Name: procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor at JoVE.com

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della rete sanitaria universitaria (IACUC) e vengono eseguite in conformità con il protocollo e le procedure del Centro risorse animali della rete sanitaria universitaria e le linee guida del Consiglio canadese per la cura degli animali. Cinque maiali dello Yorkshire (35-50 kg; età circa 12 settimane) sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti.
1. Fabbricazione di bior...

<ol>
	<li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity:+A+Prospective+Study.">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li><li>Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+after+pedicled+or+free+TRAM+flap+surgery:+A+prospective+and+objective+study.">Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+free-style+flaps:+Risk+analysis+of+complications.">A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).</li><li>Issa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allograft-specific+characteristics+of+immune+responses.">Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses.</a> Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).</li><li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration.">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li><li>Iske, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+tissue+allotransplantation:+Opportunities+and+challenges.">Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges.</a> Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).</li><li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine.">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).</li><li>Colazo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applied+bioengineering+in+tissue+reconstruction,+replacement,+and+regeneration.">Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+in+tissue+engineering.">Vascularization in tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+skin/adipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps.">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li><li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+bioengineered+skin+flap+scaffold+with+a+perfusable+vascular+pedicle.">Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle.</a> Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).</li><li>Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+large-volume+human-derived+adipose+acellular+allogenic+flap+by+perfusion+decellularization.">Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+skeletal+muscle+as+a+three-dimensional+scaffold+with+a+vascular+network+template.">Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template.</a> Biomaterials. 89, 114-126 (2016).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+the+porcine+ear+generates+a+biocompatible,+nonimmunogenic+extracellular+matrix+platform+for+face+subunit+bioengineering.">Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering.</a> Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularization+of+human+ear+grafts+enables+ECM-based+scaffolds+for+auricular+vascularized+composite+tissue+engineering.">Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+a+human+face+graft:+The+matrix+of+identity.">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li><li>Haughey, B. H., Panje, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+for+multiple+musculocutaneous+flaps.">A porcine model for multiple musculocutaneous flaps.</a> The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).</li><li>Khachatryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap.">Radial Forearm Flap.</a> Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).</li><li>Hammouda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+nanostructure+of+SDS+micelles+in+water.">Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).</li><li>Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+a+fasciocutaneous+flap+for+use+as+a+perfusable+scaffold.">Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold.</a> Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).</li><li>Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+tissue+decellularization+used+for+preparation+of+biologic+scaffolds+and+in+vivo+relevance.">Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance.</a> Methods. 84, 25-34 (2015).</li><li>Mendibil, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+decellularization+methods:+Rationale+and+strategies+to+achieve+regenerative+compounds.">Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).</li><li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds:+A+systematic+review.">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).</li><li>Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+tissues+by+perfusion+decellularization/recellularization:+Review.">Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.</a> Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).</li><li>Adil, A., Xu, M., Haykal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recellularization+of+bioengineered+scaffolds+for+vascular+composite+allotransplantation.">Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation.</a> Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).</li><li>Phelps, E. A., Garc&#237;a, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+more+than+a+cell:+Vascularization+strategies+in+tissue+engineering.">Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).</li><li>Pozzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+porcine+fascio-cutaneous+flap+model+for+vascularized+composite+allografts+bioengineering+studies.">A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).</li><li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+repopulation+and+preparation+of+rodent+extracellular+matrix+scaffolds+for+renal+tissue+development.">Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).</li><li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system.">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li><li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+systems+and+devices:+State-of-the-art.">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li><li>Schilling, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+an+automatable,+3D+printed+perfusion+device+for+tissue+infusion+and+perfusion+engineering.">Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).</li></ol>

Il protocollo proposto utilizza la perfusione di SDS a bassa concentrazione per decellularizzare una gamma di lembi derivati dal maiale. Con questa procedura, l'omento acellulare, la fascia tensoriale lata e i lembi radiali dell'avambraccio possono essere decellularizzati con successo utilizzando un protocollo che favorisce la SDS a bassa concentrazione. Esperimenti preliminari di ottimizzazione hanno determinato che la SDS a bassa concentrazione (0,05%) tra 2 giorni e 5 giorni è in grado di rimuovere materiale cellular...

La lesione traumatica e la rimozione del tumore possono portare a difetti dei tessuti molli grandi e complessi. Questi difetti possono compromettere la qualità della vita del paziente, causare perdita di funzione e causare disabilità permanente. Mentre tecniche come il trasferimento del lembo di tessuto autologo sono state comunemente praticate, i problemi con la disponibilità del lembo e la morbilità del sito donatore sono le principali limitazioni 1,2,3. L'allotrapianto composito vascolarizzato (VCA) è un'alternativa promettente che trasferisce i tessuti compositi, ad esempio muscoli, pelle, vascolarizzazione, come una singola unità ai riceventi. Tuttavia, VCA richiede immunosoppressione a lungo termine, che porta a tossicità da farmaci, infezioni opportunistiche e tumori maligni 4,5,6.
Gli scaffold acellulari di ingegneria tissutale sono una potenziale soluzione a queste limitazioni7. Gli scaffold tissutali acellulari possono essere ottenuti utilizzando metodi di decellularizzazione, che rimuovono il materiale cellulare dai tessuti nativi preservando la microarchitettura della matrice extracellulare sottostante (ECM). In contrasto con l'uso di materiali sintetici nell'ingegneria tissutale, l'uso di scaffold di derivazione biologica offre un substrato ECM biomimetico che consente la biocompatibilità e il potenziale per la traduzione clinica8. Dopo la decellularizzazione, la successiva ricellularizzazione degli scaffold con cellule specifiche del ricevente può quindi generare tessuti funzionali vascolarizzati con poca o nessuna immunogenicità 9,10,11. Sviluppando un protocollo efficace per ottenere tessuti acellulari utilizzando tecniche di decellularizzazione per perfusione, è possibile progettare un'ampia gamma di tipi di tessuto. A sua volta, la costruzione di questa tecnica consente l'applicazione a tessuti più complessi. Ad oggi, la decellularizzazione perfusionale dei tessuti molli vascolarizzati è stata studiata utilizzando semplici tessuti vascolarizzati come un lembo fasciocutaneo a tutto spessore nel roditore 12, nel suino13 e nei modelli umani 14, così come il muscolo scheletrico del retto dell'addome suino15. Inoltre, tessuti vascolarizzati complessi sono stati anche decellularizzati per perfusione, come dimostrato nei modelli di orecchio suino e umano 16,17 e nei modelli di innesto umano a pieno viso18.
Qui, il protocollo descrive la decellularizzazione di lembi liberi vascolarizzati utilizzando scaffold ECM di derivazione biologica. Presentiamo la decellularizzazione di tre lembi clinicamente rilevanti: 1) l'omento, 2) la fascia tensoriale lata e 3) l'avambraccio radiale, tutti rappresentativi dei lembi del cavallo di battaglia utilizzati di routine nella chirurgia ricostruttiva e non sono stati precedentemente esaminati negli studi sugli animali nel contesto della decellularizzazione tissutale. Questi lembi bioingegnerizzati offrono una piattaforma versatile e prontamente disponibile che ha il potenziale per applicazioni cliniche per l'uso nel campo della riparazione e ricostruzione di difetti dei tessuti molli di grandi dimensioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.2 &#181;m pore Acrodisk Filter</td>
			<td >VWR</td>
			<td >CA28143-310</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JF7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 L Polypropylene Carboy</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-62507-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>&#160;LS639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-way Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-30600-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Atropine Sulphate 15 mg/30ml</td>
			<td>Rafter 8 Products</td>
			<td>238481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 20-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 22-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 24-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS, 10X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-415-CL</td>
			<td>&#160;without Ca++/Mg++</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin, 1000 I.U./mL</td>
			<td>Leo Pharma A/S</td>
			<td>453811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine Hydrochloride&#160; 5000 mg/50 ml</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>612316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td>Internal Diameter:&#160; 1.85 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec REGLO 4-Channel Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>78001-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Tubing Cassettes</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-78016-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane 99.9%, 250 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2231929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Lennox</td>
			<td>Bioshop Canada</td>
			<td>LBL406.500</td>
			<td>Sterility testing agar plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Masterflex L/S 16 Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam 50 mg/10 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2242905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopolar Cautery Pencil</td>
			<td>Valleylab</td>
			<td>E2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Buffered Formalin, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#176;11 scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Connector for 1/4&#34; to 1/8&#34; Tube ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Tube 90&#176; Elbow Connectors</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Plugs</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K143</td>
			<td>Male Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Sockets</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K293</td>
			<td>Female Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Punch Biopsy Tool</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>3332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride 40 mEq/20 ml</td>
			<td>Hospira Healthcare Corporation</td>
			<td>37869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine, 10%</td>
			<td>Rougier</td>
			<td>833133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serological Pipet, 2mL</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Snap Lid Airtight Containers</td>
			<td>SnapLock</td>
			<td>142-3941-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical Metal Ligation Clips, Small</td>
			<td >Teleflex</td>
			<td >001200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >BC004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TruWave Pressure Monitoring Set</td>
			<td >Edwards Lifesciences</td>
			<td >PX260</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor

I difetti dei tessuti molli di grandi volumi portano a deficit funzionali e possono avere un grande impatto sulla qualità della vita del paziente. Sebbene la ricostruzione chirurgica possa essere eseguita utilizzando il trasferimento autologo del lembo libero o l'allotrapianto composito vascolarizzato (VCA), tali metodi presentano anche degli svantaggi. Problemi come la morbilità del sito donatore e la disponibilità di tessuti limitano il trasferimento autologo del lembo libero, mentre l'immunosoppressione è una limitazione significativa della VCA. I tessuti ingegnerizzati in chirurgia ricostruttiva utilizzando metodi di decellularizzazione/ricellularizzazione rappresentano una possibile soluzione. I tessuti decellularizzati sono generati utilizzando metodi che rimuovono il materiale cellulare nativo preservando la microarchitettura della matrice extracellulare sottostante (ECM). Questi scaffold acellulari possono quindi essere successivamente ricellularizzati con cellule specifiche del ricevente.
Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi di approvvigionamento e decellularizzazione utilizzati per ottenere scaffold acellulari in un modello suino. Inoltre, fornisce anche una descrizione della progettazione e della configurazione del bioreattore di perfusione. I lembi includono l'omento suino, la fascia lata tensoriale e l'avambraccio radiale. La decellularizzazione viene eseguita tramite perfusione ex vivo di detergente a bassa concentrazione di sodio dodecilsolfato (SDS), seguita da trattamento enzimatico DNasi e sterilizzazione con acido peracetico in un bioreattore di perfusione personalizzato.
La decellularizzazione tissutale di successo è caratterizzata da un aspetto bianco-opaco dei lembi macroscopicamente. I lembi acellulari mostrano l'assenza di nuclei sulla colorazione istologica e una significativa riduzione del contenuto di DNA. Questo protocollo può essere utilizzato in modo efficiente per generare scaffold di tessuti molli decellularizzati con ECM conservata e microarchitettura vascolare. Tali scaffold possono essere utilizzati in successivi studi di ricellularizzazione e hanno il potenziale per la traduzione clinica in chirurgia ricostruttiva.

Questo protocollo per decellularizzare i lembi suini vascolarizzati si basa sulla perfusione di un detergente a base ionica, SDS, attraverso la vascolarizzazione del lembo in un bioreattore di perfusione personalizzato. Prima della decellularizzazione, tre lembi vascolarizzati in un modello suino sono stati acquistati e incannulati in base ai loro principali vasi di alimentazione. I lembi sono stati immediatamente lavati dopo l'approvvigionamento al fine di mantenere una vascolarizzazione brevettata e perfusibile per con...

Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor at JoVE.com

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Il protocollo descrive l'approvvigionamento chirurgico e la successiva decellularizzazione dei lembi suini vascolarizzati mediante la perfusione di detergente dodecilsolfato di sodio attraverso la vascolarizzazione del lembo in un bioreattore di perfusione personalizzato.

Approvvigionamento e perfusione-decellularizzazione di lembi vascolarizzati suini in un bioreattore di perfusione personalizzato

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Questo metodo descrive l'approvvigionamento chirurgico di tre lembi suini vascolarizzati e la loro successiva decellularizzazione della perfusione. Questo metodo può aiutare gli sforzi per rigenerare i lembi suini utilizzando un approccio di decellularizzazione e ricellularizzazione dei tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua versatilità per ottenere la decellularizzazione a profusione attraverso una varietà di lembi suini vascolarizzati in una configurazione di bioreattore semplice da assemblare.La tecnica qui descritta può essere ampiamente applicata ad altri lembi vascolarizzati come potenziale soluzione di ingegneria tissutale utilizzando i lembi suini nella chirurgia ricostruttiva. Per iniziare, crea un tubo di afflusso e deflusso misurando circa 50 centimetri di tubi in silicone rivestiti di platino LS16. Collegare un'estremità a un tubo giallo della pompa a 3 stop e l'altra a una pipetta sierologica sterile da 2 millilitri per trasportare il perfusato dai serbatoi del detergente nella camera del bioreattore.Autoclavare la camera e i tubi in imballaggi sterili confezionati singolarmente. Per l'approvvigionamento del lembo omentale, posizionare un maiale dello Yorkshire anestetizzato di 12 settimane in posizione supina, quindi preparare l'addome nel solito modo sterile. Eseguire una laparotomia xifo-ombelicale per entrare nell'addome e mobilizzare il cefalo dello stomaco e posizionare l'omento nel campo operatorio.A partire dall'aspetto sinistro della curvatura maggiore, dove l'arteria gastroepiploica sinistra si unisce all'arteria splenica, scheletrizzare l'arteria gastroepiploica sinistra e la vena usando le forbici per tenotomia di Stevens dritte. Quindi legare e dividere entrambi separatamente usando fascette chirurgiche o clip. Procedere lungo la maggiore curvatura dello stomaco da sinistra a destra per legare e dividere i brevi rami vascolari derivanti dall'omento, fornendo la maggiore curvatura dello stomaco.Continuare la mobilizzazione dell'omento maggiore fino a quando non si incontra la giunzione dei vasi gastroepiploici destro e dell'arteria gastroduodenale. Quindi legare e dividere l'arteria gastroepiploica destra e la vena per liberare il lembo omentale e consentire l'incannulamento del lembo in seguito. Per l'approvvigionamento del lembo tensoriale della fascia lata, posizionare il maiale nella posizione del decubito laterale.Segnare il limite interno del lembo dalla spina iliaca superiore anteriore, o ASIS, verso la rotula laterale e un confine posteriore di circa 8-10 centimetri caudalmente. Usa un bisturi per fare un'incisione acuta sul margine distale della rotula. Approfondire l'incisione attraverso i tessuti sottocutanei per raggiungere la fascia sovrastante il retto femorale e continuare le incisioni verso l'ASIS lungo i confini marcati.Per isolare il lembo fasciale da solo, rimuovere la componente cutanea sovrastante dallo strato di fascia sottostante. Quindi legare o cauterizzare piccoli vasi perforatori sulla pelle. Tornare al bordo distale del lembo e incidere la fascia profonda.Mobilitare la fascia dal muscolo vasto laterale sottostante verso l'ASIS. Dopo aver tracciato il peduncolo verso i vasi femorali profondi, scheletrizzare l'arteria femorale circonflessa laterale e la vena che fornisce il lembo fasciale. Quindi legare e dividere i vasi dei lembi in modo prossimale, dove si uniscono ai vasi femorali profondi e consentono un successivo incannulamento.Per l'approvvigionamento del lembo dell'avambraccio radiale, segnare un quadrato di 3 per 3 centimetri sull'aspetto radiale di un avambraccio di maiale esteso. Tracciare una linea tra il punto medio del margine del lembo prossimale e la fossa antecubitale per indicare il decorso approssimativo del peduncolo dell'arteria radiale. Confermare il decorso arterioso con la palpazione.Quindi, incidere la pelle usando un bisturi all'aspetto distale con una profondità fino alla fascia antebrachiale. Sezionare smussata con forbici per tenotomia fino a quando non si incontrano l'arteria radiale distale e la sua vena comitantes. Quindi legare e dividere l'arteria e le vene con fascette chirurgiche o clip.Continuare le incisioni cutanee sui margini radiale e ulnare del quadrato cutaneo marcato. Quindi mobilitare il lembo dall'osso radiale sottostante con una lama chirurgica o un cauterizzazione, procedendo da una direzione ulnare a radiale mentre si solleva il lembo cutaneo prossimalmente verso la fossa antecubitale. Usando le forbici per tenotomia, scheletrizzano l'arteria radiale e la vena comitante prossimalmente alla fossa antecubitale, dove si uniscono rispettivamente all'arteria brachiale e alle vene.Sezionare i vasi dai tessuti fibro-grassi circostanti per isolare il peduncolo vascolare. Quindi legare e dividere l'arteria e la vena separatamente per liberare il lembo dell'avambraccio radiale. Quindi, cannulare i vasi peduncolari con angiocatetere da 20 a 24 calibro fissato con cravatte di seta 3-0.Lavare la soluzione salina eparinizzata nella cannula arteriosa del lembo fino a quando non si osserva un chiaro deflusso venoso. Mentre si lavora in un armadio di biosicurezza a flusso laminare, posizionare i lembi nella camera di tessuto del bioreattore. Tubo di afflusso primario con soluzione salina eparinizzata sterile per rimuovere l'aria residua e disporre i lembi per consentire il collegamento tra la cannula arteriosa del lembo e il connettore luer maschio.Quindi utilizzare emostati sterili per avvitare la cannula arteriosa sul connettore. Quindi lavare la soluzione salina eparinizzata attraverso il rubinetto di arresto per verificare che la connessione luer sia priva di perdite e che i flop possano essere perfusi con evidenza di deflusso venoso. Dopo aver chiuso il coperchio della camera del tessuto, collegare il tubo di afflusso con un tubo giallo della pompa a 3 stop al rubinetto di arresto dell'afflusso della camera del tessuto.Inoltre, collegare un trasduttore del sensore di pressione in linea al rubinetto di arresto a 3 vie di afflusso per il monitoraggio della pressione di perfusione. Quindi, accendere la pompa peristaltica di afflusso e nella schermata iniziale, passare alla terza scheda utilizzando la freccia per impostare l'ID del tubo su 1,85 millimetri. Quindi impostare la velocità di perfusione dalla seconda scheda.La velocità di ingresso come modalità di consegna è impostata su 2 millilitri al minuto. Assicurarsi che la direzione del flusso sia corretta come visualizzata sullo schermo. Caricare il tubo della pompa a 3 stop sulla pompa peristaltica con una cassetta compatibile.Impostare l'impostazione della pompa di deflusso su una velocità di 4 millilitri al minuto. Collegare il tubo di deflusso con un tubo giallo della pompa a 3 arresti al rubinetto di arresto del deflusso della camera tissutale. Quindi caricare il tubo della pompa a 3 arresti sulla pompa peristaltica e avviare il flusso per entrambe le pompe premendo il pulsante di accensione su ciascuna pompa.Iniziare la decellularizzazione perfusionale dei lembi con soluzione salina eparinizzata nella camera tissutale per 15 minuti per rimuovere eventuali coaguli di sangue trattenuti. Al termine, sostituire la soluzione salina residua con 500 millilitri di sodio dodecilsolfato, o SDS, soluzione di decellularizzazione per immergere il lembo. Quindi, trasferire il tubo di afflusso alla soluzione SDS e abbondante il tessuto.Dopo la decellularizzazione della SDS, aspirare la SDS rimanente prima di perfondere il lembo con PBS per un giorno. Dopo la decellularizzazione della perfusione SDS, perfondere sequenzialmente i lembi nella soluzione di DNA per due ore, e poi in PBS per un giorno, seguito dal trasferimento del tubo di afflusso in acido peracetico ed etanolo in acqua distillata per sterilizzare i lembi perfondendo per tre ore. Una volta fatto, rimuovere i lembi in modo asettico e immergerli in due lavaggi di PBS contenenti antimicotici antibiotici all'1% per 15 minuti ciascuno.Conservare i lembi a 4 gradi Celsius fino al momento della ricellularizzazione. Utilizzare uno strumento di biopsia da 3 a 10 millimetri per ottenere campioni di tessuto per la valutazione dei lembi decellularizzati. I lembi decellularizzati isolati lavati sotto controllo manuale hanno dimostrato evidenza di deflusso dalla cannula venosa liberamente drenante dell'omento, della fascia tensoriale lata e del lembo radiale dell'avambraccio.La morfologia grossolana dell'omento nativo, della fascia tensoriale lata e dei lembi radiali dell'avambraccio appariva di colore rosa subito dopo l'approvvigionamento. In confronto, i tessuti decellularizzati erano tipicamente bianchi o opachi nell'aspetto. L'esame istologico dei tessuti nativi con ematossilina ed eosina ha mostrato la presenza di nuclei blu.Nei lembi decellularizzati, la colorazione istologica ha rivelato la perdita di materiale cellulare senza colorazione nucleare blu, indicando un'impalcatura del tessuto acellulare. Un'ulteriore quantificazione del contenuto di DNA ha mostrato una significativa diminuzione del DNA negli scaffold acellulari rispetto ai tessuti nativi. La considerazione più importante è una tecnica chirurgica utilizzata durante l'approvvigionamento, avendo cura di evitare danni al peduncolo del lembo al fine di consentire la successiva decellularizzazione della perfusione.Dopo la decellularizzazione per perfusione, i lembi risultanti possono essere ricellularizzati con popolazioni cellulari tessuto-specifiche al fine di rigenerare i compartimenti tissutali nativi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Procedura per decellularizzazione del Cuore di suino da retrograda perfusione coronarica

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Progettazione di un biassiale Carico meccanico bioreattore per l&#39;ingegneria tissutale

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Il funzionamento di un bioreattore da banco

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Progettato Vascolarizzato muscolare Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Bioreattore guidato da imaging per la generazione di tessuto delle vie aeree bioingegnerizzato

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Un modello affidabile di lembo fascio-cutaneo suino per studi di bioingegneria di allotrapianti compositi vascolarizzati

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

A Friction Testing-Bioreactor Device for Study of Synovial Joint Biomechanics, Mechanobiology, and Physical Regulation

Un dispositivo per test di attrito-bioreattore per lo studio della biomeccanica delle articolazioni sinoviali, della meccanobiologia e della regolazione fisica

In primary osteoarthritis (OA), normal 'wear and tear' associated with aging inhibits the ability of cartilage to sustain its load-bearing and lubrication ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati utilizzando tecnologie di stampa 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Bioreattore di perfusione multi-stream integrato con frazionamento in uscita per colture cellulari dinamiche

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...