Name: procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor at JoVE.com

Alle Verfahren mit Tiermotiven wurden vom University Health Network Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und werden in Übereinstimmung mit dem Protokoll und den Verfahren des University Health Network Animal Resource Centre und den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt. Für alle Experimente wurden fünf Yorkshire-Schweine (35-50 kg; Alter ca. 12 Wochen alt) verwendet.
1. Herstellung von Perfusionsbioreaktoren
<ol><li>Siehe ...

<ol>
	<li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity:+A+Prospective+Study.">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li><li>Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+after+pedicled+or+free+TRAM+flap+surgery:+A+prospective+and+objective+study.">Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+free-style+flaps:+Risk+analysis+of+complications.">A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 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S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. 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H., Panje, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+for+multiple+musculocutaneous+flaps.">A porcine model for multiple musculocutaneous flaps.</a> The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).</li><li>Khachatryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap.">Radial Forearm Flap.</a> Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).</li><li>Hammouda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+nanostructure+of+SDS+micelles+in+water.">Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).</li><li>Qu, J., Van Hogezand, R. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+tissue+decellularization+used+for+preparation+of+biologic+scaffolds+and+in+vivo+relevance.">Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance.</a> Methods. 84, 25-34 (2015).</li><li>Mendibil, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+decellularization+methods:+Rationale+and+strategies+to+achieve+regenerative+compounds.">Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).</li><li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds:+A+systematic+review.">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).</li><li>Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+tissues+by+perfusion+decellularization/recellularization:+Review.">Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.</a> Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).</li><li>Adil, A., Xu, M., Haykal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recellularization+of+bioengineered+scaffolds+for+vascular+composite+allotransplantation.">Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation.</a> Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).</li><li>Phelps, E. A., Garc&#237;a, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+more+than+a+cell:+Vascularization+strategies+in+tissue+engineering.">Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).</li><li>Pozzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+porcine+fascio-cutaneous+flap+model+for+vascularized+composite+allografts+bioengineering+studies.">A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).</li><li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+repopulation+and+preparation+of+rodent+extracellular+matrix+scaffolds+for+renal+tissue+development.">Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).</li><li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system.">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li><li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+systems+and+devices:+State-of-the-art.">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li><li>Schilling, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+an+automatable,+3D+printed+perfusion+device+for+tissue+infusion+and+perfusion+engineering.">Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).</li></ol>

Das vorgeschlagene Protokoll verwendet die Perfusion von SDS mit niedriger Konzentration, um eine Reihe von Schweineklappen zu dezellularisieren. Mit diesem Verfahren können azelluläres Omentum, Tensor fascia lata und radiale Unterarmlappen erfolgreich mit einem Protokoll dezellularisiert werden, das SDS mit niedriger Konzentration begünstigt. Vorläufige Optimierungsexperimente haben ergeben, dass SDS bei einer niedrigen Konzentration (0,05%) zwischen 2 Tagen und 5 Tagen in der Lage ist, Zellmaterial für das Omentum...

Traumata und Tumorentfernungen können zu großen und komplexen Weichteildefekten führen. Diese Defekte können die Lebensqualität der Patienten beeinträchtigen, zu Funktionsverlust führen und zu dauerhaften Behinderungen führen. Während Techniken wie der Transfer autologer Gewebelappen häufig praktiziert wurden, sind Probleme mit der Verfügbarkeit von Lappen und der Morbidität der Spenderstelle wesentliche Einschränkungen 1,2,3. Die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation (VCA) ist eine vielversprechende Alternative, die zusammengesetzte Gewebe, z. B. Muskeln, Haut, Gefäße, als eine Einheit an die Empfänger überträgt. VCA erfordert jedoch eine langfristige Immunsuppression, die zu Arzneimitteltoxizität, opportunistischen Infektionen und Malignomen führt 4,5,6.
Tissue-engineered azelluläre Gerüste sind eine mögliche Lösung für diese Einschränkungen7. Azelluläre Gewebegerüste können mit Dezellularisierungsmethoden erhalten werden, die zelluläres Material aus nativen Geweben entfernen und gleichzeitig die zugrunde liegende extrazelluläre Matrix (ECM) -Mikroarchitektur erhalten. Im Gegensatz zur Verwendung synthetischer Materialien im Tissue Engineering bietet die Verwendung von biologisch gewonnenen Scaffolds ein biomimetisches ECM-Substrat, das Biokompatibilität und das Potenzial für die klinische Translation ermöglicht8. Nach der Dezellularisierung kann die anschließende Rezellularisierung von Gerüsten mit empfängerspezifischen Zellen dann funktionelle, vaskularisierte Gewebe mit wenig bis gar keiner Immunogenität erzeugen 9,10,11. Durch die Entwicklung eines effektiven Protokolls zur Gewinnung von azellulärem Gewebe mithilfe von Perfusionsdezellularisierungstechniken kann eine breite Palette von Gewebetypen entwickelt werden. Aufbauend auf dieser Technik wiederum ermöglicht die Anwendung auf komplexere Gewebe. Bisher wurde die Perfusionsdezellularisierung von vaskularisierten Weichteilen unter Verwendung einfacher vaskularisierter Gewebe wie einem fasziokutanen Lappen voller Dicke in Nagetier 12, Schweine 13 und Humanmodellen14 sowie Schweinerectus abdominis Skelettmuskel15 untersucht. Darüber hinaus wurden komplexe vaskularisierte Gewebe auch perfusionsdezellularisiert, wie in Schweine- und menschlichen Ohrmodellen16,17 und menschlichen Vollgesichtstransplantatmodellen18 gezeigt wurde.
Hier beschreibt das Protokoll die Dezellularisierung von vaskularisierten freien Lappen unter Verwendung biologisch abgeleiteter ECM-Gerüste. Wir stellen die Dezellularisierung von drei klinisch relevanten Klappen vor: 1) das Omentum, 2) die Tensorfaszie lata und 3) den radialen Unterarm, die alle repräsentativ für Arbeitspferdeklappen sind, die routinemäßig in der rekonstruktiven Chirurgie verwendet werden und bisher nicht in Tierversuchen im Rahmen der Gewebedezellularisierung untersucht wurden. Diese biotechnologisch hergestellten Klappen bieten eine vielseitige und leicht verfügbare Plattform, die das Potenzial für klinische Anwendungen im Bereich der Reparatur und Rekonstruktion großer Weichteildefekte bietet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.2 &#181;m pore Acrodisk Filter</td>
			<td >VWR</td>
			<td >CA28143-310</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JF7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 L Polypropylene Carboy</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-62507-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>&#160;LS639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-way Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-30600-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Atropine Sulphate 15 mg/30ml</td>
			<td>Rafter 8 Products</td>
			<td>238481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 20-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 22-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 24-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS, 10X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-415-CL</td>
			<td>&#160;without Ca++/Mg++</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin, 1000 I.U./mL</td>
			<td>Leo Pharma A/S</td>
			<td>453811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine Hydrochloride&#160; 5000 mg/50 ml</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>612316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td>Internal Diameter:&#160; 1.85 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec REGLO 4-Channel Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>78001-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Tubing Cassettes</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-78016-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane 99.9%, 250 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2231929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Lennox</td>
			<td>Bioshop Canada</td>
			<td>LBL406.500</td>
			<td>Sterility testing agar plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Masterflex L/S 16 Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam 50 mg/10 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2242905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopolar Cautery Pencil</td>
			<td>Valleylab</td>
			<td>E2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Buffered Formalin, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#176;11 scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Connector for 1/4&#34; to 1/8&#34; Tube ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Tube 90&#176; Elbow Connectors</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Plugs</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K143</td>
			<td>Male Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Sockets</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K293</td>
			<td>Female Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Punch Biopsy Tool</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>3332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride 40 mEq/20 ml</td>
			<td>Hospira Healthcare Corporation</td>
			<td>37869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine, 10%</td>
			<td>Rougier</td>
			<td>833133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serological Pipet, 2mL</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Snap Lid Airtight Containers</td>
			<td>SnapLock</td>
			<td>142-3941-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical Metal Ligation Clips, Small</td>
			<td >Teleflex</td>
			<td >001200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >BC004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TruWave Pressure Monitoring Set</td>
			<td >Edwards Lifesciences</td>
			<td >PX260</td>
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procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor

Großvolumige Weichteildefekte führen zu funktionellen Defiziten und können die Lebensqualität des Patienten stark beeinträchtigen. Obwohl die chirurgische Rekonstruktion mittels autologem freien Lappentransfer oder vaskularisierter Kompositallotransplantation (VCA) durchgeführt werden kann, haben solche Methoden auch Nachteile. Probleme wie Morbidität an der Spenderstelle und Gewebeverfügbarkeit begrenzen den autologen freien Lappentransfer, während die Immunsuppression eine signifikante Einschränkung der VCA darstellt. Technisch hergestellte Gewebe in der rekonstruktiven Chirurgie mit Dezellularisierungs-/Rezellularisierungsmethoden stellen eine mögliche Lösung dar. Dezellularisiertes Gewebe wird mit Methoden erzeugt, die natives Zellmaterial entfernen und gleichzeitig die zugrunde liegende extrazelluläre Matrix (ECM) -Mikroarchitektur erhalten. Diese azellulären Gerüste können dann anschließend mit empfängerspezifischen Zellen rezellularisiert werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Beschaffungs- und Dezellularisierungsmethoden, die verwendet werden, um azelluläre Gerüste in einem Schweinemodell zu erhalten. Darüber hinaus enthält es auch eine Beschreibung des Perfusionsbioreaktordesigns und -aufbaus. Die Lappen umfassen das porcine Omentum, den Tensor fascia lata und den radialen Unterarm. Die Dezellularisierung erfolgt durch Ex-vivo-Perfusion von Natriumdodecylsulfat (SDS)-Detergens mit niedriger Konzentration, gefolgt von einer DNase-Enzymbehandlung und einer Peressigsäuresterilisation in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor.
Eine erfolgreiche Gewebedezellularisierung zeichnet sich makroskopisch durch ein weiß-opakes Aussehen der Lappen aus. Azelluläre Lappen zeigen das Fehlen von Kernen bei histologischer Färbung und eine signifikante Verringerung des DNA-Gehalts. Dieses Protokoll kann effizient verwendet werden, um dezellularisierte Weichteilgerüste mit erhaltener ECM und vaskulärer Mikroarchitektur zu erzeugen. Solche Gerüste können in nachfolgenden Rezellularisierungsstudien verwendet werden und haben das Potenzial für eine klinische Translation in der rekonstruktiven Chirurgie.

Dieses Protokoll zur Dezellularisierung vaskularisierter Schweinelappen beruht auf der Durchblutung eines ionenbasierten Waschmittels, SDS, durch das Klappengefäßsystem in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor. Vor der Dezellularisierung wurden drei vaskularisierte Lappen in einem Schweinemodell beschafft und entsprechend ihrer Hauptversorgungsgefäße kanüliert. Die Klappen wurden sofort nach der Beschaffung gespült, um ein patentiertes, durchlässiges Gefäßsystem aufrechtzuerhalten, das eine erfolgreiche ...

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Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Das Protokoll beschreibt die chirurgische Beschaffung und anschließende Dezellularisierung von vaskularisierten Schweinelappen durch die Perfusion von Natriumdodecylsulfat-Waschmittel durch das Lappengefäßsystem in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor.

Beschaffung und Perfusions-Dezellularisierung von porcinen vaskularisierten Klappen in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Diese Methode beschreibt die chirurgische Beschaffung von drei vaskularisierten Schweinelappen und deren anschließende Perfusionsdezellularisierung. Diese Methode kann die Bemühungen zur Regeneration von Schweinelappen mithilfe eines Gewebedezellularisierungs- und Rezellularisierungsansatzes unterstützen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Vielseitigkeit, um eine Profusionsdezellularisierung über eine Vielzahl von vaskularisierten Schweineklappen in einem einfach zu montierenden Bioreaktoraufbau zu erreichen.Die hier beschriebene Technik kann breit auf andere vaskularisierte Lappen als mögliche Tissue-Engineering-Lösung unter Verwendung von Schweinelappen in der rekonstruktiven Chirurgie angewendet werden. Um zu beginnen, machen Sie einen Zu- und Abflussschlauch, indem Sie etwa 50 Zentimeter LS16 platinbeschichtete Silikonschläuche messen. Verbinden Sie ein Ende mit einem gelben 3-Stopp-Pumpenschlauch und das andere mit einer sterilen 2-Milliliter-serologischen Pipette, um Perfusat aus den Waschmittelreservoirs in die Bioreaktorkammer zu transportieren.Autoklavieren Sie die Kammer und die Schläuche in einzeln verpackten sterilen Verpackungen. Für die omentale Lappenbeschaffung legen Sie ein 12 Wochen altes, betäubtes Yorkshire-Schwein in Rückenlage und bereiten dann den Bauch in der üblichen sterilen Weise vor. Führen Sie eine Xipho-Nabel-Laparotomie durch, um in den Bauch einzudringen und den Magenkopfschmerz zu mobilisieren, und legen Sie das Omentum in das Operationsfeld.Beginnend am linken Aspekt der größeren Krümmung, wo die linke gastroepiploische Arterie mit der Milzarterie verbunden ist, skelettieren Sie die linke gastroepiploische Arterie und Vene mit einer geraden Stevens-Tenotomieschere. Dann ligieren und teilen Sie beide separat mit chirurgischen Bindungen oder Clips. Gehen Sie entlang der größeren Krümmung des Magens von links nach rechts, um die kurzen Gefäßäste, die aus dem Omentum hervorgehen, zu ligieren und zu teilen und die größere Krümmung des Magens zu versorgen.Setzen Sie die Mobilisierung des größeren Omentums fort, bis die Verbindung der rechten gastroepiploischen Gefäße und der Arteria gastroduodenal angetroffen wird. Dann ligieren und teilen Sie die rechte gastroepiploische Arterie und Vene, um den omentalen Lappen zu befreien und später eine Lappenkanülierung zu ermöglichen. Für die Beschaffung von Tensorfaszien lata Klappen das Schwein in die seitliche Dekubitusposition bringen.Markieren Sie die innere Lappengrenze von der vorderen oberen Beckenwirbelsäule oder ASIS in Richtung der lateralen Patella und eine hintere Grenze etwa 8 bis 10 Zentimeter kaudal. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen scharfen Schnitt am distalen Rand an der Patella zu machen. Vertiefen Sie den Schnitt durch das Unterhautgewebe, um die Faszie über dem Rectus femoris zu erreichen, und setzen Sie die Einschnitte in Richtung ASIS entlang der markierten Grenzen fort.Um den Fasziallappen allein zu isolieren, entfernen Sie die darüber liegende Hautkomponente aus der darunter liegenden Faszienschicht. Dann ligieren oder kauterisieren Sie kleine Perforatorgefäße an die Haut. Kehren Sie zum distalen Rand der Klappe zurück und schneiden Sie die tiefe Faszie ein.Mobilisieren Sie die Faszie vom darunter liegenden Musculus vastus lateralis in Richtung ASIS. Nachdem Sie den Stiel in Richtung der tiefen Femurgefäße verfolgt haben, skelettieren Sie die Arteria circumflexa circumflexa lateralis und die Vene, die den Fasziallappen versorgen. Dann ligieren und teilen Sie die Lappengefäße in der Nähe, wo sie sich mit den tiefen Femurgefäßen verbinden und eine spätere Kanülierung ermöglichen.Für die Beschaffung von radialen Unterarmklappen markieren Sie ein Quadrat von 3 x 3 Zentimetern auf dem radialen Aspekt eines verlängerten Schweineunterarms. Zeichne eine Linie zwischen dem Mittelpunkt des proximalen Lappenrandes und der Fossa antecubitalis, um den ungefähren Verlauf des radialen Arterienstiels zu bezeichnen. Bestätigen Sie den arteriellen Verlauf mit Palpation.Als nächstes schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell am distalen Aspekt mit einer Tiefe bis zur vorbrachialen Faszie. Stumpf mit einer Tenotomieschere sezieren, bis man auf die Arteria radialis distal und ihre Vena comitantes trifft. Dann ligieren und teilen Sie die Arterie und Venen mit chirurgischen Verbindungen oder Clips.Setzen Sie die Hautschnitte am radialen und ulnaren Rand des markierten Hautquadrats fort. Mobilisieren Sie dann den Lappen vom darunter liegenden radialen Knochen mit einer chirurgischen Klinge oder Kauterisation, wobei Sie von einer ulnaren in radiale Richtung fortfahren, während Sie den Hautlappen proximal in Richtung der antekubitalen Fossa anheben. Mit einer Tenotomieschere skelettieren Sie die Arteria radialis und die Vena comitantes proximal an der Fossa antecubitalis, wo sie mit der Arteria brachialis bzw. den Venen verbunden sind.Sezieren Sie die Gefäße aus dem umgebenden Fibrofettgewebe, um den Gefäßstiel zu isolieren. Dann ligieren und teilen Sie die Arterie und Vene separat, um den radialen Unterarmlappen freizugeben. Als nächstes kanülieren Sie die Pedikelgefäße mit 20 bis 24 Gauge Angiokatheter, die mit 3-0 Seidenbinden gesichert sind.Spülen Sie die heparinisierte Kochsalzlösung in die arterielle Kanüle des Lappens, bis ein deutlicher venöser Abfluss beobachtet wird. Während Sie in einer Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank arbeiten, legen Sie Klappen in die Bioreaktor-Gewebekammer. Prime Inflow Schlauch mit steriler heparinisierter Kochsalzlösung, um Restluft zu entfernen und Klappen anzuordnen, um eine Verbindung zwischen der Klappenarterienkanüle und dem männlichen Luer-Anschluss zu ermöglichen.Verwenden Sie dann sterile Hämostaten, um die arterielle Kanüle auf den Konnektor zu schrauben. Spülen Sie dann die heparinisierte Kochsalzlösung durch den Absperrhahn, um zu überprüfen, ob die Luer-Verbindung keine Lecks aufweist und ob die Flops mit Anzeichen eines venösen Abflusses durchblutet werden können. Nach dem Schließen des Deckels der Gewebekammer verbinden Sie den Zulaufschlauch mit einem gelben 3-Stufen-Pumpenschlauch mit dem Zulaufhahn der Gewebekammer.Befestigen Sie außerdem einen Inline-Drucksensoraufnehmer am 3-Wege-Absperrhahn für den Zufluss, um den Perfusionsdruck zu überwachen. Schalten Sie anschließend die Zulauf-Schlauchpumpe ein und wechseln Sie auf dem Startbildschirm mit dem Pfeil zur dritten Registerkarte, um die Schlauch-ID auf 1,85 Millimeter einzustellen. Stellen Sie dann die Perfusionsrate über die zweite Registerkarte ein.Die Eingangsrate als Lieferart ist auf 2 Milliliter pro Minute eingestellt. Stellen Sie sicher, dass die Fließrichtung korrekt ist, wie auf dem Bildschirm angezeigt. Laden Sie den 3-Stufen-Pumpenschlauch mit einer kompatiblen Kassette in die Schlauchpumpe.Stellen Sie die Einstellung der Ausströmpumpe auf eine Rate von 4 Milliliter pro Minute ein. Verbinden Sie den Auslaufschlauch mit einem gelben 3-Stufen-Pumpenschlauch mit dem Abflusshahn der Gewebekammer. Laden Sie dann den 3-Stufen-Pumpenschlauch in die Schlauchpumpe und starten Sie den Durchfluss für beide Pumpen, indem Sie den Netzschalter an jeder Pumpe drücken.Beginnen Sie die Perfusionsdezellularisierung von Lappen mit heparinisierter Kochsalzlösung in der Gewebekammer für 15 Minuten, um alle zurückgehaltenen Blutgerinnsel zu entfernen. Ersetzen Sie nach Abschluss die restliche Kochsalzlösung durch 500 Milliliter Natriumdodecylsulfat oder SDS, Dezellularisierungslösung, um die Klappe einzutauchen. Als nächstes übertragen Sie den Zulaufschlauch in die SDS-Lösung und füllen das Gewebe.Nach der SDS-Dezellularisierung saugen Sie das verbleibende SDS ab, bevor Sie die Klappe einen Tag lang mit PBS perfundiert. Nach der SDS-Perfusionsdezellularisierung die Klappen nacheinander zwei Stunden lang in DNA-Lösung und dann in PBS für einen Tag perfundieren, gefolgt von der Übertragung des Zuflussschlauchs in Peressigsäure und Ethanol in destilliertem Wasser, um die Klappen durch Perfusion für drei Stunden zu sterilisieren. Sobald Sie fertig sind, entfernen Sie die Klappen aseptisch und tauchen Sie sie für jeweils 15 Minuten in zwei PBS-Waschgänge mit 1% Antibiotika Antimykotika ein.Lagern Sie die Klappen bei 4 Grad Celsius, bis sie für die Rezellularisierung bereit sind. Verwenden Sie ein 3 bis 10 Millimeter Stanzbiopsiewerkzeug, um Gewebeproben zur Beurteilung von dezellularisierten Klappen zu erhalten. Die isolierten dezellularisierten Lappen, die unter manueller Kontrolle gespült wurden, zeigten Hinweise auf einen Abfluss aus der frei entleerenden Venenkanüle von Omentum, Tensor fascia lata und radialem Unterarmlappen.Die grobe Morphologie des nativen Omentums, der Tensorfaszie lata und der radialen Unterarmlappen erschien unmittelbar nach der Beschaffung rosafarben. Im Vergleich dazu waren dezellularisierte Gewebe charakteristisch weiß oder undurchsichtig im Aussehen. Die histologische Untersuchung von nativen Geweben mit Hämatoxylin und Eosin zeigte das Vorhandensein von blauen Kernen.In dezellularisierten Klappen zeigte die histologische Färbung den Verlust von Zellmaterial ohne blaue Kernfärbung, was auf ein azelluläres Gewebegerüst hinweist. Eine zusätzliche Quantifizierung des DNA-Gehalts zeigte eine signifikante Abnahme der DNA in azellulären Gerüsten im Vergleich zu nativen Geweben. Die wichtigste Überlegung ist eine chirurgische Technik, die während der Beschaffung verwendet wird, um Schäden am Lappenstiel zu vermeiden, um eine spätere Perfusionsdezellularisierung zu ermöglichen.Nach der Perfusionsdezellularisierung können die resultierenden Lappen mit gewebespezifischen Zellpopulationen rezellularisiert werden, um die nativen Gewebekompartimente zu regenerieren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Entwurf eines Biaxiale Mechanische Belastung Bioreaktor für Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Betrieb einer Tischbioreaktor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Engineered Vaskularisierte Muskellappen

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Imaging-geführter Bioreaktor zur Erzeugung von biotechnologisch hergestelltem Atemwegsgewebe

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Ein zuverlässiges schweinisches Faszien-Hautlappenmodell für vaskularisierte Komposit-Allografts Bioengineering-Studien

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

A Friction Testing-Bioreactor Device for Study of Synovial Joint Biomechanics, Mechanobiology, and Physical Regulation

Ein Reibungsprüf-Bioreaktorgerät zur Untersuchung der Synovialgelenksbiomechanik, Mechanobiologie und physikalischen Regulation

In primary osteoarthritis (OA), normal 'wear and tear' associated with aging inhibits the ability of cartilage to sustain its load-bearing and lubrication ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Herstellung von technischen Gefäßklappen mit 3D-Drucktechnologien

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Multi-Stream-Perfusionsbioreaktor integriert mit Auslassfraktionierung für dynamische Zellkultur

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...