Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Denna forskning stöddes av forskningsbidrag från National Institutes of Health till JHR (#R01 5R01HD081266 och #R01GM141493). Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi vill tacka Pradeep Joshi (UCSB) för hans redaktionella input. Statistiskt samråd från UCSB DATALAB.

De stammar som används i denna studie är C. elegans (N2) och C. briggsae (AF16) (se materialförteckning). En blandad könspopulation av dauers användes för varje analys.
1. Förberedelse av kammaren
<ol><li>Arbeta i en dragskåp. Ställ in arbetsytan med en Bunsen-brännare, 1-2 rakblad, tång, pincett och en plastskäryta (se Materialförteckning).</li>
	<li>För varje kammare, samla två 5 ml serologiska pipetter. Ta...

<ol>
	<li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+for+human+balance+control.">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li><li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates.">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).</li><li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors.">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li><li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis.">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li><li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway.">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391 (2014).</li><li>Fr&#233;zal, L., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+outside+the+Petri+dish.">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans,+is+regulated+by+IL2+neurons.">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li><li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae.">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li><li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans.">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>H&#228;der, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitaxis+in+Euglena.">Gravitaxis in Euglena.</a> Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston's+organ.">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li><li>Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis.">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+chemotaxis+assay.">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans.">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493 (2015).</li><li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals.">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae.">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).</li><li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+dauer+larvae.">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li><li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn's+test.">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li><li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+a+sensible+model+for+sensory+biology.">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li><li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li><li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound.">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li><li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans.">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).</li><li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans.">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).</li><li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels.">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li><li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron.">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).</li><li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear.">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li><li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+the+vestibular+system.">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li><li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+vestibular+syndromes.">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li><li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders.">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).</li><li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hearing+and+balance.">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567 (2019).</li></ol>

Jämförelse med tidigare metoder Till skillnad från kemotaxis kan gravitaxis i Caenorhabditis inte observeras på ett tillförlitligt sätt med hjälp av en traditionell experimentell design av agarplattor. En vanlig petriskål är 150 mm i diameter, vilket resulterar i endast 75 mm tillgängliga i båda riktningarna för dauers för att visa gravitaxispreferens. Även om C. elegans orienteringspreferens kan analyseras i lösning12, är denna metod låg geno...

Att känna av jordens gravitationskraft är avgörande för många organismers orientering, rörelse, koordination och balans. De molekylära mekanismerna och neurokretsarna för gravitationssensation är emellertid dåligt förstådda jämfört med andra sinnen. Hos djur interagerar gravitationskänslan med och kan konkurreras ut av andra stimuli för att påverka beteendet. Visuella ledtrådar, proprioceptiv feedback och vestibulär information kan integreras för att skapa en känsla av kroppsmedvetenhet i förhållande till ett djurs omgivning 1,2. Omvänt kan gravitaktisk preferens ändras i närvaro av andra stimuli 3,4,5. Därför är gravitaktiskt beteende idealiskt för att studera gravitationskänsla och förstå nervsystemets komplexa sensoriska integration och beslutsfattande.
C. elegans är en särskilt användbar modellorganism för att studera gravitaxis på grund av dess polyfeniska livscykel. När de utsätts för stressfaktorer under utveckling, inklusive värme, överbeläggning eller brist på mat, utvecklas C. elegans larver till dauers, som är mycket stressresistenta6. Som dauers utför maskar karakteristiska beteenden, såsom nictation, där maskar "står" på sina svansar och viftar med huvudet, vilket kan underlätta spridning till bättre livsmiljöer7. Gravitaxisanalyser av C. elegans och C. japonica tyder på att dauerlarver negativt gravitax, och att detta beteende lättare observeras hos dauers än hos vuxna 8,9. Testning av gravitaxis i andra Caenorhabditis-stammar kan avslöja naturlig variation i gravitaktiskt beteende.
Mekanismer för gravitationskänsla har karakteriserats i Euglena, Drosophila, Ciona och olika andra arter med hjälp av gravitaxanalys 3,10,11. Samtidigt gav gravitaxisstudier i Caenorhabditis initialt blandade resultat. En studie av C. elegans orienteringspreferens fann att maskar orienterar med huvudet nedåt i lösning, vilket tyder på positiv gravitaktisk preferens12. Under tiden, även om C. japonica dauers tidigt identifierades som negativt gravitaktiska8, har detta beteende först nyligen beskrivits i C. elegans9. Flera utmaningar uppstår vid utvecklingen av en representativ gravitaxisanalys i maskar. Caenorhabditis stammar upprätthålls på agarplattor; Av denna anledning använder beteendeanalyser vanligtvis agarplattor som en del av deras experimentella design13,14,15. Den tidigaste rapporterade gravitaxisanalysen i Caenorhabditis utfördes genom att en platta stod på sidan i 90 ° vinkel mot den horisontella styrplattan8. Gravitaxis beteende är dock inte alltid robust under dessa förhållanden. Medan vuxna maskar kan analyseras för orienteringspreferens i lösning12, kan denna riktningspreferens också vara kontextberoende, vilket leder till olika beteenden om maskarna kryper snarare än simmar. Dessutom är C. elegans känslig för andra stimuli, inklusive ljus och elektromagnetiska fält16,17, som stör deras svar på tyngdkraften9. Därför är en uppdaterad gravitaxanalys som skyddar mot andra miljövariabler viktig för att dissekera mekanismerna i denna sensoriska process.
I detta protokoll beskrivs en analys för att observera Caenorhabditis gravitaxis. Upplägget för denna studie bygger delvis på en metod som utvecklats för att studera neuromuskulär integritet18,19. Dauerlarver odlas och isoleras med hjälp av standardprocedurer20. De injiceras sedan i kamrar gjorda av två 5 ml serologiska pipetter fyllda med agar. Dessa kamrar kan orienteras vertikalt eller horisontellt och placeras i en mörk Faraday-bur i 12-24 timmar för att skydda mot ljus och elektromagnetiska fält. Placeringen av varje mask i kamrarna registreras och jämförs med de vertikala taxibilarna för en referensstam som C. elegans N2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

Gravitationssensation är en viktig och relativt understuderad process. Att känna av gravitationen gör det möjligt för djur att navigera i sin omgivning och underlättar rörelse. Dessutom är tyngdkraftskänslan, som uppträder i däggdjurets inre öra, nära besläktad med hörseln - så att förstå denna process har konsekvenser för hörsel och vestibulär forskning. Gravitaxisanalyser finns för vissa modellorganismer, inklusive Drosophila. Enstaka maskar har tidigare analyserats för sin orienteringspreferens när de bosätter sig i lösning. En tillförlitlig och robust analys för Caenorhabditis gravitaxis har dock inte beskrivits. Det nuvarande protokollet beskriver ett förfarande för att utföra gravitaxisanalyser som kan användas för att testa hundratals Caenorhabditis dauers åt gången. Denna storskaliga, långdistansanalys möjliggör detaljerad datainsamling och avslöjar fenotyper som kan missas på en standardplattbaserad analys. Dauer-rörelse längs den vertikala axeln jämförs med horisontella kontroller för att säkerställa att riktningsförspänning beror på tyngdkraften. Gravitaktisk preferens kan sedan jämföras mellan stammar eller experimentella förhållanden. Denna metod kan bestämma molekylära, cellulära och miljömässiga krav för gravitaxis i maskar.

Jämförelse av gravitaxis mellan arter Efter det ovan beskrivna förfarandet kan C. briggsae dauer gravitaxis jämföras med C. elegans gravitaxis och horisontella kontroller. Den vertikala fördelningen (rödbrun) av C. briggsae dauers är snedställd mot kamrarnas toppar, med en stor andel maskar som når +7 (figur 2A). Kontrasterad med horisontella kontroller (aqua), där dauers fördelas i en ungefär klockformad kurva runt mitten av kamrar...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Detta protokoll beskriver metoder för att genomföra en storskalig gravitaxisanalys med Caenorhabditis dauer larver. Detta protokoll möjliggör bättre detektion av gravitaxis beteende jämfört med en plattbaserad analys.

Storskalig gravitaxanalys av Caenorhabditis Dauer larver

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Denna analys med hög genomströmning kan användas för att observera robust gravitaktiskt beteende hos caenorhabditis dauer larver. Maskbeteende observeras över stora avstånd jämfört med analyser som utförs på en petriskål. Detta ökar analysens känslighet och möjliggör detaljerad dataanalys.Att studera gravitaxis beteende kan ge insikt i hur gravitationssensation uppstår vid caenorhabditis, vilket har relevans för att förstå däggdjurets vestibulära system. Att skapa gravitaxis-analyskamrarna, isolera dauers och injicera maskarna i kamrarna kräver övning. Du kan spara tid genom att isolera dauers och skapa kamrarna en dag i förväg.Börja med att sätta upp en Bunsenbrännare, ett till två rakblad, tång, pincett och en skäryta i plast samt en dragskåp. För att skapa en kammare, samla två 5 ml serologiska pipetter, och med pincett, ta bort bomullspluggen från en pipett. Håll ett rakblad med en tång över Bunsenbrännaren tills det är varmt.Använd det uppvärmda bladet för att skära av den avsmalnande änden av den andra pipetten så att hela pipetten har en jämn diameter. Ta nu snabbt de två modifierade pipettändarna nära lågan och smält dem något. Gå med i dessa ändar genom att trycka ihop dem ordentligt och se till att väggarna i båda pipetterna är kontinuerliga.Om några luckor är synliga efter sammanfogning, bryt isär dem och upprepa detta steg. Förbered NGM med 4% agar enligt standardmaskprocedurer och fyll varje kammare genom att fästa den på en serologisk pipetter medan agar fortfarande är smält. För att minimera eventuella variationer i agarens konsistens på grund av ojämn kylning, håll pipetteren parallellt med bänkskivan medan du drar upp agar.Dra sedan långsamt lösningen och försegla spetsen med parafilm innan du tar bort kammaren från pipetteren. Lägg kammaren platt för att svalna och låt agar härda innan du rör dig. När du har kylt, värm en tre millimeter hexnyckel över en Bunsen-brännare och skapa en liten plastöppning genom att trycka fast den i väggen i varje kammare cirka fem millimeter till ena sidan av mittlinjen.Använd sedan ett uppvärmt blad för att ta bort kammarens bomull och avsmalnande ändar och försegla ändarna med paraffinfilm. 10 till 15 dagar före experimentet, dela varje stam på två till tre stora NGM-plattor med OP50-bakterier och linda in paraffinfilmen. Samla maskar genom att skölja locken och plattorna med M9 Buffer och pipettera lösningen i 15 ml centrifugrör.Pellet maskarna genom att snurra vid 1600 x G i 30 till 60 sekunder vid rumstemperatur och aspirera det mesta av M9-bufferten med en pipett eller vakuumsugare. Tillsätt sju milliliter 1% natriumdodecylsulfatlösning till varje maskpellet och lämna maskarna i den i 30 minuter. För att tillåta luftning, fortsätt rotera rören kontinuerligt under denna tid.Ta sedan bort tvättmedlet genom att skölja det tre till fem gånger med M9. Efter tillsats av fem milliliter M9, tillsätt fem milliliter kallfiltrerad 60% sackaroslösning. Blanda noggrant och skapa en separationsgradient genom att centrifugera vid 1600 x G i fem minuter vid rumstemperatur. Fyll nya 15-milliliters centrifugrör med två milliliter M9-buffert.Krossa nu ändarna av glas Pasteur-pipetter för att bredda borrningen. Och använd dessa pipetter för att överföra det övre lagret av lösningen från sackarosgradienten till de nya rören. Skölj dauers tre till fem gånger med M9 Buffer.Centrifugera dauers vid 1600 x G i fem minuter vid rumstemperatur och aspirera det mesta av M9-lösningen med en pipett eller vakuumsugare. Därefter uppskattar du maskdensiteten genom att manuellt räkna antalet maskar i tre separata 1-mikroliterdroppar under ett dissekerande mikroskop och använd genomsnittet av dessa räkningar för att approximera antalet maskar per mikroliter. Bredda nu spetsborrningen genom att skära änden på 10, 20 eller 200 mikroliter pipettspetsar.Ställ in mikropipetten på en något större volym än den avsedda aspirationsvolymen. Aspirera cirka 1 till 2 mikroliter av den koncentrerade masklösningen och låt en liten mängd luft komma in i spetsen. Tryck försiktigt in pipettspetsen i agar medan du trycker ner mikropipetten.Detta skapar ett injektionsställe utan att täppa till spetsen. Släpp maskarna i agar och använd paraffinfilm för att täta öppningen. För att eliminera så många variabler som möjligt när kamrarna har placerats i en mörk Faraday-bur vid rumstemperatur, märk varje kammare och häng den vertikalt i Faraday-buren.Testa horisontella kontroller samtidigt genom att lägga vissa kammare plant inom samma miljöförhållanden. Använd sedan de vertikalt orienterade N2-maskarna som en positiv kontroll och horisontellt orienterade kamrar som innehåller N2-dauers som en ytterligare negativ kontroll mot de experimentella stammarna. Efter några timmar börjar dauermaskarna sprida sig från startplatsen och tar flera timmar att nå vardera änden av kammaren.Lämna kamrarna ostörda under denna tid och gör poäng inom 12 till 24 timmar efter injektionen. Ta sedan bort kamrarna en i taget och gör gravitaxis genom att leta efter levande dauers under ett dissekerande mikroskop och markera deras platser med bläck. Led inte maskar inom 2,5 centimeter till vardera sidan av injektionsstället eftersom dessa maskar sannolikt inte visar en riktningspreferens.Undvik också att poängsätta maskar som verkar döda eller är fångade i vätskan och kassera alla kamrar som innehåller mer än 50% döda eller simmande maskar. För att kvantifiera resultaten, använd en markör för att dela varje halva av kammaren i sju 3,5 centimeter, med början 2,5 centimeter från injektionsstället. Använd en manuell räknare för att räkna antalet maskar som observerats i varje avsnitt.I caenorhabditis briggsae visade en stor andel dauermaskar migration mot toppen av kamrarna. De horisontella kontrollerna visade emellertid fördelning runt mitten av kamrarna, vilket indikerar negativt gravitaktiskt beteende. De vertikala fördelningarna av caenorhabditis briggsae och caenorhabditis elegans visade inte heller någon skillnad vilket tyder på att caenorhabditis briggsae dauers visar ett negativt gravitaxisbeteende som liknar caenorhabditis elegans dauers.Paralytiska medel såsom natriumazid används inte i detta protokoll. Därför är det viktigt att göra poäng på gravitaxischkamrarna så snart de tas bort från Faraday-buren. Denna analys ledde till upptäckten av negativt gravitaxisbeteende i c.elegans.Genom att testa flera mutanta stammar avslöjade det också genetiska och neurala krav på gravitaxis i maskar.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Asymmetric Gångväg: A Novel Behavioral analys för att studera Asymmetric Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Automated Analysis of a Nematode Population-Based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Profiling Anti-Neu5Gc IgG i humant serum med en Sialoglycan Microarray Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

En enkel och billig test för att mäta mobilitet i musmodeller av muskeldystrofi

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

En grävande/Tunneling analys för detektion av hypoxi i Drosophila melanogaster larver

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Simning inducerad förlamning att bedöma dopamin signalering i Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Kalciumavbildning i fritt uppträdande Caenorhabditis elegans med välkontrollerad, icke-lokaliserad vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

En förbättrad analys och verktyg för att mäta mekanisk nociception i Drosophila Larver

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Jämförande analys av experimentella metoder för att kvantifiera djuraktivitet i Caenorhabditis elegans Modeller av mitokondriell sjukdom

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

En hög genomströmnings microplate feeder analys för kvantifiering av konsumtion i Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...