Name: large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden JHR'ye (#R01 5R01HD081266 ve #R01GM141493) yapılan araştırma hibeleri ile desteklenmiştir. Bazı suşlar, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır. Pradeep Joshi'ye (UCSB) editoryal katkısı için teşekkür ederiz. UCSB DATALAB tarafından sağlanan istatistiksel danışmanlık.

Bu çalışmada kullanılan suşlar C. elegans (N2) ve C. briggsae (AF16) 'dir (bakınız Malzeme Tablosu). Her tahlil için karışık cinsiyetli bir dauer popülasyonu kullanıldı.
1. Oda hazırlığı
<ol><li>Bir duman davlumbazında çalışın. Çalışma alanını bir Bunsen brülörü, 1-2 tıraş bıçağı, pense, cımbız ve plastik kesme yüzeyi ile ayarlayın (bkz.</li>
	<li>Her oda için iki adet 5 mL seroloji...

<ol>
	<li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+for+human+balance+control.">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li><li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates.">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).</li><li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors.">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li><li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis.">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li><li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway.">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391 (2014).</li><li>Fr&#233;zal, L., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+outside+the+Petri+dish.">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans,+is+regulated+by+IL2+neurons.">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li><li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae.">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li><li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans.">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>H&#228;der, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitaxis+in+Euglena.">Gravitaxis in Euglena.</a> Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston's+organ.">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li><li>Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis.">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+chemotaxis+assay.">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans.">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493 (2015).</li><li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals.">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae.">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).</li><li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+dauer+larvae.">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li><li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn's+test.">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li><li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+a+sensible+model+for+sensory+biology.">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li><li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li><li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound.">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li><li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans.">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).</li><li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans.">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).</li><li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels.">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li><li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron.">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).</li><li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear.">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li><li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+the+vestibular+system.">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology &amp; Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li><li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+vestibular+syndromes.">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li><li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders.">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).</li><li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hearing+and+balance.">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567 (2019).</li></ol>

Önceki yöntemlerle karşılaştırma Kemotaksislerin aksine, Caenorhabditis'teki gravitaksis, geleneksel bir agar plakası deney tasarımı kullanılarak güvenilir bir şekilde gözlemlenemez. Standart bir Petri kabının çapı 150 mm'dir, bu da dauers'ın gravitaksis tercihini göstermesi için her iki yönde de sadece 75 mm ile sonuçlanır. C. elegans'ın oryantasyonel tercihi çözüm12'de test edilebilse de, solucanların birer birer analiz edilmesi g...

Dünya'nın yerçekimi çekimini algılamak, birçok organizmanın yönelimi, hareketi, koordinasyonu ve dengesi için çok önemlidir. Bununla birlikte, yerçekimi duyusunun moleküler mekanizmaları ve nörodevresi, diğer duyularla karşılaştırıldığında yeterince anlaşılmamıştır. Hayvanlarda, yerçekimi hissi, davranışı etkilemek için diğer uyaranlarla etkileşime girer ve onları geride bırakabilir. Görsel ipuçları, propriyoseptif geri bildirim ve vestibüler bilgi, bir hayvanın çevresine göre vücut farkındalığı duygusu oluşturmak için entegre edilebilir 1,2. Tersine, gravitaktik tercih, diğer uyaranların varlığında değiştirilebilir 3,4,5. Bu nedenle, gravitaktik davranış, yerçekimi hissini incelemek ve sinir sisteminin karmaşık duyusal entegrasyonunu ve karar verme sürecini anlamak için idealdir.
C. elegans, polifenik yaşam döngüsü nedeniyle gravitaksisi incelemek için özellikle yararlı bir model organizmadır. Isı, aşırı kalabalık veya yiyecek eksikliği de dahil olmak üzere gelişim sırasında stresörlere maruz kaldığında, C. elegans larvaları strese karşı oldukça dirençli olan dauer'lere dönüşür6. Dauers olarak, solucanlar, solucanların kuyruklarında "durdukları" ve kafalarını salladıkları niktasyon gibi karakteristik davranışlar sergilerler, bu da daha iyi habitatlara dağılmayı kolaylaştırabilir7. C. elegans ve C. japonica'nın gravitaksis tahlilleri, dauer larvalarının negatif gravitik olduğunu ve bu davranışın dauerlerde yetişkinlere göre daha kolay gözlendiğini göstermektedir 8,9. Gravitaksisin diğer Caenorhabditis suşlarında test edilmesi, gravitaktik davranışta doğal varyasyonları ortaya çıkarabilir.
Yerçekimi hissi mekanizmaları Euglena, Drosophila, Ciona ve gravitaksis tahlilleri3,10,11 kullanan diğer çeşitli türlerde karakterize edilmiştir. Bu arada, Caenorhabdisit'teki gravitaksis çalışmaları başlangıçta karışık sonuçlar verdi. C. elegans'ın oryantasyon tercihi üzerine yapılan bir araştırma, solucanların çözelti içinde başları aşağı doğru yönlendirildiğini ve pozitif yerçekimi tercihini düşündürdüğünü bulmuştur12. Bu arada, C. japonica dauers erken dönemde negatif gravitaktik8 olarak tanımlansa da, bu davranış sadece yakın zamanda C. elegans9'da tanımlanmıştır. Solucanlarda temsili bir gravitaksis testi geliştirmede çeşitli zorluklar ortaya çıkmaktadır. Caenorhabditis suşları agar plakalarında tutulur; Bu nedenle, davranışsal testler tipik olarak deneysel tasarımlarının bir parçası olarak agar plakalarını kullanır13,14,15. Caenorhabdisit'te bildirilen en erken gravitaksis testi, yatay kontrol plakası8'e 90 ° açıyla yan tarafında bir plaka durarak gerçekleştirildi. Bununla birlikte, gravitaksis davranışı bu koşullar altında her zaman sağlam değildir. Yetişkin solucanlar çözüm12'de oryantasyonel tercih için test edilebilirken, bu yön tercihi de bağlama bağlı olabilir ve solucanlar yüzmek yerine sürünüyorsa farklı davranışlara yol açabilir. Ek olarak, C. elegans, yerçekimine tepkilerine müdahale eden ışık ve elektromanyetik alanlar16,17 de dahil olmak üzere diğer uyaranlara duyarlıdır9. Bu nedenle, diğer çevresel değişkenlere karşı kalkan oluşturan güncellenmiş bir gravitaksis testi, bu duyusal sürecin mekanizmalarını incelemek için önemlidir.
Bu protokolde, Caenorhabditis gravitaksis'i gözlemlemek için bir tahlil tanımlanmıştır. Bu çalışmanın kurulumu kısmen nöromüsküler bütünlüğü incelemek için geliştirilen bir yönteme dayanmaktadır18,19. Dauer larvaları standart prosedürler20 kullanılarak kültürlenir ve izole edilir. Daha sonra agar ile doldurulmuş iki adet 5 mL serolojik pipetten yapılmış odalara enjekte edilirler. Bu odalar dikey veya yatay olarak yönlendirilebilir ve ışığa ve elektromanyetik alanlara karşı koruma sağlamak için 12-24 saat boyunca karanlık bir Faraday kafesine yerleştirilebilir. Her solucanın odalardaki yeri kaydedilir ve C. elegans N2 gibi bir referans suşunun dikey taksileriyle karşılaştırılır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Sodium Dodecyl Sulfate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From stock 10% (w/v) SDS in DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm Hex key</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other similar sized metal tools may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &#956;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S68228C</td>
			<td>Polystyrene, not borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% Cold sucrose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 &#956;m filter). Keep at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF16 C. briggsae or other experimental strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling-wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable razor blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30&#34; L x 6&#34; W x 26&#34; H or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sharpie or other brand for marking on plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 C. elegans strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates with OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating vertical mixer</td>
			<td>BTLab SYSTEMS</td>
			<td>BT913</td>
			<td>With 22 x 15 mL tube bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>S2103LS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick NGM/agar plate media - 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale gravitaxis assay of caenorhabditis dauer larvae

Yerçekimi hissi önemli ve nispeten az çalışılmış bir süreçtir. Yerçekimini algılamak, hayvanların çevrelerinde gezinmelerini sağlar ve hareketi kolaylaştırır. Ek olarak, memeli iç kulağında meydana gelen yerçekimi hissi, işitme ile yakından ilgilidir - bu nedenle, bu süreci anlamanın işitsel ve vestibüler araştırmalar için etkileri vardır. Gravitaksis testleri, Drosophila da dahil olmak üzere bazı model organizmalar için mevcuttur. Tek solucanlar daha önce çözeltiye yerleştikçe oryantasyon tercihleri için test edilmiştir. Bununla birlikte, Caenorhabditis gravitaksisi için güvenilir ve sağlam bir test tanımlanmamıştır. Mevcut protokol, bir seferde yüzlerce Caenorhabditis dauerini test etmek için kullanılabilecek gravitaksis tahlilleri yapmak için bir prosedürü özetlemektedir. Bu büyük ölçekli, uzun mesafeli tahlil, standart bir plaka tabanlı tahlilde gözden kaçırılabilecek fenotipleri ortaya çıkaran ayrıntılı veri toplamaya izin verir. Dikey eksen boyunca Dauer hareketi, yön yanlılığının yerçekiminden kaynaklandığından emin olmak için yatay kontrollerle karşılaştırılır. Yerçekimi tercihi daha sonra suşlar veya deneysel koşullar arasında karşılaştırılabilir. Bu yöntem, solucanlardaki gravitaksisler için moleküler, hücresel ve çevresel gereksinimleri belirleyebilir.

Türler arasında gravitaksisin karşılaştırılması Yukarıda özetlenen prosedürü takiben, C. briggsae dauer gravitaksis, C. elegans gravitaksisi ve yatay kontrolleri ile karşılaştırılabilir. C. briggsae dauers'ın dikey dağılımı (kestane), odaların tepelerine doğru eğilir ve solucanların büyük bir yüzdesi +7'ye ulaşır (Şekil 2A). Dauerlerin odaların merkezi etrafında kabaca çan şeklinde bir eğri halinde dağıldı...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae at JoVE.com

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Mevcut protokol, Caenorhabditis dauer larvaları ile büyük ölçekli bir gravitaksis testi yapmak için yöntemleri özetlemektedir. Bu protokol, plaka tabanlı bir tahlille karşılaştırıldığında gravitaksis davranışının daha iyi algılanmasını sağlar.

Caenorhabditis Dauer larvalarının büyük ölçekli gravitaksis testi

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Bu yüksek verimli tahlil, caenorhabditis dauer larvalarında sağlam gravitaktik davranışı gözlemlemek için kullanılabilir. Solucan davranışı, bir petri kabı üzerinde yapılan tahlillerle karşılaştırıldığında büyük mesafelerde gözlenir. Bu, tahlilin hassasiyetini arttırır ve ayrıntılı veri analizine izin verir.Gravitaksis davranışını incelemek, memeli vestibüler sistemini anlamak için ilgisi olan caenorhabditis'te yerçekimi hissinin nasıl oluştuğuna dair fikir verebilir. Gravitaksis tahlil odalarının oluşturulması, dauerlerin izole edilmesi ve solucanların odalara enjekte edilmesi pratik gerektirir. Dauerleri izole ederek ve odaları bir gün önceden oluşturarak zamandan tasarruf edebilirsiniz.Bir Bunsen brülörü, bir ila iki tıraş bıçağı, pense, cımbız ve plastik bir kesme yüzeyi ve bir duman başlığı kurarak başlayın. Bir oda yapmak için, iki adet 5 mililitrelik serolojik pipet toplayın ve cımbızla pamuk tapasını bir pipetten çıkarın. Pense kullanarak bir tıraş bıçağını sıcak olana kadar Bunsen brülörün üzerinde tutun.Isıtılmış bıçağı kullanarak ikinci pipetin konik ucunu dilimleyin, böylece pipetin tamamı eşit bir çapa sahip olur. Şimdi, modifiye edilmiş iki pipet ucunu hızlı bir şekilde aleve yaklaştırın ve hafifçe eritin. Bu uçları sıkıca birbirine bastırarak birleştirin ve her iki pipetin duvarlarının sürekli olmasını sağlayın.Birleştirmeden sonra herhangi bir boşluk görünüyorsa, bunları ayırın ve bu adımı tekrarlayın. Standart solucan prosedürlerine göre NGM'yi %4 agar ile hazırlayın ve agar hala erimişken serolojik bir pipetleyiciye takarak her odayı doldurun. Düzensiz soğutma nedeniyle agarın kıvamındaki değişiklikleri en aza indirmek için, agar'ı hazırlarken pipetleyiciyi tezgah üstüne paralel tutun.Ardından çözeltiyi yavaşça çekin ve odayı pipetleyiciden çıkarmadan önce ucu parafilm ile kapatın. Odayı soğuması için düz bir şekilde yerleştirin ve hareket etmeden önce agarın sertleşmesine izin verin. Soğutulduktan sonra, üç milimetrelik bir altıgen anahtarı bir Bunsen brülörü üzerinde ısıtın ve orta hattın bir tarafına yaklaşık beş milimetre kadar her odanın duvarına sıkıca bastırarak küçük bir plastik açıklık oluşturun.Daha sonra, odanın pamuğu ve konik uçlarını çıkarmak için ısıtılmış bir bıçak kullanın ve uçları parafin filmle kapatın. Deneyden 10 ila 15 gün önce, her bir suşu OP50 bakterileri ile iki ila üç büyük NGM plakasına koyun ve parafin filmini sarın. Kapakları ve plakaları M9 Tamponu ile durulayarak ve çözeltiyi 15 mililitrelik santrifüj tüplerine pipetleyerek solucanları toplayın.Oda sıcaklığında 30 ila 60 saniye boyunca 1600 x G'de döndürerek solucanları toplayın ve M9 Tamponunun çoğunu bir pipet veya vakum aspiratörü ile aspire edin. Her solucan peletine yedi mililitre% 1 sodyum dodesil sülfat çözeltisi ekleyin ve solucanları 30 dakika boyunca içinde bırakın. Havalandırmaya izin vermek için, bu süre zarfında tüpleri sürekli döndürmeye devam edin.Ardından, deterjanı M9 ile üç ila beş kez durulayarak çıkarın. Beş mililitre M9 ekledikten sonra, beş mililitre soğuk filtrelenmiş% 60 sakkaroz çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1600 x G'de santrifüj yaparak bir ayırma gradyanı oluşturun. Yeni 15 mililitrelik santrifüj tüplerini iki mililitre M9 Buffer ile doldurun.Şimdi deliği genişletmek için cam Pasteur pipetlerin uçlarını ezin. Ve bu pipetleri, çözeltinin üst tabakasını sakkaroz gradyanından yeni tüplere aktarmak için kullanın. Dauerleri M9 Buffer ile üç ila beş kez durulayın.Dauerleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1600 x G'de santrifüj yapın ve M9 çözeltisinin çoğunu bir pipet veya vakum aspiratörü ile aspire edin. Daha sonra, diseksiyon mikroskobu altında üç ayrı 1 mikrolitrelik damlacıktaki solucan sayısını manuel olarak sayarak solucan yoğunluğunu tahmin edin ve mikrolitre başına solucan sayısını yaklaşık olarak belirlemek için bu sayımların ortalamasını kullanın. Şimdi 10, 20 veya 200 mikrolitrelik pipet uçlarının ucunu keserek uç deliğini genişletin.Mikropipeti, amaçlanan aspirasyon hacminden biraz daha büyük bir hacme ayarlayın. Konsantre solucan çözeltisinin yaklaşık 1 ila 2 mikrolitresini aspire edin ve uca az miktarda havanın girmesine izin verin. Mikro pipeti bastırırken pipet ucunu yavaşça agarın içine itin.Bu, ucu tıkamadan bir enjeksiyon bölgesi oluşturacaktır. Solucanları agarın içine bırakın ve açıklığı kapatmak için parafin filmi kullanın. Odalar oda sıcaklığında karanlık bir Faraday kafesine yerleştirildikten sonra mümkün olduğunca çok değişkeni ortadan kaldırmak için, her odayı etiketleyin ve Faraday kafesine dikey olarak asın.Bazı odaları aynı çevre koşulları içinde düz bir şekilde yerleştirerek yatay kontrolleri eşzamanlı olarak test edin. Daha sonra dikey yönelimli N2 solucanlarını pozitif bir kontrol olarak ve N2 dauers içeren yatay yönelimli odaları deneysel suşlara karşı ek bir negatif kontrol olarak kullanın. Birkaç saat sonra, dauer solucanları başlangıç bölgesinden dağılmaya başlar ve odanın her iki ucuna da ulaşması birkaç saat sürer.Bu süre zarfında odaları rahatsız etmeden bırakın ve enjeksiyondan sonraki 12 ila 24 saat içinde puan alın. Daha sonra, odaları birer birer çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında canlı dauers arayarak ve yerlerini mürekkeple işaretleyerek gravitaksileri puanlayın. Enjeksiyon bölgesinin her iki tarafına 2,5 santimetre içinde solucanlar atmayın, çünkü bu solucanların yön tercihi göstermesi muhtemel değildir.Ayrıca, ölü görünen veya sıvıda sıkışıp kalmış solucanları puanlamaktan kaçının ve% 50'den fazla ölü veya yüzme solucanı içeren odaları atın. Sonuçları ölçmek için, odanın her yarısını enjeksiyon bölgesinden 2,5 santimetre uzakta başlayarak yedi 3,5 santimetreye bölmek için bir işaretleyici kullanın. Her bölümde gözlemlenen solucan sayısını hesaplamak için manuel bir uyarı sinyali sayacı kullanın.Caenorhabditis briggsae'de, dauer solucanlarının büyük bir yüzdesi odaların tepesine doğru göç gösterdi. Bununla birlikte, yatay kontroller, odaların merkezi etrafında dağılım gösterdi ve negatif yerçekimsel davranışı gösterdi. Ayrıca, caenorhabditis briggsae ve caenorhabditis elegans'ın dikey dağılımları, caenorhabditis briggsae dauers'in caenorhabditis elegans dauers'e benzer negatif bir gravitaksis davranışı gösterdiğini düşündüren herhangi bir fark göstermemiştir.Bu protokolde sodyum azid gibi paralitik ajanlar kullanılmaz. Bu nedenle, gravitaksis odalarını Faraday kafesinden çıkarılır çıkarılmaz puanlamak önemlidir. Bu tahlil, c.elegans'ta negatif gravitaksis davranışının keşfine yol açtı.Birkaç mutant suşu test ederek, solucanlardaki gravitaksis için genetik ve sinirsel gereksinimleri de ortaya çıkardı.

Research

JoVE Journal

Behavior

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Asimetrik Yürüme Yolu: Asimetrik Locomotion incelenmesi için Yeni Bir Davranış Testi

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Nematod Popülasyona Dayalı Kemoterapi Tercihi Testinin Otomatik Analizi

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Anti-Neu5Gc IgG&#39;yi İnsan Sera&#39;sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

Ambulation kas distrofisi, fare modellerinde ölçmek için basit ve düşük maliyetli bir tahlil

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Bir oyuk/tünel tahlil için algılama hipoksi Drosophila melanogaster larva içinde

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Yüzme felç indüklenen Caenorhabditis elegans dopamin sinyal değerlendirmek için

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

İyi Kontrollü, Lokalize Olmayan Titreşimli Serbest Davranan Caenorhabditis elegans'ta Kalsiyum Görüntüleme

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Drosophila Larvalarında Mekanik Nosiception Ölçümü için Geliştirilmiş Bir Tahlil ve Araçlar

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Drosophila'da Tüketimin Nicelleştirilmesi için Yüksek Verimli Mikro Plaka Besleyici Tahlili

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...