cepas o condiciones experimentales. Este método puede determinar los requisitos moleculares, celulares y ambientales para el eje gravitacional en gusanos.

Comparando el graviteje entre especies Siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, el eje gravitacional de C. briggsae dauer se puede comparar con el eje gravitacional y los controles horizontales de C. elegans. La distribución vertical (granate) de C. briggsae dauers está sesgada hacia la parte superior de las cámaras, con un gran porcentaje de gusanos que alcanzan +7 (Figura 2A). En contraste con los controles horizontales (aqua), en...

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Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

El presente protocolo describe métodos para realizar un ensayo gravitacional a gran escala con larvas de Caenorhabditis dauer. Este protocolo permite una mejor detección del comportamiento del eje gravitacional en comparación con un ensayo basado en placas.

Ensayo de gravitaxis a gran escala de larvas de Caenorhabditis dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Este ensayo de alto rendimiento se puede utilizar para observar un comportamiento gravitáctico robusto en larvas de caenorhabditis dauer. El comportamiento del gusano se observa a grandes distancias en comparación con los ensayos realizados en una placa de Petri. Esto mejora la sensibilidad del ensayo y permite un análisis detallado de los datos.El estudio del comportamiento del eje gravitacional puede proporcionar información sobre cómo se produce la sensación de gravedad en la caenorhabditis, que tiene relevancia para comprender el sistema vestibular de los mamíferos. Crear las cámaras de ensayo del eje gravitativo, aislar a los dauers e inyectar los gusanos en las cámaras requiere práctica. Puede ahorrar tiempo aislando los dauers y creando las cámaras con un día de anticipación.Comience instalando un mechero Bunsen, una o dos cuchillas de afeitar, alicates, pinzas y una superficie de corte de plástico, y una campana extractora. Para hacer una cámara, reúna dos pipetas serológicas de 5 mililitros y, con pinzas, retire el tapón de algodón de una pipeta. Sostenga una hoja de afeitar con unos alicates sobre el mechero Bunsen hasta que esté caliente.Utilice la cuchilla calentada para cortar el extremo cónico de la segunda pipeta de modo que toda la pipeta tenga un diámetro uniforme. Ahora, acerque rápidamente los dos extremos de pipeta modificados a la llama y derrítalos ligeramente. Une estos extremos presionándolos firmemente, asegurándote de que las paredes de ambas pipetas sean continuas.Si hay huecos visibles después de unirse, sepárelos y repita este paso. Prepare NGM con agar al 4% de acuerdo con los procedimientos estándar de gusanos y llene cada cámara uniéndolo a un pipeteo serológico mientras el agar aún está fundido. Para minimizar cualquier variación en la consistencia del agar debido a un enfriamiento desigual, sostenga el pipeteo paralelo a la parte superior del banco mientras dibuja el agar.Luego, extraiga lentamente la solución y selle la punta con parafilm antes de retirar la cámara del pipeteo. Coloque la cámara plana para que se enfríe y permita que el agar se endurezca antes de moverse. Una vez enfriado, caliente una llave hexagonal de tres milímetros sobre un mechero Bunsen y cree una pequeña abertura de plástico presionándola firmemente contra la pared de cada cámara a unos cinco milímetros a un lado de la línea media.A continuación, use una cuchilla calentada para quitar el algodón y los extremos cónicos de la cámara y selle los extremos con una película de parafina. De 10 a 15 días antes del experimento, divida cada cepa en dos o tres placas NGM grandes con bacterias OP50 y envuelva la película de parafina. Recoja los gusanos enjuagando las tapas y placas con M9 Buffer y pipeteando la solución en tubos de centrífuga de 15 mililitros.Granular los gusanos girando a 1600 x G durante 30 a 60 segundos a temperatura ambiente y aspirar la mayor parte del tampón M9 con una pipeta o aspirador de vacío. Agregue siete mililitros de solución de dodecil sulfato de sodio al 1% a cada gránulo de gusano y deje los gusanos en él durante 30 minutos. Para permitir la aireación, siga girando los tubos continuamente durante este tiempo.Luego, retire el detergente enjuagándolo de tres a cinco veces con M9. Después de agregar cinco mililitros M9, agregue cinco mililitros de solución de sacarosa al 60% filtrada en frío. Mezclar bien y crear un gradiente de separación centrifugando a 1600 x G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Llene los nuevos tubos de centrífuga de 15 mililitros con dos mililitros de M9 Buffer.Ahora aplaste los extremos de las pipetas de vidrio Pasteur para ensanchar el orificio. Y use estas pipetas para transferir la capa superior de la solución del gradiente de sacarosa a los nuevos tubos. Enjuague los dauers de tres a cinco veces con M9 Buffer.Centrífuga a 1600 x G durante cinco minutos a temperatura ambiente y aspirar la mayor parte de la solución M9 con una pipeta o aspirador de vacío. A continuación, calcule la densidad de gusanos contando manualmente el número de gusanos en tres gotas separadas de 1 microlitro bajo un microscopio de disección, y use el promedio de estos recuentos para aproximar el número de gusanos por microlitro. Ahora amplíe el orificio de la punta cortando el extremo de las puntas de pipeta de 10, 20 o 200 microlitros.Ajuste la micropipeta a un volumen ligeramente mayor que el volumen de aspiración previsto. Aspire aproximadamente de 1 a 2 microlitros de la solución de gusano concentrada y permita que entre una pequeña cantidad de aire en la punta. Empuje suavemente la punta de la pipeta en el agar mientras presiona la micropipeta.Esto creará un sitio de inyección sin obstruir la punta. Suelte los gusanos en el agar y use una película de parafina para sellar la abertura. Para eliminar tantas variables como sea posible una vez que las cámaras se colocan dentro de una jaula oscura de Faraday a temperatura ambiente, etiquete cada cámara y cuélguela verticalmente dentro de la jaula de Faraday.Pruebe los controles horizontales simultáneamente colocando algunas cámaras planas dentro de las mismas condiciones ambientales. Luego use los gusanos N2 orientados verticalmente como control positivo y las cámaras orientadas horizontalmente que contienen dauers N2 como un control negativo adicional contra las cepas experimentales. Después de unas horas, los gusanos dauer comienzan a dispersarse desde el sitio de inicio y tardan varias horas en llegar a cada extremo de la cámara.Deje las cámaras sin ser molestadas durante este tiempo y marque dentro de las 12 a 24 horas posteriores a la inyección. A continuación, retire las cámaras una a la vez y marque el eje gravitacional buscando dauers vivos bajo un microscopio de disección y marcando sus ubicaciones con tinta. No marque los gusanos dentro de los 2,5 centímetros a cada lado del sitio de inyección, ya que es probable que estos gusanos no demuestren una preferencia direccional.Además, evite marcar gusanos que parezcan muertos o estén atrapados en el líquido y deseche cualquier cámara que contenga más del 50% de gusanos muertos o nadadores. Para cuantificar los resultados, use un marcador para dividir cada mitad de la cámara en siete de 3,5 centímetros, comenzando a 2,5 centímetros del lugar de inyección. Utilice un contador de conteo manual para contar el número de gusanos observados en cada sección.En caenorhabditis briggsae, un gran porcentaje de gusanos dauer mostraron migración hacia la parte superior de las cámaras. Sin embargo, los controles horizontales mostraron distribución alrededor del centro de las cámaras, lo que indica un comportamiento gravitáctico negativo. Además, las distribuciones verticales de caenorhabditis briggsae y caenorhabditis elegans no mostraron ninguna diferencia, lo que sugiere que los dauers de caenorhabditis briggsae muestran un comportamiento gravitaxis negativo similar al de caenorhabditis elegans dauers.Los agentes paralíticos como la azida de sodio no se utilizan en este protocolo. Por lo tanto, es importante marcar las cámaras del eje gravitacional tan pronto como se retiren de la jaula de Faraday. Este ensayo condujo al descubrimiento del comportamiento negativo del eje gravitacional en c.elegans.A través de pruebas de varias cepas mutantes, también reveló requisitos genéticos y neuronales para el eje gravitacional en gusanos.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Asimétrica Pasarela: Un Ensayo Novela conductual para Estudiar asimétrica Locomoción

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Investigación

Comportamiento

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Análisis Automatizado de un Ensayo de Preferencia Chemosensorial Basada en Población de Nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Perfilación de IgG anti-Neu5Gc en sueros humanos con un ensayo de microarray de sialoglucano

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

Un análisis Simple y de bajo costo para la medición de actividad en modelos de ratón de la Distrofia Muscular

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Un ensayo de tecolote/túnel para la detección de la hipoxia en larvas de Drosophila melanogaster

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Natación parálisis inducida a evaluar dopamina señalización en Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre con vibración no localizada y bien controlada

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Un ensayo mejorado y herramientas para medir la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Un ensayo de alimentador de microplacas de alto rendimiento para la cuantificación del consumo en Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...