Name: procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor at JoVE.com

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بمواضيع الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان التابعة للشبكة الصحية الجامعية (IACUC) ويتم تنفيذها وفقا لبروتوكول وإجراءات مركز الموارد الحيوانية التابع لشبكة الصحة الجامعية وإرشادات المجلس الكندي لرعاية الحيوان. تم استخدام خمسة خنازير يو?...

<ol>
	<li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity:+A+Prospective+Study.">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li><li>Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+after+pedicled+or+free+TRAM+flap+surgery:+A+prospective+and+objective+study.">Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+free-style+flaps:+Risk+analysis+of+complications.">A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).</li><li>Issa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allograft-specific+characteristics+of+immune+responses.">Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses.</a> Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).</li><li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration.">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li><li>Iske, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+tissue+allotransplantation:+Opportunities+and+challenges.">Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges.</a> Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).</li><li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine.">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).</li><li>Colazo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applied+bioengineering+in+tissue+reconstruction,+replacement,+and+regeneration.">Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+in+tissue+engineering.">Vascularization in tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+skin/adipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps.">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li><li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+bioengineered+skin+flap+scaffold+with+a+perfusable+vascular+pedicle.">Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle.</a> Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).</li><li>Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+large-volume+human-derived+adipose+acellular+allogenic+flap+by+perfusion+decellularization.">Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+skeletal+muscle+as+a+three-dimensional+scaffold+with+a+vascular+network+template.">Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template.</a> Biomaterials. 89, 114-126 (2016).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+the+porcine+ear+generates+a+biocompatible,+nonimmunogenic+extracellular+matrix+platform+for+face+subunit+bioengineering.">Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering.</a> Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularization+of+human+ear+grafts+enables+ECM-based+scaffolds+for+auricular+vascularized+composite+tissue+engineering.">Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+a+human+face+graft:+The+matrix+of+identity.">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li><li>Haughey, B. H., Panje, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+for+multiple+musculocutaneous+flaps.">A porcine model for multiple musculocutaneous flaps.</a> The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).</li><li>Khachatryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap.">Radial Forearm Flap.</a> Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).</li><li>Hammouda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+nanostructure+of+SDS+micelles+in+water.">Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).</li><li>Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+a+fasciocutaneous+flap+for+use+as+a+perfusable+scaffold.">Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold.</a> Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).</li><li>Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+tissue+decellularization+used+for+preparation+of+biologic+scaffolds+and+in+vivo+relevance.">Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance.</a> Methods. 84, 25-34 (2015).</li><li>Mendibil, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+decellularization+methods:+Rationale+and+strategies+to+achieve+regenerative+compounds.">Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).</li><li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds:+A+systematic+review.">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).</li><li>Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+tissues+by+perfusion+decellularization/recellularization:+Review.">Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.</a> Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).</li><li>Adil, A., Xu, M., Haykal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recellularization+of+bioengineered+scaffolds+for+vascular+composite+allotransplantation.">Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation.</a> Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).</li><li>Phelps, E. A., Garc&#237;a, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+more+than+a+cell:+Vascularization+strategies+in+tissue+engineering.">Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).</li><li>Pozzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+porcine+fascio-cutaneous+flap+model+for+vascularized+composite+allografts+bioengineering+studies.">A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).</li><li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+repopulation+and+preparation+of+rodent+extracellular+matrix+scaffolds+for+renal+tissue+development.">Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).</li><li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system.">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li><li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+systems+and+devices:+State-of-the-art.">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li><li>Schilling, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+an+automatable,+3D+printed+perfusion+device+for+tissue+infusion+and+perfusion+engineering.">Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).</li></ol>

يستخدم البروتوكول المقترح نضح SDS منخفض التركيز لإزالة الخلايا من مجموعة من اللوحات المشتقة من الخنازير. مع هذا الإجراء ، يمكن إزالة الثرب اللاخلوي ، واللفافة الموترة ، واللوحات الساعدية الكعبرية بنجاح باستخدام بروتوكول يفضل SDS منخفض التركيز. حددت تجارب التحسين الأولية أن SDS بتركيز منخفض (...

يمكن أن تؤدي الإصابة الرضحية وإزالة الورم إلى عيوب كبيرة ومعقدة في الأنسجة الرخوة. يمكن أن تضعف هذه العيوب نوعية حياة المريض ، وتسبب فقدان الوظيفة ، وتؤدي إلى إعاقة دائمة. في حين أن تقنيات مثل نقل رفرف الأنسجة الذاتية قد تم ممارستها بشكل شائع ، فإن المشكلات المتعلقة بتوافر السديلة ومراضة موقع المتبرع هي قيود رئيسية1،2،3. زرع الأوعية الدموية المركب (VCA) هو بديل واعد ينقل الأنسجة المركبة ، على سبيل المثال ، العضلات والجلد والأوعية الدموية ، كوحدة واحدة إلى المتلقين. ومع ذلك ، يتطلب VCA كبت المناعة على المدى الطويل ، مما يؤدي إلى سمية الدواء ، والالتهابات الانتهازية ، والأورام الخبيثة4،5،6.
السقالات اللاخلوية المهندسة بالأنسجة هي حل محتمل لهذه القيود7. يمكن الحصول على سقالات الأنسجة اللاخلوية باستخدام طرق إزالة الخلايا ، والتي تزيل المواد الخلوية من الأنسجة الأصلية مع الحفاظ على البنية الدقيقة الأساسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM). على عكس استخدام المواد الاصطناعية في هندسة الأنسجة ، فإن استخدام السقالات المشتقة بيولوجيا يوفر ركيزة ECM محاكاة حيوية تسمح بالتوافق الحيوي وإمكانية الترجمة السريرية8. بعد إزالة الخلايا ، يمكن أن تؤدي إعادة الخلايا اللاحقة للسقالات بخلايا خاصة بالمتلقي إلى توليد أنسجة وظيفية وعائية مع القليل من المناعة9،10،11. من خلال تطوير بروتوكول فعال للحصول على الأنسجة اللاخلوية باستخدام تقنيات إزالة الخلايا من التروية ، يمكن هندسة مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. في المقابل ، يسمح البناء على هذه التقنية بالتطبيق على أنسجة أكثر تعقيدا. حتى الآن ، تم التحقيق في إزالة الخلايا من الأنسجة الرخوة الوعائية باستخدام أنسجة وعائية بسيطة مثل رفرف لفافة جلدية كامل السماكة في القوارض 12 ، والخنازير13 ، والنماذج البشرية 14 ، وكذلك الخنزير المستقيم البطني العضلات الهيكلية15. بالإضافة إلى ذلك ، تم أيضا إزالة خلايا التروية من الأنسجة الوعائية المعقدة كما هو موضح في نماذج الخنازير والأذن البشرية 16,17 ونماذج الكسب غير المشروع للوجه البشري18.
هنا ، يصف البروتوكول إزالة الخلايا من اللوحات الحرة الوعائية باستخدام سقالات ECM المشتقة بيولوجيا. نقدم إزالة الخلايا من ثلاث لوحات ذات صلة سريريا: 1) الثرب ، 2) اللفافة الموترة ، و 3) الساعد الكعبري ، وكلها تمثل اللوحات العمود الفقري المستخدمة بشكل روتيني في الجراحة الترميمية ولم يتم فحصها مسبقا في الدراسات التي أجريت على الحيوانات في سياق إزالة الخلايا من الأنسجة. توفر هذه اللوحات المهندسة بيولوجيا منصة متعددة الاستخدامات ومتاحة بسهولة ولديها القدرة على التطبيقات السريرية للاستخدام في مجال إصلاح وإعادة بناء عيوب الأنسجة الرخوة الكبيرة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.2 &#181;m pore Acrodisk Filter</td>
			<td >VWR</td>
			<td >CA28143-310</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JF7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 L Polypropylene Carboy</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-62507-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>&#160;LS639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-way Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-30600-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Atropine Sulphate 15 mg/30ml</td>
			<td>Rafter 8 Products</td>
			<td>238481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 20-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 22-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 24-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS, 10X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-415-CL</td>
			<td>&#160;without Ca++/Mg++</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin, 1000 I.U./mL</td>
			<td>Leo Pharma A/S</td>
			<td>453811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine Hydrochloride&#160; 5000 mg/50 ml</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>612316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td>Internal Diameter:&#160; 1.85 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec REGLO 4-Channel Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>78001-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Tubing Cassettes</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-78016-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane 99.9%, 250 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2231929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Lennox</td>
			<td>Bioshop Canada</td>
			<td>LBL406.500</td>
			<td>Sterility testing agar plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Masterflex L/S 16 Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam 50 mg/10 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2242905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopolar Cautery Pencil</td>
			<td>Valleylab</td>
			<td>E2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Buffered Formalin, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#176;11 scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Connector for 1/4&#34; to 1/8&#34; Tube ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Tube 90&#176; Elbow Connectors</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Plugs</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K143</td>
			<td>Male Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Sockets</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K293</td>
			<td>Female Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Punch Biopsy Tool</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>3332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride 40 mEq/20 ml</td>
			<td>Hospira Healthcare Corporation</td>
			<td>37869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine, 10%</td>
			<td>Rougier</td>
			<td>833133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serological Pipet, 2mL</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Snap Lid Airtight Containers</td>
			<td>SnapLock</td>
			<td>142-3941-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical Metal Ligation Clips, Small</td>
			<td >Teleflex</td>
			<td >001200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >BC004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TruWave Pressure Monitoring Set</td>
			<td >Edwards Lifesciences</td>
			<td >PX260</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor

تؤدي عيوب الأنسجة الرخوة كبيرة الحجم إلى عجز وظيفي ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على نوعية حياة المريض. على الرغم من أنه يمكن إجراء إعادة الإعمار الجراحي باستخدام نقل السديلة الحرة الذاتية أو زرع الأوعية الدموية المركبة (VCA) ، إلا أن هذه الطرق لها أيضا عيوب. تحد مشكلات مثل المراضة في موقع المتبرع وتوافر الأنسجة من نقل السديلة الحرة ذاتية المنشأ ، في حين أن كبت المناعة يمثل قيدا كبيرا على VCA. تمثل الأنسجة المهندسة في الجراحة الترميمية باستخدام طرق إزالة الخلايا / إعادة الخلايا حلا ممكنا. يتم إنشاء الأنسجة منزوعة الخلايا باستخدام طرق تزيل المواد الخلوية الأصلية مع الحفاظ على البنية الدقيقة الأساسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM). يمكن بعد ذلك إعادة تشكيل هذه السقالات اللاخلوية لاحقا بخلايا خاصة بالمستلم.
يفصل هذا البروتوكول طرق الشراء وإزالة الخلايا المستخدمة لتحقيق السقالات اللاخلوية في نموذج الخنازير. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر أيضا وصفا لتصميم وإعداد المفاعل الحيوي للتروية. تشمل اللوحات الثرب الخنزير ، واللفافة الموترة ، والساعد الكعبري. يتم إجراء إزالة الخلايا عن طريق التروية خارج الجسم الحي لمنظف كبريتات دوديسيل الصوديوم منخفض التركيز (SDS) متبوعا بمعالجة إنزيم DNase وتعقيم حمض البيراسيتيك في مفاعل حيوي مخصص للتروية.
تتميز عملية إزالة الخلايا الناجحة للأنسجة بمظهر أبيض معتم من اللوحات بشكل مجهري. تظهر اللوحات اللاخلوية عدم وجود نوى على تلطيخ نسيجي وانخفاض كبير في محتوى الحمض النووي. يمكن استخدام هذا البروتوكول بكفاءة لإنشاء سقالات الأنسجة الرخوة منزوعة الخلايا مع ECM المحفوظة والهندسة المعمارية الدقيقة الوعائية. يمكن استخدام هذه السقالات في دراسات إعادة التشكيل الخلوي اللاحقة ولديها القدرة على الترجمة السريرية في الجراحة الترميمية.

يعتمد هذا البروتوكول لإزالة الخلايا من اللوحات الخنازير الوعائية على تروية منظف قائم على الأيونات ، SDS ، من خلال الأوعية الدموية السديلة في مفاعل حيوي مخصص للتروية. قبل إزالة الخلايا ، تم شراء ثلاث لوحات وعائية في نموذج خنزير وقناتها وفقا لأوعية الإمداد الرئيسية. تم مسح اللوحات على الفور ?...

Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor at JoVE.com

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

يصف البروتوكول الشراء الجراحي وإزالة الخلايا اللاحقة لسدائل الخنازير الوعائية عن طريق تروية منظف كبريتات دوديسيل الصوديوم من خلال الأوعية الدموية في مفاعل حيوي مخصص للتروية.

شراء ونزع الخلايا من اللوحات الوعائية الخنازير في مفاعل حيوي مخصص للتروية

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

تصف هذه الطريقة الشراء الجراحي لثلاث لوحات خنزير وعائية ونزع الخلايا اللاحقة للتروية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الجهود المبذولة لتجديد اللوحات الخنازير باستخدام نهج إزالة الخلايا من الأنسجة وإعادة الخلوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تنوعها لتحقيق إزالة الخلايا عبر مجموعة متنوعة من اللوحات الخنازير الوعائية في إعداد مفاعل حيوي بسيط للتجميع.يمكن تطبيق التقنية الموصوفة هنا على نطاق واسع على اللوحات الوعائية الأخرى كحل محتمل لهندسة الأنسجة باستخدام اللوحات الخنازير في الجراحة الترميمية. للبدء ، قم بعمل أنبوب تدفق وتدفق عن طريق قياس حوالي 50 سم من أنابيب السيليكون المطلية بالبلاتين LS16. قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب مضخة أصفر مكون من 3 نقاط والآخر بماصة مصلية معقمة سعة 2 ملليلتر لنقل البيرفوسات من خزانات المنظفات إلى غرفة المفاعل الحيوي.الأوتوكلاف الغرفة والأنابيب في عبوات معقمة ملفوفة بشكل فردي. لشراء رفرف omental ، ضع خنزير يوركشاير مخدر يبلغ من العمر 12 أسبوعا في وضع ضعيف ، ثم قم بإعداد البطن بالطريقة المعقمة المعتادة. إجراء بضع البطن السري xipho لدخول البطن وتعبئة cephalad المعدة ، ووضع الثرب في مجال المنطوق.بدءا من الجانب الأيسر من الانحناء الأكبر ، حيث ينضم الشريان المعدي الأيسر إلى الشريان الطحال ، قم بهيكل عظمي للشريان والوريد المعدي الأيسر باستخدام مقص ستيفنز المستقيم. ثم قم بالربط والتقسيم بشكل منفصل باستخدام الروابط أو المشابك الجراحية. استمر على طول الانحناء الأكبر للمعدة من اليسار إلى اليمين لربط وتقسيم الفروع الوعائية القصيرة الناشئة عن الثرب ، مما يوفر انحناءا أكبر للمعدة.استمر في تعبئة الثرب الأكبر حتى يتم مواجهة تقاطع الأوعية المعدية اليمنى والشريان المعدي المعوي. ثم قم بربط وتقسيم الشريان المعدي والوريد الأيمن لتحرير السديلة العضلية والسماح بقنية السديلة لاحقا. لشراء رفرف اللفافة الموتر ، ضع الخنزير في وضع الاستلقاء الجانبي.حدد حدود السديلة الداخلية من العمود الفقري الحرقفي العلوي الأمامي ، أو ASIS ، باتجاه الرضفة الجانبية ، والحد الخلفي حوالي 8 إلى 10 سم ذيليا. استخدم مشرطا لعمل شق حاد في الهامش البعيد عند الرضفة. تعميق الشق من خلال الأنسجة تحت الجلد للوصول إلى اللفافة التي تغطي المستقيم الفخذي ، ومواصلة الشقوق نحو ASIS على طول الحدود المحددة.لعزل السديلة اللفافة وحدها، قم بإزالة مكون الجلد المغطي من طبقة اللفافة الأساسية. ثم ربط أو كي الأوعية المثقبة الصغيرة على الجلد. العودة إلى الحدود البعيدة للرفرف ، وشق اللفافة العميقة.تعبئة اللفافة من العضلة الوعائية الجانبية الكامنة نحو ASIS. بعد تتبع عنيق نحو الأوعية الفخذية العميقة ، هيكل عظمي الشريان الفخذي المحيطي الجانبي والوريد الذي يزود رفرف اللفافة. ثم قم بربط وتقسيم أوعية الرفرف بالقرب منها ، حيث تنضم إلى الأوعية الفخذية العميقة وتسمح بالقنية لاحقا.لشراء رفرف الساعد الشعاعي ، ضع علامة على مربع 3 × 3 سم على الجانب الشعاعي لساعد الخنزير الممتد. ارسم خطا بين نقطة المنتصف لهامش السديلة القريب والحفرة قبل المكعبة للدلالة على المسار التقريبي لعنيق الشريان الكعبري. تأكيد مسار الشرايين مع الجس.بعد ذلك ، شق الجلد باستخدام مشرط في الجانب البعيد بعمق يصل إلى اللفافة قبل العضدية. تشريح حادة مع مقص بضع الوتر حتى يتم مواجهة الشريان الكعبري البعيد و vena comitantes. ثم ربط وتقسيم الشريان والأوردة مع الروابط الجراحية أو المشابك.استمر في شقوق الجلد على الحواف الشعاعية والزندية لمربع الجلد المحدد. ثم قم بتعبئة السديلة من العظم الكعبري الأساسي بشفرة جراحية أو كي ، بدءا من اتجاه الزندي إلى الاتجاه الشعاعي مع رفع رفرف الجلد بالقرب من الحفرة قبل المرفقية. باستخدام مقص بضع الوتر ، قم بهيكل عظمي للشريان الكعبري والوريد بالقرب من الحفرة قبل المرفقية ، حيث ينضمون إلى الشريان العضدي والأوردة ، على التوالي.تشريح الأوعية من الأنسجة الدهنية الليفية المحيطة لعزل عنيق الأوعية الدموية. ثم ربط وتقسيم الشريان والوريد بشكل منفصل لتحرير رفرف الساعد الكعبري. بعد ذلك ، قم بتهوية أوعية عنيق باستخدام قسطرة وعائية من 20 إلى 24 قياسا مثبتة برباط حريري 3-0.اغسل محلول ملحي بالهيبارين في القنية الشريانية السديلة حتى يلاحظ تدفق وريدي واضح. أثناء العمل في خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي ، ضع اللوحات في غرفة أنسجة المفاعل الحيوي. أنابيب تدفق رئيسية مع محلول ملحي معقم بالهيبارين لإزالة الهواء المتبقي وترتيب اللوحات للسماح بالاتصال بين القنية الشريانية السديلة وموصل الذكر الشرياني.ثم استخدم مرقئ معقم لربط القنية الشريانية على الموصل. ثم اغسل المحلول الملحي الهيباريني من خلال المحبس للتحقق من أن اتصال luer بدون تسرب ، وأن التخبط يمكن أن يتخلل مع دليل على التدفق الوريدي. بعد إغلاق غطاء حجرة الأنسجة ، قم بتوصيل أنبوب التدفق بأنبوب مضخة أصفر مكون من 3 توقفات بمحبس التدفق الداخلي لغرفة الأنسجة.أيضا ، قم بتوصيل محول مستشعر الضغط المضمن بمحبس التدفق 3 اتجاهات لمراقبة ضغط التروية. بعد ذلك ، قم بتشغيل مضخة التدفق التمعجية وعلى الشاشة الأولية ، انتقل إلى علامة التبويب الثالثة باستخدام السهم لتعيين معرف الأنبوب على 1.85 ملم. ثم اضبط معدل التروية من علامة التبويب الثانية.يتم ضبط معدل الإدخال كطريقة التسليم على 2 ملليلتر في الدقيقة. تأكد من صحة اتجاه التدفق كما هو معروض على الشاشة. قم بتحميل أنبوب المضخة المكون من 3 درجات إلى المضخة التمعجية باستخدام علبة متوافقة.اضبط إعداد مضخة التدفق الخارجي على معدل 4 ملليلتر في الدقيقة. قم بتوصيل أنبوب التدفق الخارجي بأنبوب مضخة أصفر مكون من 3 نقاط توقف بمحبس التدفق الخارجي لغرفة الأنسجة. ثم قم بتحميل أنبوب المضخة المكون من 3 نقاط إلى المضخة التمعجية ، وابدأ التدفق لكلتا المضختين بالضغط على زر الطاقة في كل مضخة.ابدأ في إزالة الخلايا من اللوحات باستخدام محلول ملحي هيبارين في حجرة الأنسجة لمدة 15 دقيقة لإزالة أي جلطات دموية محتجزة. عند الانتهاء ، استبدل المحلول الملحي المتبقي ب 500 ملليلتر من كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، محلول إزالة الخلايا لغمر السديلة. بعد ذلك ، انقل أنبوب التدفق إلى محلول SDS وقم بغزارة الأنسجة.بعد إزالة الخلايا من SDS ، استنشاق SDS المتبقية قبل استخدام الغطاء مع PBS ليوم واحد. بعد إزالة الخلايا من التروية SDS ، قم بالتتابع بتعطيل اللوحات في محلول الحمض النووي لمدة ساعتين ، ثم في PBS لمدة يوم واحد ، متبوعا بنقل أنبوب التدفق إلى حمض البيراسيتيك والإيثانول في الماء المقطر لتعقيم اللوحات عن طريق التعرق لمدة ثلاث ساعات. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة اللوحات بشكل معقم واغمرها في غسلتين من PBS تحتوي على مضادات حيوية بنسبة 1٪ لمدة 15 دقيقة لكل منهما.قم بتخزين اللوحات عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة لإعادة الخلوية. استخدم أداة خزعة مثقوبة من 3 إلى 10 ملليمترات للحصول على عينات من الأنسجة لتقييم اللوحات منزوعة الخلايا. أظهرت اللوحات المعزولة منزوعة الخلايا التي تم مسحها تحت التحكم اليدوي دليلا على التدفق الخارجي من القنية الوريدية التي يتم تصريفها بحرية من الثرب ، واللفافة الموترة ، ورفرف الساعد الكعبري.ظهر التشكل الإجمالي للثرب الأصلي ، واللفافة الموترة ، واللوحات الساعدية الشعاعية باللون الوردي مباشرة بعد الشراء. وبالمقارنة ، كانت الأنسجة منزوعة الخلايا بيضاء أو معتمة في المظهر. أظهر الفحص النسيجي للأنسجة الأصلية مع الهيماتوكسيلين والإيوزين وجود نوى زرقاء.في اللوحات منزوعة الخلايا ، كشف التلوين النسيجي عن فقدان المواد الخلوية دون تلطيخ نووي أزرق ، مما يشير إلى سقالة الأنسجة اللاخلوية. أظهر القياس الكمي الإضافي لمحتوى الحمض النووي انخفاضا كبيرا في الحمض النووي في السقالات اللاخلوية مقارنة بالأنسجة الأصلية. الاعتبار الأكثر أهمية هو تقنية جراحية تستخدم أثناء الشراء ، مع الحرص على تجنب تلف عنيق السديلة من أجل السماح بنزع الخلايا اللاحقة للتروية.بعد إزالة الخلايا من التروية ، يمكن إعادة الخلايا الناتجة مع مجموعات خلايا خاصة بالأنسجة من أجل تجديد مقصورات الأنسجة الأصلية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

إجراءات Decellularization من القلب التاجي لحم الخنزير من قبل الإرواء الوراء

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

تصميم مفاعل حيوي ذو محورين الميكانيكية جار للهندسة الأنسجة

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

تشغيل الفوق تفاعلات الاحيائية

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

المهندسة أوعية دموية العضلات رفرف

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

فاسكولاريزيد بيوبرينتينج موائع جزيئية لهندسة الأنسجة وأورجانويدس

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

مفاعل حيوي موجه بالتصوير لتوليد أنسجة مجرى الهواء المهندسة بيولوجيا

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

نموذج رفرف لفافة جلدية خزفية موثوقة لدراسات الهندسة الحيوية المركبة الوعائية

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

A Friction Testing-Bioreactor Device for Study of Synovial Joint Biomechanics, Mechanobiology, and Physical Regulation

جهاز اختبار الاحتكاك - المفاعل الحيوي لدراسة الميكانيكا الحيوية للمفصل الزليلي ، وعلم الأحياء الميكانيكي ، والتنظيم الفيزيائي

In primary osteoarthritis (OA), normal 'wear and tear' associated with aging inhibits the ability of cartilage to sustain its load-bearing and lubrication ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

تصنيع اللوحات الوعائية الهندسية باستخدام تقنيات الطباعة 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

مفاعل حيوي متعدد التيار للتروية مدمج مع تجزئة المخرج لزراعة الخلايا الديناميكية

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...