Name: procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor at JoVE.com

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (CCIA) du Réseau universitaire de santé et sont effectuées conformément au protocole et aux procédures du Centre de ressources animales du Réseau universitaire de santé et aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Cinq porcs Yorkshire (35-50 kg; âgés d’environ 12 semaines) ont été utilisés pour toutes les expériences.
1. Fa...

<ol>
	<li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity:+A+Prospective+Study.">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li><li>Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+after+pedicled+or+free+TRAM+flap+surgery:+A+prospective+and+objective+study.">Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+free-style+flaps:+Risk+analysis+of+complications.">A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).</li><li>Issa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allograft-specific+characteristics+of+immune+responses.">Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses.</a> Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).</li><li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration.">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li><li>Iske, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+tissue+allotransplantation:+Opportunities+and+challenges.">Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges.</a> Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).</li><li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine.">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).</li><li>Colazo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applied+bioengineering+in+tissue+reconstruction,+replacement,+and+regeneration.">Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+in+tissue+engineering.">Vascularization in tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+skin/adipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps.">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li><li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+bioengineered+skin+flap+scaffold+with+a+perfusable+vascular+pedicle.">Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle.</a> Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).</li><li>Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. 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H., Panje, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+for+multiple+musculocutaneous+flaps.">A porcine model for multiple musculocutaneous flaps.</a> The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).</li><li>Khachatryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap.">Radial Forearm Flap.</a> Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).</li><li>Hammouda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+nanostructure+of+SDS+micelles+in+water.">Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).</li><li>Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+a+fasciocutaneous+flap+for+use+as+a+perfusable+scaffold.">Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold.</a> Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).</li><li>Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+tissue+decellularization+used+for+preparation+of+biologic+scaffolds+and+in+vivo+relevance.">Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance.</a> Methods. 84, 25-34 (2015).</li><li>Mendibil, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+decellularization+methods:+Rationale+and+strategies+to+achieve+regenerative+compounds.">Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).</li><li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds:+A+systematic+review.">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).</li><li>Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+tissues+by+perfusion+decellularization/recellularization:+Review.">Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.</a> Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).</li><li>Adil, A., Xu, M., Haykal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recellularization+of+bioengineered+scaffolds+for+vascular+composite+allotransplantation.">Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation.</a> Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).</li><li>Phelps, E. A., Garc&#237;a, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+more+than+a+cell:+Vascularization+strategies+in+tissue+engineering.">Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).</li><li>Pozzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+porcine+fascio-cutaneous+flap+model+for+vascularized+composite+allografts+bioengineering+studies.">A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).</li><li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+repopulation+and+preparation+of+rodent+extracellular+matrix+scaffolds+for+renal+tissue+development.">Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).</li><li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system.">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li><li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+systems+and+devices:+State-of-the-art.">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li><li>Schilling, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+an+automatable,+3D+printed+perfusion+device+for+tissue+infusion+and+perfusion+engineering.">Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).</li></ol>

Le protocole proposé utilise la perfusion de SDS à faible concentration pour décellulariser une gamme de lambeaux d’origine porcine. Avec cette procédure, l’épiploon acellulaire, le fascia lata tenseur et les lambeaux radiaux de l’avant-bras peuvent être décellularisés avec succès en utilisant un protocole qui favorise les SDS à faible concentration. Des expériences d’optimisation préliminaires ont déterminé que la SDS à une faible concentration (0,05%) entre 2 jours et 5 jours est capable d’éli...

Les lésions traumatiques et l’ablation de la tumeur peuvent entraîner des défauts des tissus mous importants et complexes. Ces défauts peuvent nuire à la qualité de vie du patient, entraîner une perte de fonction et entraîner une invalidité permanente. Bien que des techniques telles que le transfert de lambeau de tissu autologue aient été couramment pratiquées, les problèmes liés à la disponibilité du lambeau et à la morbidité au site donneur sont des limites majeures 1,2,3. L’allotransplantation composite vascularisée (ACV) est une alternative prometteuse qui transfère les tissus composites, par exemple les muscles, la peau, le système vasculaire, en une seule unité aux receveurs. Cependant, le VCA nécessite une immunosuppression à long terme, ce qui entraîne une toxicité médicamenteuse, des infections opportunistes et des tumeurs malignes 4,5,6.
Les échafaudages acellulaires issus de l’ingénierie tissulaire sont une solution potentielle à ces limitations7. Les échafaudages de tissus acellulaires peuvent être obtenus en utilisant des méthodes de décellularisation, qui éliminent le matériel cellulaire des tissus natifs tout en préservant la microarchitecture sous-jacente de la matrice extracellulaire (ECM). Contrairement à l’utilisation de matériaux synthétiques dans l’ingénierie tissulaire, l’utilisation d’échafaudages d’origine biologique offre un substrat ECM biomimétique qui permet la biocompatibilité et le potentiel de traduction clinique8. Après la décellularisation, la recellularisation subséquente d’échafaudages avec des cellules spécifiques au receveur peut alors générer des tissus vascularisés fonctionnels avec peu ou pas d’immunogénicité 9,10,11. En développant un protocole efficace pour obtenir des tissus acellulaires à l’aide de techniques de décellularisation par perfusion, un large éventail de types de tissus peut être conçu. À son tour, s’appuyer sur cette technique permet l’application à des tissus plus complexes. À ce jour, la décellularisation par perfusion des tissus mous vascularisés a été étudiée à l’aide de tissus vascularisés simples tels qu’un lambeau fasciocutané de pleine épaisseur chez le rongeur12, le porcin 13 et le modèle humain 14, ainsi que le muscle squelettique du porc droit abdominis15. De plus, des tissus vascularisés complexes ont également été décellularisés par perfusion, comme l’ont démontré les modèles d’oreille porcine et humaine 16,17 et les modèles de greffe de visage entierhumain 18.
Ici, le protocole décrit la décellularisation des lambeaux libres vascularisés à l’aide d’échafaudages ECM dérivés biologiquement. Nous présentons la décellularisation de trois lambeaux cliniquement pertinents: 1) l’épiploon, 2) le fascia lata tenseur et 3) l’avant-bras radial, qui sont tous représentatifs des lambeaux de cheval de trait utilisés couramment en chirurgie reconstructive et n’ont pas été examinés auparavant dans des études animales dans le contexte de la décellularisation tissulaire. Ces lambeaux issus de la bioingénierie offrent une plate-forme polyvalente et facilement disponible qui a le potentiel d’applications cliniques pour une utilisation dans le domaine de la réparation et de la reconstruction de grands défauts des tissus mous.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.2 &#181;m pore Acrodisk Filter</td>
			<td >VWR</td>
			<td >CA28143-310</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JF7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 L Polypropylene Carboy</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-62507-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>&#160;LS639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-way Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-30600-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Atropine Sulphate 15 mg/30ml</td>
			<td>Rafter 8 Products</td>
			<td>238481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 20-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 22-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 24-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS, 10X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-415-CL</td>
			<td>&#160;without Ca++/Mg++</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin, 1000 I.U./mL</td>
			<td>Leo Pharma A/S</td>
			<td>453811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine Hydrochloride&#160; 5000 mg/50 ml</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>612316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td>Internal Diameter:&#160; 1.85 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec REGLO 4-Channel Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>78001-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Tubing Cassettes</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-78016-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane 99.9%, 250 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2231929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Lennox</td>
			<td>Bioshop Canada</td>
			<td>LBL406.500</td>
			<td>Sterility testing agar plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Masterflex L/S 16 Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam 50 mg/10 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2242905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopolar Cautery Pencil</td>
			<td>Valleylab</td>
			<td>E2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Buffered Formalin, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#176;11 scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Connector for 1/4&#34; to 1/8&#34; Tube ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Tube 90&#176; Elbow Connectors</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Plugs</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K143</td>
			<td>Male Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Sockets</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K293</td>
			<td>Female Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Punch Biopsy Tool</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>3332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride 40 mEq/20 ml</td>
			<td>Hospira Healthcare Corporation</td>
			<td>37869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine, 10%</td>
			<td>Rougier</td>
			<td>833133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serological Pipet, 2mL</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Snap Lid Airtight Containers</td>
			<td>SnapLock</td>
			<td>142-3941-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical Metal Ligation Clips, Small</td>
			<td >Teleflex</td>
			<td >001200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >BC004R</td>
			<td></td>
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			<td >TruWave Pressure Monitoring Set</td>
			<td >Edwards Lifesciences</td>
			<td >PX260</td>
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		</tr>
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procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor

Les défauts des tissus mous de grand volume entraînent des déficits fonctionnels et peuvent avoir un impact considérable sur la qualité de vie du patient. Bien que la reconstruction chirurgicale puisse être réalisée par transfert de lambeau libre autologue ou allotransplantation composite vascularisée (AVC), de telles méthodes présentent également des inconvénients. Des problèmes tels que la morbidité sur le site donneur et la disponibilité des tissus limitent le transfert de lambeau libre autologue, tandis que l’immunosuppression est une limitation importante de l’ACV. Les tissus modifiés en chirurgie reconstructive utilisant des méthodes de décellularisation / recellularisation représentent une solution possible. Les tissus décellularisés sont générés à l’aide de méthodes qui éliminent le matériel cellulaire natif tout en préservant la microarchitecture sous-jacente de la matrice extracellulaire (ECM). Ces échafaudages acellulaires peuvent ensuite être recellularisés avec des cellules spécifiques au receveur.
Ce protocole détaille les méthodes d’approvisionnement et de décellularisation utilisées pour réaliser des échafaudages acellulaires dans un modèle porcin. En outre, il fournit également une description de la conception et de la configuration du bioréacteur de perfusion. Les lambeaux comprennent l’épiploon porcin, le fascia lata tenseur et l’avant-bras radial. La décellularisation est réalisée par perfusion ex vivo de détergent à faible concentration de dodécylsulfate de sodium (SDS), suivie d’un traitement enzymatique par la DNase et d’une stérilisation à l’acide peracétique dans un bioréacteur de perfusion personnalisé.
Une décellularisation tissulaire réussie se caractérise par un aspect blanc-opaque des lambeaux macroscopiquement. Les lambeaux acellulaires montrent l’absence de noyaux sur la coloration histologique et une réduction significative de la teneur en ADN. Ce protocole peut être utilisé efficacement pour générer des échafaudages de tissus mous décellularisés avec une ECM préservée et une microarchitecture vasculaire. De tels échafaudages peuvent être utilisés dans des études de recellularisation ultérieures et ont le potentiel d’une traduction clinique en chirurgie reconstructive.

Ce protocole de décellularisation des lambeaux porcins vascularisés repose sur la perfusion d’un détergent à base ionique, SDS, à travers le système vasculaire du volet dans un bioréacteur de perfusion personnalisé. Avant la décellularisation, trois lambeaux vascularisés dans un modèle porcin ont été achetés et canulés en fonction de leurs principaux vaisseaux d’alimentation. Les volets ont été immédiatement rincés après l’approvisionnement afin de maintenir un système vasculaire perfusable bre...

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Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Le protocole décrit l’obtention chirurgicale et la décellularisation ultérieure des lambeaux porcins vascularisés par perfusion du détergent au dodécylsulfate de sodium à travers le système vasculaire du lambeau dans un bioréacteur de perfusion personnalisé.

Acquisition et perfusion-décellularisation de lambeaux vascularisés porcins dans un bioréacteur de perfusion personnalisé

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Cette méthode décrit l’obtention chirurgicale de trois lambeaux porcins vascularisés et leur décellularisation subséquente par perfusion. Cette méthode peut aider les efforts de régénération des lambeaux porcins en utilisant une approche de décellularisation et de recellularisation des tissus. Le principal avantage de cette technique est sa polyvalence pour réaliser la décellularisation de la profusion à travers une variété de lambeaux porcins vascularisés dans une configuration de bioréacteur simple à assembler.La technique décrite ici peut être largement appliquée à d’autres lambeaux vascularisés en tant que solution potentielle d’ingénierie tissulaire utilisant des lambeaux porcins en chirurgie reconstructive. Pour commencer, fabriquez un tube d’entrée et de sortie en mesurant environ 50 centimètres de tube en silicone revêtu de platine LS16. Connectez une extrémité à un tube de pompe jaune à 3 arrêts et l’autre à une pipette sérologique stérile de 2 millilitres pour transporter le perfusat des réservoirs de détergent dans la chambre du bioréacteur.Autoclaver la chambre et les tubes dans un emballage stérile emballé individuellement. Pour l’obtention du lambeau omental, placez un porc Yorkshire anesthésié âgé de 12 semaines en décubitus dorsal, puis préparez l’abdomen de la manière stérile habituelle. Effectuer une laparotomie xipho-ombilicale pour entrer dans l’abdomen et mobiliser la céphalade de l’estomac, et placer l’épiploon dans le champ opératoire.En commençant par l’aspect gauche de la plus grande courbure, où l’artère gastroépiploïque gauche rejoint l’artère splénique, squelettiser l’artère gastroépiploïque gauche et la veine à l’aide de ciseaux de ténotomie Stevens droits. Ensuite, ligaturez et divisez les deux séparément à l’aide de liens chirurgicaux ou de clips. Procédez le long de la plus grande courbure de l’estomac de gauche à droite pour ligaturer et diviser les branches vasculaires courtes provenant de l’épiploon, fournissant la plus grande courbure de l’estomac.Poursuivre la mobilisation du grand épiploon jusqu’à ce que la jonction des vaisseaux gastroépiploïques droits et de l’artère gastroduodénale soit rencontrée. Ensuite, ligaturez et divisez l’artère gastro-épiploïque droite et la veine pour libérer le lambeau omental et permettre la canulation du lambeau plus tard. Pour l’obtention du volet tenseur fascia lata, placer le porc en position de décubitus latéral.Marquez la limite du lambeau intérieur de l’épine iliaque antérieure supérieure, ou ASIS, vers la rotule latérale, et une limite postérieure d’environ 8 à 10 centimètres caudale. Utilisez un scalpel pour faire une incision nette à la marge distale à la rotule. Approfondissez l’incision à travers les tissus sous-cutanés pour atteindre le fascia recouvrant le droit fémoris, et continuez les incisions vers le SIAS le long des limites marquées.Pour isoler le lambeau fascial seul, retirez le composant cutané sus-jacent de la couche de fascia sous-jacente. Ensuite, ligaturer ou cautériser les petits vaisseaux perforateurs à la peau. Revenez au bord distal du volet et incisez le fascia profond.Mobiliser le fascia du muscle vastus lateral sous-jacent vers l’ASIS. Après avoir tracé le pédicule vers les vaisseaux fémoraux profonds, squelettiser l’artère fémorale circonflexe latérale et la veine alimentant le volet fascial. Ensuite, ligaturer et diviser les vaisseaux du volet à proximité, où ils rejoignent les vaisseaux fémoraux profonds et permettent une canulation ultérieure.Pour l’obtention d’un rabat radial d’avant-bras, marquez un carré de 3 centimètres sur 3 sur la face radiale d’un avant-bras de porc étendu. Tracez une ligne entre le point médian de la marge du lambeau proximal et la fosse antécubitale pour indiquer l’évolution approximative du pédicule de l’artère radiale. Confirmez le parcours artériel avec palpation.Ensuite, incisez la peau à l’aide d’un scalpel à l’aspect distal avec une profondeur jusqu’au fascia antébrachial. Disséquer contondant avec des ciseaux de ténotomie jusqu’à ce que l’artère radiale distale et sa veine comitante soient rencontrées. Ensuite, ligaturez et divisez l’artère et les veines avec des attaches chirurgicales ou des clips.Continuez les incisions cutanées sur les marges radiales et ulnaires du carré cutané marqué. Ensuite, mobilisez le lambeau de l’os radial sous-jacent avec une lame chirurgicale ou cautérisation, en allant d’une direction cubitale à une direction radiale tout en soulevant le lambeau cutané proximale vers la fosse antécubitale. À l’aide de ciseaux de ténotomie, squelettiser l’artère radiale et la veine comitantes proximale à proximité de la fosse antécubitale, où elles rejoignent respectivement l’artère brachiale et les veines.Disséquer les vaisseaux des tissus fibro-adipeux environnants pour isoler le pédicule vasculaire. Ensuite, ligaturez et divisez l’artère et la veine séparément pour libérer le lambeau radial de l’avant-bras. Ensuite, canulez les vaisseaux du pédicule avec un angiocathéter de calibre 20 à 24 fixé avec des attaches en soie 3-0.Rincer la solution saline héparinée dans la canule artérielle du volet jusqu’à ce qu’un écoulement veineux clair soit observé. Lorsque vous travaillez dans une armoire de biosécurité à flux laminaire, placez les volets dans la chambre à tissu du bioréacteur. Tube d’entrée de bœuf avec solution saline héparinée stérile pour éliminer l’air résiduel et disposer les volets pour permettre la connexion entre la canule artérielle à volet et le connecteur Luer mâle.Utilisez ensuite des hémostatiques stériles pour visser la canule artérielle sur le connecteur. Rincez ensuite la solution saline héparinée à travers le robinet d’arrêt pour vérifier que la connexion luer est exempte de fuites et que les flops peuvent être perfusés avec des signes d’écoulement veineux. Après avoir fermé le couvercle de la chambre de tissu, connectez le tube d’entrée avec un tube de pompe jaune à 3 arrêts au robinet d’arrêt d’entrée de la chambre à tissu.Fixez également un transducteur de capteur de pression en ligne au robinet d’arrêt 3 voies d’entrée pour la surveillance de la pression de perfusion. Ensuite, allumez la pompe péristaltique d’entrée et sur l’écran initial, passez à la troisième languette à l’aide de la flèche pour régler l’ID du tube sur 1,85 millimètre. Définissez ensuite le taux de perfusion à partir du deuxième onglet.Le débit d’entrée comme mode de livraison est réglé sur 2 millilitres par minute. Assurez-vous que la direction du flux est correcte telle qu’elle est affichée à l’écran. Chargez le tube de pompe à 3 arrêts sur la pompe péristaltique avec une cassette compatible.Réglez le réglage de la pompe de sortie à un débit de 4 millilitres par minute. Connectez le tube de sortie avec un tube de pompe jaune à 3 arrêts au robinet d’arrêt de sortie de la chambre à tissu. Ensuite, chargez le tube de pompe à 3 arrêts sur la pompe péristaltique et démarrez le débit des deux pompes en appuyant sur le bouton d’alimentation de chaque pompe.Commencer la décellularisation par perfusion des lambeaux avec une solution saline héparinée dans la chambre tissulaire pendant 15 minutes pour éliminer les caillots sanguins retenus. Une fois terminé, remplacez la solution saline résiduelle par 500 millilitres de solution de décellularisation de dodécylsulfate de sodium, ou SDS, pour immerger le volet. Ensuite, transférez le tube d’entrée dans la solution SDS et abondez le tissu.Après la décellularisation de la FDS, aspirer la FDS restante avant de faire passer le lambeau avec du PBS pendant une journée. Après la décellularisation de la perfusion SDS, perfuser séquentiellement les volets dans la solution d’ADN pendant deux heures, puis dans le PBS pendant une journée, puis transférer le tube d’entrée dans de l’acide peracétique et de l’éthanol dans de l’eau distillée pour stériliser les lambeaux en perfusant pendant trois heures. Une fois cela fait, retirez les lambeaux de manière aseptique et plongez-les dans deux lavages de PBS contenant 1% d’antibiotiques antimycotiques pendant 15 minutes chacun.Conservez les lambeaux à 4 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la recellularisation. Utilisez un outil de biopsie à l’emporte-pièce de 3 à 10 millimètres pour obtenir des échantillons de tissus pour l’évaluation des lambeaux décellularisés. Les lambeaux décellularisés isolés rincés sous contrôle manuel ont mis en évidence des signes d’écoulement de la canule veineuse à drainage libre de l’épiploon, du fascia lata tenseur et du lambeau radial de l’avant-bras.La morphologie grossière de l’épiploon natif, du fascia lata tenseur et des lambeaux radiaux de l’avant-bras est apparue de couleur rose immédiatement après l’obtention. En comparaison, les tissus décellularisés étaient d’apparence blanche ou opaque. L’examen histologique des tissus natifs avec de l’hématoxyline et de l’éosine a montré la présence de noyaux bleus.Dans les lambeaux décellularisés, la coloration histologique a révélé une perte de matériel cellulaire sans coloration nucléaire bleue, indiquant un échafaudage de tissu acellulaire. Une quantification supplémentaire du contenu de l’ADN a montré une diminution significative de l’ADN dans les échafaudages acellulaires par rapport aux tissus natifs. La considération la plus importante est une technique chirurgicale utilisée lors de l’approvisionnement, en prenant soin d’éviter d’endommager le pédicule du lambeau afin de permettre une décellularisation ultérieure de la perfusion.Après la décellularisation de la perfusion, les lambeaux résultants peuvent être recellularisés avec des populations cellulaires spécifiques aux tissus afin de régénérer les compartiments tissulaires natifs.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Procédure de décellularisation de coeur de porc par perfusion coronaire rétrograde

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Recherche

Bio-ingénierie

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Conception d&#39;un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l&#39;ingénierie tissulaire

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fonctionnement d&#39;un bioréacteur de laboratoire

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Conçu vascularisé Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidique Bioprinting génie vascularisé tissus et organoïdes

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Un modèle fiable de lambeau fascio-cutané porcin pour les études de bio-ingénierie des allogreffes composites vascularisées

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

A Friction Testing-Bioreactor Device for Study of Synovial Joint Biomechanics, Mechanobiology, and Physical Regulation

Un dispositif de bioréacteur d’essai de friction pour l’étude de la biomécanique des articulations synoviales, de la mécanobiologie et de la régulation physique

In primary osteoarthritis (OA), normal 'wear and tear' associated with aging inhibits the ability of cartilage to sustain its load-bearing and lubrication ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Fabrication de volets vasculaires artificiels à l’aide de technologies d’impression 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Bioréacteur de perfusion multi-flux intégré au fractionnement de sortie pour la culture cellulaire dynamique

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...