Name: procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor at JoVE.com

Alle prosedyrer som involverer dyrefag er godkjent av University Health Network Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og utføres i samsvar med University Health Network Animal Resource Centre protokoll og prosedyrer og Canadian Council on Animal Care Guidelines. Fem Yorkshire griser (35-50 kg; alder ca 12 uker gammel) ble brukt til alle eksperimenter.
1. Perfusjon bioreaktor fabrikasjon
<ol><li>Se figur 1 for alle komponentene som brukes i perfusjons...

<ol>
	<li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity:+A+Prospective+Study.">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li><li>Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+after+pedicled+or+free+TRAM+flap+surgery:+A+prospective+and+objective+study.">Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+free-style+flaps:+Risk+analysis+of+complications.">A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).</li><li>Issa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allograft-specific+characteristics+of+immune+responses.">Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses.</a> Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).</li><li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration.">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li><li>Iske, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+tissue+allotransplantation:+Opportunities+and+challenges.">Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges.</a> Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).</li><li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine.">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).</li><li>Colazo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applied+bioengineering+in+tissue+reconstruction,+replacement,+and+regeneration.">Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+in+tissue+engineering.">Vascularization in tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+skin/adipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps.">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li><li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+bioengineered+skin+flap+scaffold+with+a+perfusable+vascular+pedicle.">Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle.</a> Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).</li><li>Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+large-volume+human-derived+adipose+acellular+allogenic+flap+by+perfusion+decellularization.">Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+skeletal+muscle+as+a+three-dimensional+scaffold+with+a+vascular+network+template.">Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template.</a> Biomaterials. 89, 114-126 (2016).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+the+porcine+ear+generates+a+biocompatible,+nonimmunogenic+extracellular+matrix+platform+for+face+subunit+bioengineering.">Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering.</a> Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularization+of+human+ear+grafts+enables+ECM-based+scaffolds+for+auricular+vascularized+composite+tissue+engineering.">Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+a+human+face+graft:+The+matrix+of+identity.">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li><li>Haughey, B. H., Panje, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+for+multiple+musculocutaneous+flaps.">A porcine model for multiple musculocutaneous flaps.</a> The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).</li><li>Khachatryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap.">Radial Forearm Flap.</a> Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).</li><li>Hammouda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+nanostructure+of+SDS+micelles+in+water.">Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).</li><li>Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+a+fasciocutaneous+flap+for+use+as+a+perfusable+scaffold.">Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold.</a> Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).</li><li>Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+tissue+decellularization+used+for+preparation+of+biologic+scaffolds+and+in+vivo+relevance.">Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance.</a> Methods. 84, 25-34 (2015).</li><li>Mendibil, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+decellularization+methods:+Rationale+and+strategies+to+achieve+regenerative+compounds.">Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).</li><li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds:+A+systematic+review.">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).</li><li>Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+tissues+by+perfusion+decellularization/recellularization:+Review.">Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.</a> Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).</li><li>Adil, A., Xu, M., Haykal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recellularization+of+bioengineered+scaffolds+for+vascular+composite+allotransplantation.">Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation.</a> Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).</li><li>Phelps, E. A., Garc&#237;a, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+more+than+a+cell:+Vascularization+strategies+in+tissue+engineering.">Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).</li><li>Pozzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+porcine+fascio-cutaneous+flap+model+for+vascularized+composite+allografts+bioengineering+studies.">A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).</li><li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+repopulation+and+preparation+of+rodent+extracellular+matrix+scaffolds+for+renal+tissue+development.">Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).</li><li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system.">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li><li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+systems+and+devices:+State-of-the-art.">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li><li>Schilling, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+an+automatable,+3D+printed+perfusion+device+for+tissue+infusion+and+perfusion+engineering.">Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).</li></ol>

Den foreslåtte protokollen bruker perfusjon av lav konsentrasjon SDS for å decellularisere en rekke svineavledede klaffer. Med denne prosedyren kan acellulær omentum, tensor fascia lata og radial underarmsklaffer vellykket decellulariseres ved hjelp av en protokoll som favoriserer lav konsentrasjon SDS. Foreløpige optimaliseringseksperimenter har fastslått at SDS ved lav konsentrasjon (0,05%) mellom 2 dager og 5 dager er i stand til å fjerne cellulært materiale for omentum, tensor fascia lata og radial underarmskl...

Traumatisk skade og fjerning av svulster kan føre til store og komplekse bløtvevsdefekter. Disse feilene kan svekke pasientens livskvalitet, føre til tap av funksjon, og resultere i permanent uførhet. Mens teknikker som autolog vevsklaffoverføring har blitt praktisert, er problemer med klafftilgjengelighet og morbiditet på donorstedet store begrensninger 1,2,3. Vascularized composite allotransplantation (VCA) er et lovende alternativ som overfører komposittvev, for eksempel muskel, hud, vaskulatur, som en enkelt enhet til mottakere. VCA krever imidlertid langvarig immunsuppresjon, noe som fører til legemiddeltoksisitet, opportunistiske infeksjoner og maligniteter 4,5,6.
Vevskonstruerte acellulære stillaser er en potensiell løsning på disse begrensningene7. Acellulære vevsstillas kan oppnås ved hjelp av decellulariseringsmetoder, som fjerner cellulært materiale fra innfødte vev samtidig som den underliggende ekstracellulære matrisen (ECM) mikroarkitekturen bevares. I motsetning til bruken av syntetiske materialer i vevsteknikk, tilbyr bruken av biologisk avledede stillaser et biomimetisk ECM-substrat som tillater biokompatibilitet og potensialet for klinisk oversettelse8. Etter decellularisering kan den påfølgende recellulariseringen av stillaser med mottakerspesifikke celler generere funksjonelle, vaskulariserte vev med liten eller ingen immunogenisitet 9,10,11. Ved å utvikle en effektiv protokoll for å oppnå acellulært vev ved hjelp av perfusjonsdecellulariseringsteknikker, kan et bredt spekter av vevstyper konstrueres. I sin tur tillater å bygge på denne teknikken applikasjonen til mer komplekse vev. Hittil har perfusjonsdecellularisering av vaskularisert bløtvev blitt undersøkt ved hjelp av enkle vaskulariserte vev som en full tykkelse fasciokutan klaff i gnager 12, svin 13 og menneskelige modeller14, samt porcine rectus abdominis skjelettmuskulatur15. I tillegg har komplekse vaskulariserte vev også blitt perfusjonsdecellularisert som vist i svin og humant øre 16,17 modeller og humane full-face graft modeller18.
Her beskriver protokollen decellularisering av vaskulariserte frie klaffer ved bruk av biologisk avledede ECM-stillaser. Vi presenterer decellularisering av tre klinisk relevante klaffer: 1) omentum, 2) tensor fascia lata og 3) radial underarm, som alle er representative for arbeidshestklaffer som brukes rutinemessig i rekonstruktiv kirurgi og ikke tidligere er undersøkt i dyreforsøk i sammenheng med vevsdecellularisering. Disse bioengineerte klaffene tilbyr en allsidig og lett tilgjengelig plattform som har potensial for kliniske anvendelser for bruk innen reparasjon og rekonstruksjon av store bløtvevsdefekter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.2 &#181;m pore Acrodisk Filter</td>
			<td >VWR</td>
			<td >CA28143-310</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JF7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 L Polypropylene Carboy</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-62507-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>&#160;LS639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-way Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-30600-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Atropine Sulphate 15 mg/30ml</td>
			<td>Rafter 8 Products</td>
			<td>238481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 20-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 22-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 24-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS, 10X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-415-CL</td>
			<td>&#160;without Ca++/Mg++</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin, 1000 I.U./mL</td>
			<td>Leo Pharma A/S</td>
			<td>453811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine Hydrochloride&#160; 5000 mg/50 ml</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>612316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td>Internal Diameter:&#160; 1.85 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec REGLO 4-Channel Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>78001-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Tubing Cassettes</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-78016-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane 99.9%, 250 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2231929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Lennox</td>
			<td>Bioshop Canada</td>
			<td>LBL406.500</td>
			<td>Sterility testing agar plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Masterflex L/S 16 Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam 50 mg/10 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2242905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopolar Cautery Pencil</td>
			<td>Valleylab</td>
			<td>E2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Buffered Formalin, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#176;11 scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Connector for 1/4&#34; to 1/8&#34; Tube ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Tube 90&#176; Elbow Connectors</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Plugs</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K143</td>
			<td>Male Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Sockets</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K293</td>
			<td>Female Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Punch Biopsy Tool</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>3332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride 40 mEq/20 ml</td>
			<td>Hospira Healthcare Corporation</td>
			<td>37869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine, 10%</td>
			<td>Rougier</td>
			<td>833133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serological Pipet, 2mL</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Snap Lid Airtight Containers</td>
			<td>SnapLock</td>
			<td>142-3941-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical Metal Ligation Clips, Small</td>
			<td >Teleflex</td>
			<td >001200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >BC004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TruWave Pressure Monitoring Set</td>
			<td >Edwards Lifesciences</td>
			<td >PX260</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor

Store volum bløtvevsdefekter fører til funksjonelle underskudd og kan i stor grad påvirke pasientens livskvalitet. Selv om kirurgisk rekonstruksjon kan utføres ved hjelp av autolog fri klaffoverføring eller vaskularisert komposittallotransplantasjon (VCA), har slike metoder også ulemper. Problemer som morbiditet på donorstedet og vevstilgjengelighet begrenser autolog fri klaffoverføring, mens immunsuppresjon er en betydelig begrensning av VCA. Konstruert vev i rekonstruktiv kirurgi ved hjelp av decellularisering / recellulariseringsmetoder representerer en mulig løsning. Decellulariserte vev genereres ved hjelp av metoder som fjerner innfødt cellulært materiale samtidig som den underliggende ekstracellulære matrisen (ECM) mikroarkitekturen opprettholdes. Disse acellulære stillasene kan deretter recellulariseres med mottakerspesifikke celler.
Denne protokollen beskriver anskaffelses- og decellulariseringsmetodene som brukes til å oppnå acellulære stillaser i en grismodell. I tillegg gir den også en beskrivelse av perfusjonsbioreaktorens design og oppsett. Klaffene inkluderer porcine omentum, tensor fascia lata og den radiale underarmen. Decellularisering utføres via ex vivo perfusjon av lavkonsentrasjon natriumdodecylsulfat (SDS) vaskemiddel etterfulgt av DNase enzymbehandling og pereddiksyresterilisering i en tilpasset perfusjonsbioreaktor.
Vellykket vevsdecellularisering er preget av et hvitt ugjennomsiktig utseende av klaffer makroskopisk. Acellulære klaffer viser fravær av kjerner på histologisk farging og en signifikant reduksjon i DNA-innhold. Denne protokollen kan brukes effektivt til å generere decellulære bløtvevsstillas med bevart ECM og vaskulær mikroarkitektur. Slike stillaser kan brukes i senere recellulariseringsstudier og har potensial for klinisk oversettelse i rekonstruktiv kirurgi.

Denne protokollen for å decellularisere vaskulariserte svineklaffer er avhengig av perfusjon av et ionisk-basert vaskemiddel, SDS, gjennom klaffvaskulaturen i en tilpasset perfusjonsbioreaktor. Før decellularisering ble tre vaskulariserte klaffer i en svinemodell anskaffet og kanylert i henhold til deres viktigste forsyningsfartøy. Klaffene ble umiddelbart spylt etter anskaffelse for å opprettholde en patent, perfusabel vaskulatur for å muliggjøre vellykket decellularisering. Ved hjelp av lufttette snap-lokkbeholde...

Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor at JoVE.com

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Protokollen beskriver kirurgisk anskaffelse og påfølgende decellularisering av vaskulariserte svineklaffer ved perfusjon av natriumdodecylsulfatvaskemiddel gjennom klaffvaskulaturen i en tilpasset perfusjonsbioreaktor.

Innkjøp og perfusjon-decellularisering av svin vaskulariserte klaffer i en tilpasset perfusjonsbioreaktor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Denne metoden beskriver kirurgisk anskaffelse av tre vaskulariserte svineklaffer og deres påfølgende perfusjonsdecellularisering. Denne metoden kan hjelpe arbeidet med å regenerere svineklaffer ved hjelp av en vevsdecellulariserings- og recellulariseringsmetode. Den største fordelen med denne teknikken er dens allsidighet for å oppnå profusjonsdecellularisering på tvers av en rekke vaskulariserte svineklaffer i et enkelt å montere bioreaktoroppsett.Teknikken som er beskrevet her, kan i stor grad brukes på andre vaskulariserte klaffer som en potensiell vevsteknisk løsning ved bruk av svineklaffer i rekonstruktiv kirurgi. For å begynne, lag et innstrømnings- og utstrømningsrør ved å måle omtrent 50 centimeter LS16 platinabelagt silikonrør. Koble den ene enden til et gult 3-trinns pumperør og den andre til en steril 2 milliliter serologisk pipette for å bære perfusat fra vaskemiddelreservoarene inn i bioreaktorkammeret.Autoklav kammeret og slangene i individuelt innpakket steril emballasje. For innkjøp av omental klaff, plasser en 12 uker gammel bedøvet Yorkshire-gris i den bakre posisjonen, og forbered deretter magen på vanlig steril måte. Utfør en xipho-umbilical laparotomi for å komme inn i magen og mobilisere mage cephalad, og plasser omentum i det operative feltet.Fra venstre aspekt av den større krumningen, hvor venstre gastroepiploiske arterie går sammen med miltarterien, skeletoniserer venstre gastroepiploiske arterie og vene ved hjelp av rett Stevens tenotomi saks. Deretter ligate og dele begge separat ved hjelp av kirurgiske bånd eller klips. Fortsett langs den større krumningen i magen fra venstre til høyre for å ligere og dele de korte vaskulære grenene som oppstår fra omentumet, og gir større krumning i magen.Fortsett mobiliseringen av større omentum til krysset mellom de høyre gastroepiploiske karene og gastroduodenal arterien oppstår. Deretter ligate og dele høyre gastroepiploic arterie og vene for å frigjøre omental klaff og tillate klaffkanylering senere. For tensor fascia lata klaff anskaffelse, plasser grisen i lateral decubitus posisjon.Merk den indre klaffgrensen fra den fremre øvre iliac ryggraden, eller ASIS, mot lateral patella, og en bakre grense omtrent 8 til 10 centimeter kaudalt. Bruk en skalpell for å lage et skarpt snitt ved distalmarginen ved patellaen. Fordyp snittet gjennom det subkutane vevet for å nå fascia som ligger over rectus femoris, og fortsett snittene mot ASIS langs de markerte grensene.For å isolere den fascielle klaffen alene, fjern den overliggende hudkomponenten fra det underliggende fascialaget. Deretter ligerer eller cauterize små perforatorkar til huden. Gå tilbake til den distale grensen til klaffen, og skjær den dype fasciaen.Mobiliser fascia av den underliggende vastus lateralis-muskelen mot ASIS. Etter å ha sporet pedikelen mot de dype lårbenene, skjeletter den laterale circumflex femorale arterien og venen som forsyner den fasciale klaffen. Deretter ligate og dele klaffkar proksimalt, hvor de blir med i de dype lårbenene og tillater senere kanylering.For innkjøp av radial underarmsklaff, merk en 3 x 3 centimeter firkant på det radiale aspektet av en utvidet grisunderarm. Tegn en linje mellom midtpunktet i den proksimale klaffmargen og den antecubitale fossa for å betegne det omtrentlige forløpet av radialarteriepedikelen. Bekreft arterielt kurs med palpasjon.Deretter snitter huden ved hjelp av en skalpell på det distale aspektet med en dybde opp til antebrachial fascia. Stump dissekere med tenotomi saks til den distale radiale arterien og dens vena comitantes er oppstått. Deretter ligate og dele arterien og venene med kirurgiske bånd eller klips.Fortsett hudsnittene på de radiale og ulnare kantene av den markerte hudfirkanten. Mobiliser deretter klaffen av det underliggende radiale beinet med et kirurgisk blad eller cautery, og fortsett fra en ulnar til radial retning mens du hever hudklaffen proksimalt mot antecubital fossa. Ved hjelp av tenotomi saks, skeletonize den radiale arterien og vena comitantes proksimalt på antecubital fossa, hvor de blir med i henholdsvis brachialisarterien og venene.Disseker karene fra det omkringliggende fibro-fettvevet for å isolere vaskulær pedicle. Deretter ligate og dele arterien og venen separat for å frigjøre den radiale underarmsklaffen. Deretter kanylere pedicle fartøyene med 20 til 24-gauge angiocatheter sikret med 3-0 silkebånd.Skyll heparinisert saltvann inn i klaffen arteriell kanyle til en klar venøs utstrømning observeres. Mens du arbeider i et laminært strømningsbiosikkerhetsskap, plasser klaffer i bioreaktorvevskammeret. Prime innstrømningsrør med steril heparinisert saltvann for å fjerne gjenværende luft og ordne klaffer for å tillate forbindelse mellom klaffen arteriell kanyle og den mannlige luerkontakten.Bruk deretter sterile hemostater til å skru arteriekanylen på kontakten. Skyll deretter den hepariniserte saltvannet gjennom stoppekranen for å kontrollere at luerforbindelsen er uten lekkasjer, og at floppene kan perfunderes med tegn på venøs utstrømning. Etter å ha lukket vevskammerlokket, koble innstrømningsslangen med et gult 3-stopps pumperør til innstrømningsstoppekranen i vevskammeret.Fest også en inline trykksensortransduser til tilsiget 3-veis stoppekran for overvåking av perfusjonstrykk. Deretter slår du på den peristaltiske innstrømningspumpen, og på startskjermbildet går du til den tredje fanen ved hjelp av pilen for å sette rør-ID-en til 1,85 millimeter. Still deretter perfusjonshastigheten fra den andre fanen.Inngangshastigheten som leveringsmåte er satt til 2 milliliter per minutt. Kontroller at flytretningen er riktig som vist på skjermen. Legg 3-trinns pumpeslangen til den peristaltiske pumpen med en kompatibel kassett.Sett utstrømningspumpeinnstillingen til en hastighet på 4 milliliter per minutt. Koble utstrømningsslangen med et gult 3-trinns pumperør til utstrømningsstoppekranen i vevskammeret. Last deretter 3-trinns pumpeslangen til den peristaltiske pumpen, og start strømmen for begge pumpene ved å trykke på strømknappen på hver pumpe.Begynn perfusjonsdecellulariseringen av klaffer med heparinisert saltvann i vevskammeret i 15 minutter for å fjerne eventuelle tilbakeholdte blodpropper. Etter ferdigstillelse, erstatt resterende saltvann med 500 ml natriumdodecylsulfat, eller SDS, decellulariseringsløsning for å senke klaffen. Overfør deretter innstrømningsslangen til SDS-løsningen og rikelig vevet.Etter SDS-decellularisering, aspirer de resterende SDS før du perfuserer klaffen med PBS i en dag. Etter SDS perfusjon decellularisering, sekvensielt perfuse klaffene i DNA-løsning i to timer, og deretter i PBS i en dag, etterfulgt av overføring av innstrømningsslangen til pereddiksyre og etanol i destillert vann for å sterilisere klaffene ved perfusing i tre timer. Når du er ferdig, fjern klaffene aseptisk og senk dem i to vasker PBS som inneholder 1% antibiotika antimykotika i 15 minutter hver.Oppbevar klaffer ved 4 grader Celsius til de er klare for recellularisering. Bruk et 3 til 10 millimeter slagbiopsiverktøy for å skaffe vevsprøver for evaluering av decellulære klaffer. De isolerte decellulariserte klaffene som ble spylt under manuell kontroll, viste tegn på utstrømning fra den fritt drenerende venøse kanylen av omentum, tensor fascia lata og radial underarmsklaff.Den grove morfologien til det innfødte omentumet, tensor fascia lata og radiale underarmsklaffer virket rosa farget umiddelbart etter anskaffelsen. Til sammenligning var decellulært vev karakteristisk hvitt eller ugjennomsiktig i utseende. Histologisk undersøkelse av innfødte vev med hematoksylin og eosin viste tilstedeværelsen av blå kjerner.I decellulariserte klaffer viste histologisk farging tap av cellulært materiale uten blå nukleær farging, noe som indikerer et acellulært vevsstillas. Ytterligere kvantifisering av DNA-innhold viste en signifikant reduksjon i DNA i acellulære stillaser sammenlignet med innfødte vev. Det viktigste hensynet er en kirurgisk teknikk som brukes under anskaffelse, og pass på å unngå skade på klaffpedikelen for å tillate etterfølgende perfusjonsdecellularisering.Etter perfusjonsdecellularisering kan de resulterende klaffene recellulariseres med vevsspesifikke cellepopulasjoner for å regenerere de innfødte vevsrommene.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Prosedyre for Decellularization av svinekjøtt Heart av Retrograde Coronary Perfusjon

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Design av en Biaxial Mekanisk belastning bioreaktor for Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Drift av en Benkeplate bioreaktor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Konstruert vaskulariserte Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Bioprinting for utvikling Stangeriaceae vev og Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Bildestyrt bioreaktor for generering av bioingeniør luftveisvev

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

En pålitelig svin fascio-kutan klaffmodell for vaskularisert kompositt allografts bioengineering studier

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

A Friction Testing-Bioreactor Device for Study of Synovial Joint Biomechanics, Mechanobiology, and Physical Regulation

En friksjonstesting-bioreaktorenhet for studie av synovial leddbiomekanikk, mekanobiologi og fysisk regulering

In primary osteoarthritis (OA), normal 'wear and tear' associated with aging inhibits the ability of cartilage to sustain its load-bearing and lubrication ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Fabrikasjon av konstruerte vaskulære klaffer ved hjelp av 3D-utskriftsteknologier

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Multi-Stream perfusjonsbioreaktor integrert med utløpsfraksjonering for dynamisk cellekultur

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...