Name: procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor at JoVE.com

動物被験者が関与するすべての手順は、大学保健ネットワーク施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されており、大学保健ネットワーク動物資源センターのプロトコルと手順、およびカナダ動物管理ガイドライン評議会に従って実施されています。5頭のヨークシャーブタ(35〜50kg、生後約12週齢)をすべての実験に使用した。
1. 灌流バイオリアクターの作製
<ol><l...

<ol>
	<li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity:+A+Prospective+Study.">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li><li>Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+after+pedicled+or+free+TRAM+flap+surgery:+A+prospective+and+objective+study.">Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+free-style+flaps:+Risk+analysis+of+complications.">A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).</li><li>Issa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allograft-specific+characteristics+of+immune+responses.">Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses.</a> Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).</li><li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration.">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li><li>Iske, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+tissue+allotransplantation:+Opportunities+and+challenges.">Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges.</a> Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).</li><li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine.">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).</li><li>Colazo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applied+bioengineering+in+tissue+reconstruction,+replacement,+and+regeneration.">Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+in+tissue+engineering.">Vascularization in tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+skin/adipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps.">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li><li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+bioengineered+skin+flap+scaffold+with+a+perfusable+vascular+pedicle.">Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle.</a> Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).</li><li>Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+large-volume+human-derived+adipose+acellular+allogenic+flap+by+perfusion+decellularization.">Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+skeletal+muscle+as+a+three-dimensional+scaffold+with+a+vascular+network+template.">Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template.</a> Biomaterials. 89, 114-126 (2016).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+the+porcine+ear+generates+a+biocompatible,+nonimmunogenic+extracellular+matrix+platform+for+face+subunit+bioengineering.">Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering.</a> Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularization+of+human+ear+grafts+enables+ECM-based+scaffolds+for+auricular+vascularized+composite+tissue+engineering.">Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+a+human+face+graft:+The+matrix+of+identity.">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li><li>Haughey, B. H., Panje, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+for+multiple+musculocutaneous+flaps.">A porcine model for multiple musculocutaneous flaps.</a> The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).</li><li>Khachatryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap.">Radial Forearm Flap.</a> Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).</li><li>Hammouda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+nanostructure+of+SDS+micelles+in+water.">Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).</li><li>Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+a+fasciocutaneous+flap+for+use+as+a+perfusable+scaffold.">Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold.</a> Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).</li><li>Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+tissue+decellularization+used+for+preparation+of+biologic+scaffolds+and+in+vivo+relevance.">Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance.</a> Methods. 84, 25-34 (2015).</li><li>Mendibil, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+decellularization+methods:+Rationale+and+strategies+to+achieve+regenerative+compounds.">Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).</li><li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds:+A+systematic+review.">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).</li><li>Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+tissues+by+perfusion+decellularization/recellularization:+Review.">Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.</a> Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).</li><li>Adil, A., Xu, M., Haykal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recellularization+of+bioengineered+scaffolds+for+vascular+composite+allotransplantation.">Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation.</a> Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).</li><li>Phelps, E. A., Garc&#237;a, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+more+than+a+cell:+Vascularization+strategies+in+tissue+engineering.">Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).</li><li>Pozzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+porcine+fascio-cutaneous+flap+model+for+vascularized+composite+allografts+bioengineering+studies.">A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).</li><li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+repopulation+and+preparation+of+rodent+extracellular+matrix+scaffolds+for+renal+tissue+development.">Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).</li><li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system.">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li><li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+systems+and+devices:+State-of-the-art.">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li><li>Schilling, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+an+automatable,+3D+printed+perfusion+device+for+tissue+infusion+and+perfusion+engineering.">Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).</li></ol>

提案されたプロトコルは、低濃度SDSの灌流を使用して、ブタ由来のフラップの範囲を脱細胞化します。この手順により、低濃度SDSを支持するプロトコルを使用して、無細胞大網、テンソル筋膜ラタ、および橈骨前腕フラップを正常に脱細胞化できます。予備的な最適化実験により、2日から5日の間の低濃度(0.05%)のSDSは、組織学的手法で分析した場合、大網、大動脈筋膜、および橈骨前腕皮弁?...

外傷性損傷および腫瘍除去は、大きくて複雑な軟部組織の欠陥を引き起こす可能性があります。これらの欠陥は、患者の生活の質を損ない、機能の喪失を引き起こし、永続的な障害を引き起こす可能性があります。自家組織フラップ移植などの技術が一般的に実施されてきましたが、フラップの利用可能性とドナー部位の罹患率に関する問題は大きな制限です1、2、3。血管化複合同種移植(VCA)は、筋肉、皮膚、血管系などの複合組織を単一のユニットとしてレシピエントに移す有望な代替手段です。しかし、VCAは長期的な免疫抑制を必要とし、それは薬物毒性、日和見感染、および悪性腫瘍につながります4,5,6。
組織工学的無細胞足場は、これらの制限に対する潜在的な解決策です7。非細胞組織足場は、基礎となる細胞外マトリックス(ECM)マイクロアーキテクチャを維持しながら、天然組織から細胞物質を除去する脱細胞化法を使用して得ることができる。組織工学における合成材料の使用とは対照的に、生物学的に誘導された足場の使用は、生体適合性および臨床翻訳の可能性を可能にする生体模倣ECM基質を提供する8。脱細胞化に続いて、レシピエント特異的細胞を用いた足場のその後の再細胞化は、免疫原性がほとんどまたはまったくない機能的な血管新生組織を生成することができる9,10,11。灌流脱細胞化技術を使用して無細胞組織を得るための効果的なプロトコルを開発することにより、幅広い組織タイプを操作できます。次に、この技術に基づいて構築することで、より複雑な組織への適用が可能になります。これまでに、げっ歯類12、ブタ13、ヒトモデル14の全層筋膜皮膚皮弁などの単純な血管新生組織、ならびにブタ腹直筋骨格筋15を用いて、血管化軟組織の灌流脱細胞化が研究されてきた。さらに、複雑な血管新生組織は、ブタおよびヒト耳16、17モデルおよびヒト全面移植モデル18において実証されるように灌流脱細胞化もされている。
ここでは、プロトコルは、生物学的に誘導されたECM足場を用いた血管化遊離フラップの脱細胞化を記載する。臨床的に関連する3つのフラップの脱細胞化を提示します:1)大網、2)テンソル筋膜ラタ、および3)橈骨前腕、これらはすべて再建手術で日常的に使用される主力フラップの代表であり、組織脱細胞化の文脈の中で動物実験で以前に調べられていませんでした。これらのバイオエンジニアリングフラップは、汎用性が高く、すぐに利用できるプラットフォームを提供し、大きな軟部組織の欠陥の修復と再建の分野で使用するための臨床応用の可能性を秘めています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.2 &#181;m pore Acrodisk Filter</td>
			<td >VWR</td>
			<td >CA28143-310</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JF7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 L Polypropylene Carboy</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-62507-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>&#160;LS639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-way Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-30600-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Atropine Sulphate 15 mg/30ml</td>
			<td>Rafter 8 Products</td>
			<td>238481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 20-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 22-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 24-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS, 10X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-415-CL</td>
			<td>&#160;without Ca++/Mg++</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin, 1000 I.U./mL</td>
			<td>Leo Pharma A/S</td>
			<td>453811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine Hydrochloride&#160; 5000 mg/50 ml</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>612316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td>Internal Diameter:&#160; 1.85 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec REGLO 4-Channel Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>78001-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Tubing Cassettes</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-78016-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane 99.9%, 250 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2231929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Lennox</td>
			<td>Bioshop Canada</td>
			<td>LBL406.500</td>
			<td>Sterility testing agar plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Masterflex L/S 16 Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam 50 mg/10 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2242905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopolar Cautery Pencil</td>
			<td>Valleylab</td>
			<td>E2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Buffered Formalin, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#176;11 scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Connector for 1/4&#34; to 1/8&#34; Tube ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Tube 90&#176; Elbow Connectors</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Plugs</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K143</td>
			<td>Male Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Sockets</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K293</td>
			<td>Female Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Punch Biopsy Tool</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>3332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride 40 mEq/20 ml</td>
			<td>Hospira Healthcare Corporation</td>
			<td>37869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine, 10%</td>
			<td>Rougier</td>
			<td>833133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serological Pipet, 2mL</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Snap Lid Airtight Containers</td>
			<td>SnapLock</td>
			<td>142-3941-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical Metal Ligation Clips, Small</td>
			<td >Teleflex</td>
			<td >001200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >BC004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TruWave Pressure Monitoring Set</td>
			<td >Edwards Lifesciences</td>
			<td >PX260</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor

大量の軟部組織の欠陥は機能障害につながり、患者の生活の質に大きな影響を与える可能性があります。外科的再建は、自家遊離皮弁移植または血管新生複合同種移植(VCA)を用いて行うことができるが、そのような方法には欠点もある。ドナー部位の罹患率や組織の利用可能性などの問題は、自家の自由皮弁移植を制限しますが、免疫抑制はVCAの重要な制限です。脱細胞化/再細胞化法を用いた再建手術における人工組織は、可能な解決策を表しています。脱細胞化組織は、基礎となる細胞外マトリックス(ECM)マイクロアーキテクチャを維持しながら、天然の細胞物質を除去する方法を使用して生成されます。これらの無細胞足場は、その後、レシピエント特異的細胞で再細胞化することができる。
このプロトコルは、ブタモデルで無細胞足場を達成するために使用される調達および脱細胞化方法を詳述している。さらに、灌流バイオリアクターの設計とセットアップの説明も提供します。フラップには、ブタ大網、テンソル筋膜ラタ、および橈骨前腕が含まれます。脱細胞化は、低濃度ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)洗剤の ex vivo 灌流とそれに続くDNase酵素処理およびカスタマイズされた灌流バイオリアクターでの過酢酸滅菌によって行われます。
成功した組織脱細胞化は、巨視的にフラップの白色不透明な外観によって特徴付けられる。無細胞フラップは、組織学的染色で核が存在しないこと、およびDNA含有量の有意な減少を示す。このプロトコルは、ECMおよび血管マイクロアーキテクチャが保存された脱細胞化軟部組織足場を生成するために効率的に使用できます。このような足場は、その後の再細胞化研究に使用することができ、再建手術における臨床翻訳の可能性を秘めています。

血管化されたブタフラップを脱細胞化するためのこのプロトコルは、カスタマイズされた灌流バイオリアクター内のフラップ血管系を介したイオンベースの洗剤SDSの灌流に依存しています。脱細胞化に先立ち,ブタ模型の3つの血管化フラップを調達し,主供給容器に従ってカニューレ挿入した。フラップは、特許、灌流可能な血管系を維持するために、調達後すぐにフラッシュされ、脱細胞化?...

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Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

プロトコルは、カスタマイズされた灌流バイオリアクター内のフラップ血管系を介したドデシル硫酸ナトリウム界面活性剤の灌流による血管化ブタフラップの外科的調達とその後の脱細胞化について説明しています。

カスタマイズされた灌流バイオリアクターにおけるブタ血管化フラップの調達と灌流-脱細胞化

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

この方法は、3つの血管新生ブタフラップの外科的調達およびそれに続く灌流脱細胞化を記載する。この方法は、組織の脱細胞化および再細胞化アプローチを使用してブタフラップを再生する取り組みを支援することができます。この技術の主な利点は、組み立てが簡単なバイオリアクターセットアップで、さまざまな血管化されたブタフラップにわたって大量の脱細胞化を達成できる汎用性です。ここで説明する技術は、再建手術におけるブタフラップを使用する潜在的な組織工学ソリューションとして、他の血管化フラップに広く適用できます。まず、LS50プラチナコーティングされたシリコンチューブを約16センチメートル測定して、流入チューブと流出チューブを作成します。一方の端を黄色の3ストップポンプチューブに接続し、もう一方の端を滅菌2ミリリットルの血清学的ピペットに接続して、灌流液を洗剤リザーバーからバイオリアクターチャンバーに運びます。チャンバーとチューブを個包装された滅菌包装でオートクレーブします。大網フラップの調達のために、12週齢の麻酔をかけたヨークシャー豚を仰臥位に置き、通常の無菌状態で腹部を準備します。剣状臍帯開腹術を行って腹部に入り、胃頭筋を動員し、大網を手術野に入れます。左胃大網動脈が脾動脈に結合する大曲率の左側から始めて、まっすぐなスティーブンス腱切開ハサミを使用して左胃大網動脈と静脈を骨格化します。次に、外科用タイまたはクリップを使用して両方を別々に結紮および分割します。胃の大きな湾曲に沿って左から右に進み、大網から生じる短い血管枝を結紮して分割し、胃のより大きな湾曲を供給します。右胃大網血管と胃十二指腸動脈の接合部に遭遇するまで、大網の動員を続ける。次に、右胃大網動脈と静脈を結紮して分割し、大網フラップを解放し、後でフラップカニューレ挿入を可能にします。テンソル筋膜ラタフラップの調達では、ブタを外側褥瘡の位置に置きます。前上腸骨棘(ASIS)から外側膝蓋骨に向かって内側のフラップ境界をマークし、尾側に約8〜10センチメートルの後方境界をマークします。メスを使用して、膝蓋骨の遠位縁を鋭く切開します。皮下組織を通して切開を深め、大腿直筋を覆う筋膜に到達し、マークされた境界に沿ってASISに向かって切開を続けます。筋膜フラップのみを分離するには、下にある筋膜層から上にある皮膚成分を取り除きます。次に、小さな穿孔血管を皮膚に結紮または焼灼します。フラップの遠位境界に戻り、深い筋膜を切開します。下にある外側広筋から筋膜をASISに向かって動員します。椎弓根を大腿骨深部血管に向かってなぞった後、筋膜フラップを供給する外側回旋大腿動脈と静脈を骨格化します。次に、フラップ血管を近位に結紮して分割し、そこで深部大腿血管に結合し、後でカニューレ挿入できるようにします。放射状の前腕フラップを調達する場合は、伸ばした豚の前腕の放射状の側面に3 x 3センチメートルの正方形をマークします。近位フラップマージンの中点と肘前窩の間に線を引き、橈骨動脈茎のおおよその経過を示します。触診で動脈の経過を確認します。次に、上腕前筋膜までの深さの遠位側でメスを使用して皮膚を切開します。遠位橈骨動脈とその大静脈に遭遇するまで、腱切開ハサミで鈍く解剖します。次に、動脈と静脈を外科用タイまたはクリップで結紮して分割します。マークされた皮膚の正方形の橈骨および尺骨縁の皮膚切開を続けます。次に、下にある橈骨からフラップを手術用ブレードまたは焼灼器で動員し、尺骨から橈骨方向に進み、皮膚フラップを肘前窩に向かって近位に上げます。腱切開ハサミを使用して、橈骨動脈と大静脈を肘前窩で近位に骨格化し、そこでそれぞれ上腕動脈と静脈に結合します。周囲の線維脂肪組織から血管を解剖して、血管茎を分離します。次に、動脈と静脈を別々に結紮して分割し、橈骨前腕フラップを解放します。次に、3-0の絹のネクタイで固定された20〜24ゲージの血管カテーテルで椎弓根血管をカニューレします。明確な静脈流出が観察されるまで、ヘパリン化生理食塩水をフラップ動脈カニューレに洗い流します。.層流バイオセーフティキャビネットで作業しながら、バイオリアクター組織チャンバーにフラップを配置します。滅菌ヘパリン処理生理食塩水を使用したプライム流入チューブは、残留空気を除去し、フラップ動脈カニューレとオスルアーコネクタを接続できるようにフラップを配置します。次に、滅菌止血剤を使用して、動脈カニューレをコネクタにねじ込みます。次に、ヘパリン処理生理食塩水を活栓に通して、ルアー接続に漏れがないこと、およびフロップに静脈流出の証拠を灌流できることを確認します。ティッシュチャンバーの蓋を閉じた後、黄色の3ストップポンプチューブを備えた流入チューブをティッシュチャンバーの流入活栓に接続します。また、流入3方向活栓にインライン圧力センサトランスデューサを取り付けて、灌流圧力を監視します。次に、流入蠕動ポンプをオンにし、初期画面で矢印を使用して3番目のタブに移動し、チューブIDを1.85ミリメートルに設定します。次に、2番目のタブから灌流率を設定します。配送モードとしての入力レートは、毎分2ミリリットルに設定されています。フローの方向が画面に表示されているとおりに正しいことを確認します。互換性のあるカセットを使用して、3ストップポンプチューブを蠕動ポンプにロードします。流出ポンプの設定を毎分4ミリリットルの速度に設定します。黄色の3ストップポンプチューブを備えた流出チューブをティッシュチャンバーの流出活栓に接続します。次に、3ストップポンプチューブを蠕動ポンプにロードし、各ポンプの電源ボタンを押して両方のポンプの流れを開始します。組織室でヘパリン化生理食塩水でフラップの灌流脱細胞化を15分間開始し、保持された血栓を除去します。完了したら、残りの生理食塩水を500ミリリットルのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の脱細胞化溶液と交換して、フラップを沈めます。次に、流入チューブをSDS溶液に移し、組織を大量に注入します。SDS脱細胞化後、残りのSDSを吸引してから、フラップをPBSで1日間灌流します。SDS灌流脱細胞化後、フラップをDNA溶液で2時間、PBSで1日間順次灌流した後、流入チューブを蒸留水中の過酢酸とエタノールに移し、3時間灌流してフラップを滅菌します。完了したら、フラップを無菌的に取り外し、1%抗生物質抗真菌剤を含むPBSの2回の洗浄にそれぞれ15分間浸します。.再セル化の準備ができるまで、フラップを摂氏4度で保管します。3〜10ミリメートルのパンチ生検ツールを使用して、脱細胞化フラップを評価するための組織サンプルを取得します。手動制御下でフラッシュされた単離された脱細胞化フラップは、大網、テンソル筋膜、および橈骨前腕フラップの自由に排出される静脈カニューレからの流出の証拠を示しました。在来大網、テンソル筋膜ラタ、および橈骨前腕フラップの肉眼的形態は、調達直後にピンク色に見えました。比較すると、脱細胞化組織は、外観が特徴的に白色または不透明であった。ヘマトキシリンおよびエオシンを用いた天然組織の組織学的検査は、青色核の存在を示した。脱細胞化フラップでは、組織学的染色により、青色核染色なしで細胞物質の喪失が明らかになり、無細胞組織足場が示されました。DNA含有量の追加定量は、天然組織と比較して無細胞足場のDNAの有意な減少を示した。最も重要な考慮事項は、調達中に使用される外科的技術であり、その後の灌流脱細胞化を可能にするためにフラップ茎の損傷を避けるように注意する。灌流脱細胞化に続いて、得られたフラップは、天然の組織区画を再生するために組織特異的細胞集団で再細胞化され得る。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

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動的細胞培養のための出口分画と統合されたマルチストリーム灌流バイオリアクター

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...