Name: procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor at JoVE.com

Todos os procedimentos envolvendo sujeitos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Rede de Saúde da Universidade (IACUC) e são realizados de acordo com o protocolo e os procedimentos do Centro de Recursos Animais da Rede de Saúde da Universidade e as Diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Cinco porcos Yorkshire (35-50 kg; idade aproximada de 12 semanas de idade) foram utilizados para todos os experimentos.
1. Fabricação de biorreator de perf...

<ol>
	<li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity:+A+Prospective+Study.">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li><li>Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+after+pedicled+or+free+TRAM+flap+surgery:+A+prospective+and+objective+study.">Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+free-style+flaps:+Risk+analysis+of+complications.">A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).</li><li>Issa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allograft-specific+characteristics+of+immune+responses.">Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses.</a> Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).</li><li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration.">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li><li>Iske, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+tissue+allotransplantation:+Opportunities+and+challenges.">Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges.</a> Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).</li><li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine.">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).</li><li>Colazo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applied+bioengineering+in+tissue+reconstruction,+replacement,+and+regeneration.">Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+in+tissue+engineering.">Vascularization in tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+skin/adipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps.">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li><li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+bioengineered+skin+flap+scaffold+with+a+perfusable+vascular+pedicle.">Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle.</a> Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).</li><li>Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+large-volume+human-derived+adipose+acellular+allogenic+flap+by+perfusion+decellularization.">Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+skeletal+muscle+as+a+three-dimensional+scaffold+with+a+vascular+network+template.">Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template.</a> Biomaterials. 89, 114-126 (2016).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+the+porcine+ear+generates+a+biocompatible,+nonimmunogenic+extracellular+matrix+platform+for+face+subunit+bioengineering.">Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering.</a> Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularization+of+human+ear+grafts+enables+ECM-based+scaffolds+for+auricular+vascularized+composite+tissue+engineering.">Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+a+human+face+graft:+The+matrix+of+identity.">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li><li>Haughey, B. H., Panje, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+for+multiple+musculocutaneous+flaps.">A porcine model for multiple musculocutaneous flaps.</a> The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).</li><li>Khachatryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap.">Radial Forearm Flap.</a> Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).</li><li>Hammouda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+nanostructure+of+SDS+micelles+in+water.">Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).</li><li>Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+a+fasciocutaneous+flap+for+use+as+a+perfusable+scaffold.">Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold.</a> Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).</li><li>Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+tissue+decellularization+used+for+preparation+of+biologic+scaffolds+and+in+vivo+relevance.">Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance.</a> Methods. 84, 25-34 (2015).</li><li>Mendibil, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+decellularization+methods:+Rationale+and+strategies+to+achieve+regenerative+compounds.">Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).</li><li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds:+A+systematic+review.">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).</li><li>Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+tissues+by+perfusion+decellularization/recellularization:+Review.">Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.</a> Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).</li><li>Adil, A., Xu, M., Haykal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recellularization+of+bioengineered+scaffolds+for+vascular+composite+allotransplantation.">Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation.</a> Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).</li><li>Phelps, E. A., Garc&#237;a, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+more+than+a+cell:+Vascularization+strategies+in+tissue+engineering.">Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).</li><li>Pozzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+porcine+fascio-cutaneous+flap+model+for+vascularized+composite+allografts+bioengineering+studies.">A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).</li><li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+repopulation+and+preparation+of+rodent+extracellular+matrix+scaffolds+for+renal+tissue+development.">Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).</li><li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system.">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li><li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+systems+and+devices:+State-of-the-art.">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li><li>Schilling, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+an+automatable,+3D+printed+perfusion+device+for+tissue+infusion+and+perfusion+engineering.">Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).</li></ol>

O protocolo proposto utiliza a perfusão de SDS de baixa concentração para descelularizar uma gama de retalhos derivados de suínos. Com este procedimento, o omento acelular, o tensor da fáscia lata e os retalhos radiais do antebraço podem ser descelularizados com sucesso usando um protocolo que favorece a SDS de baixa concentração. Experimentos preliminares de otimização determinaram que a SDS em baixa concentração (0,05%) entre 2 dias a 5 dias é capaz de remover material celular para o omento, tensor da fás...

A lesão traumática e a remoção do tumor podem levar a defeitos grandes e complexos dos tecidos moles. Esses defeitos podem prejudicar a qualidade de vida do paciente, causar perda de função e resultar em incapacidade permanente. Embora técnicas como a transferência autóloga do retalho tecidual tenham sido comumente praticadas, problemas com a disponibilidade do retalho e a morbidade do local doador são as principais limitações 1,2,3. O alotransplante composto vascularizado (VCA) é uma alternativa promissora que transfere tecidos compostos, por exemplo, músculo, pele, vasculatura, como uma única unidade para os receptores. No entanto, a VCA requer imunossupressão em longo prazo, o que leva à toxicidade medicamentosa, infecções oportunistas e neoplasias malignas 4,5,6.
Os andaimes acelulares de engenharia tecidual são uma solução potencial para essas limitações7. Os andaimes de tecido acelular podem ser obtidos usando métodos de descelularização, que removem o material celular dos tecidos nativos, preservando a microarquitetura da matriz extracelular subjacente (ECM). Em contraste com o uso de materiais sintéticos na engenharia de tecidos, o uso de andaimes biologicamente derivados oferece um substrato biomimético de ECM que permite a biocompatibilidade e o potencial de tradução clínica8. Após a descelularização, a subsequente recelularização de andaimes com células específicas do receptor pode gerar tecidos funcionais, vascularizados, com pouca ou nenhuma imunogenicidade 9,10,11. Ao desenvolver um protocolo eficaz para obter tecidos acelulares usando técnicas de descelularização por perfusão, uma ampla gama de tipos de tecidos pode ser projetada. Por sua vez, a construção desta técnica permite a aplicação em tecidos mais complexos. Até o momento, a descelularização perfusional de tecidos moles vascularizados tem sido investigada utilizando tecidos vascularizados simples, como retalho fasciocutâneo de espessura total em roedores 12, suínos13 e humanos14, bem como músculo esquelético reto abdominal suíno15. Além disso, tecidos vascularizados complexos também foram descelularizados por perfusão, como demonstrado nos modelos de orelha suína e humana 16,17 e nos modelos de enxerto de face inteira humana18.
Aqui, o protocolo descreve a descelularização de retalhos livres vascularizados utilizando andaimes de MEC derivados biologicamente. Apresentamos a descelularização de três retalhos clinicamente relevantes: 1) o omento, 2) o tensor fáscia lata e 3) o antebraço radial, todos representativos de retalhos de cavalos de trabalho utilizados rotineiramente em cirurgia reconstrutiva e não foram previamente examinados em estudos com animais no contexto da descelularização tecidual. Esses retalhos de bioengenharia oferecem uma plataforma versátil e prontamente disponível que tem o potencial para aplicações clínicas para uso no campo da reparação e reconstrução de grandes defeitos de tecidos moles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.2 &#181;m pore Acrodisk Filter</td>
			<td >VWR</td>
			<td >CA28143-310</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JF7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 L Polypropylene Carboy</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-62507-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>&#160;LS639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-way Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-30600-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Atropine Sulphate 15 mg/30ml</td>
			<td>Rafter 8 Products</td>
			<td>238481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 20-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 22-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 24-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS, 10X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-415-CL</td>
			<td>&#160;without Ca++/Mg++</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin, 1000 I.U./mL</td>
			<td>Leo Pharma A/S</td>
			<td>453811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine Hydrochloride&#160; 5000 mg/50 ml</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>612316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td>Internal Diameter:&#160; 1.85 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec REGLO 4-Channel Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>78001-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Tubing Cassettes</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-78016-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane 99.9%, 250 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2231929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Lennox</td>
			<td>Bioshop Canada</td>
			<td>LBL406.500</td>
			<td>Sterility testing agar plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Masterflex L/S 16 Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam 50 mg/10 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2242905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopolar Cautery Pencil</td>
			<td>Valleylab</td>
			<td>E2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Buffered Formalin, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#176;11 scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Connector for 1/4&#34; to 1/8&#34; Tube ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Tube 90&#176; Elbow Connectors</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Plugs</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K143</td>
			<td>Male Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Sockets</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K293</td>
			<td>Female Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Punch Biopsy Tool</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>3332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride 40 mEq/20 ml</td>
			<td>Hospira Healthcare Corporation</td>
			<td>37869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine, 10%</td>
			<td>Rougier</td>
			<td>833133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serological Pipet, 2mL</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Snap Lid Airtight Containers</td>
			<td>SnapLock</td>
			<td>142-3941-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical Metal Ligation Clips, Small</td>
			<td >Teleflex</td>
			<td >001200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >BC004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TruWave Pressure Monitoring Set</td>
			<td >Edwards Lifesciences</td>
			<td >PX260</td>
			<td></td>
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procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor

Defeitos de tecido mole de grande volume levam a déficits funcionais e podem afetar muito a qualidade de vida do paciente. Embora a reconstrução cirúrgica possa ser realizada usando transferência autóloga de retalho livre ou alotransplante composto vascularizado (VCA), tais métodos também apresentam desvantagens. Questões como morbidade no local do doador e disponibilidade tecidual limitam a transferência autóloga de retalho livre, enquanto a imunossupressão é uma limitação significativa da VCA. Tecidos modificados em cirurgia reconstrutiva utilizando métodos de descelularização/recelularização representam uma possível solução. Os tecidos descelularizados são gerados usando métodos que removem o material celular nativo, preservando a microarquitetura da matriz extracelular subjacente (ECM). Esses andaimes acelulares podem então ser subsequentemente recelularizados com células específicas do receptor.
Este protocolo detalha os métodos de aquisição e descelularização utilizados para alcançar andaimes acelulares em um modelo suíno. Além disso, também fornece uma descrição do projeto e configuração do biorreator de perfusão. Os retalhos incluem o omento suíno, o tensor da fáscia lata e o antebraço radial. A descelularização é realizada via perfusão ex vivo de detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) de baixa concentração, seguido de tratamento enzimático DNase e esterilização por ácido peracético em um biorreator de perfusão personalizado.
A descelularização tecidual bem-sucedida é caracterizada por uma aparência branco-opaca de retalhos macroscopicamente. Os retalhos acelulares mostram a ausência de núcleos na coloração histológica e uma redução significativa no conteúdo de DNA. Este protocolo pode ser usado de forma eficiente para gerar andaimes de tecidos moles descelularizados com MEC preservada e microarquitetura vascular. Tais andaimes podem ser utilizados em estudos subsequentes de recelularização e têm potencial para tradução clínica em cirurgia reconstrutiva.

Este protocolo de descelularização de retalhos suínos vascularizados baseia-se na perfusão de um detergente de base iônica, SDS, através da vasculatura do retalho em um biorreator de perfusão personalizado. Antes da descelularização, três retalhos vascularizados em modelo suíno foram colhidos e canulados de acordo com seus principais vasos fornecedores. Os retalhos foram imediatamente lavados após a aquisição, a fim de manter uma vasculatura patente e perfusível para permitir uma descelularização bem-suc...

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Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

O protocolo descreve a captação cirúrgica e subsequente descelularização de retalhos suínos vascularizados pela perfusão de detergente dodecil sulfato de sódio através da vasculatura do retalho em um biorreator de perfusão personalizado.

Aquisição e Perfusão-Descelularização de Flaps Vascularizados Suínos em Biorreator de Perfusão Customizado

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Este método descreve a captação cirúrgica de três retalhos suínos vascularizados e sua subsequente descelularização perfusional. Este método pode auxiliar os esforços para regenerar retalhos suínos usando uma abordagem de descelularização e recelularização tecidual. A principal vantagem desta técnica é a sua versatilidade para alcançar a descelularização da profusão através de uma variedade de retalhos suínos vascularizados em uma configuração de biorreator simples de montar.A técnica aqui descrita pode ser amplamente aplicada a outros retalhos vascularizados como uma potencial solução de engenharia tecidual utilizando retalhos suínos em cirurgia reconstrutiva. Para começar, faça uma tubulação de entrada e saída medindo aproximadamente 50 centímetros de tubulação de silicone revestida de platina LS16. Conecte uma extremidade a um tubo de bomba amarelo de 3 paradas e a outra a uma pipeta sorológica estéril de 2 mililitros para transportar o perfusato dos reservatórios de detergente para a câmara do biorreator.Autoclave a câmara e os tubos em embalagens estéreis embaladas individualmente. Para a obtenção do retalho omental, coloque um porco Yorkshire anestesiado de 12 semanas de idade na posição supina e, em seguida, prepare o abdômen da maneira estéril usual. Realizar uma laparotomia xifo-umbilical para entrar no abdômen e mobilizar o estômago cefálico, e colocar o omento no campo operatório.Começando pelo aspecto esquerdo da curvatura maior, onde a artéria gastroepiplóica esquerda se une à artéria esplênica, esqueletize a artéria e a veia gastroepiplóica esquerda usando tesouras de tenotomia de Stevens retas. Em seguida, ligue e divida ambos separadamente usando laços cirúrgicos ou clipes. Prossiga ao longo da maior curvatura do estômago da esquerda para a direita para ligar e dividir os ramos vasculares curtos que surgem do omento, suprindo a maior curvatura do estômago.Continue a mobilização do omento maior até que a junção dos vasos gastroepiplóicos direitos e da artéria gastroduodenal seja encontrada. Em seguida, ligue e divida a artéria e a veia gastroepiplóica direita para liberar o retalho omental e permitir a canulação do retalho mais tarde. Para a obtenção do retalho tensor da fáscia lata, coloque o porco na posição de decúbito lateral.Marque o limite do retalho interior da coluna ilíaca anterossuperior, ou ASIS, em direção à patela lateral, e um limite posterior de aproximadamente 8 a 10 centímetros caudalmente. Use um bisturi para fazer uma incisão afiada na margem distal na patela. Aprofunde a incisão através dos tecidos subcutâneos para alcançar a fáscia que recobre o reto femoral e continue as incisões em direção ao ASIS ao longo dos limites marcados.Para isolar o retalho fascial sozinho, remova o componente da pele sobrejacente da camada subjacente da fáscia. Em seguida, ligue ou cauterize pequenos vasos perfuradores à pele. Retorne à borda distal do retalho e incite a fáscia profunda.Mobilize a fáscia do músculo vasto lateral subjacente em direção ao ASIS. Depois de traçar o pedículo em direção aos vasos femorais profundos, esqueletizar a artéria e veia femoral circunflexa lateral que supre o retalho fascial. Em seguida, ligue e divida os vasos do retalho proximalmente, onde eles se juntam aos vasos femorais profundos e permitem a canulação posterior.Para a obtenção do retalho radial do antebraço, marque um quadrado de 3 por 3 centímetros no aspecto radial de um antebraço de porco estendido. Desenhe uma linha entre o ponto médio da margem do retalho proximal e a fossa antecubital para denotar o curso aproximado do pedículo da artéria radial. Confirme o curso arterial com palpação.Em seguida, incite a pele usando um bisturi no aspecto distal com uma profundidade até a fáscia antebraquial. Dissecar com tesoura de tenotomia até que a artéria radial distal e sua veia comitante sejam encontradas. Em seguida, ligue e divida a artéria e as veias com laços cirúrgicos ou clipes.Continue as incisões cutâneas nas margens radial e ulnar do quadrado da pele marcado. Em seguida, mobilize o retalho do osso radial subjacente com uma lâmina cirúrgica ou cauterização, procedendo de uma direção ulnar para radial enquanto eleva o retalho cutâneo proximalmente em direção à fossa antecubital. Usando tesoura de tenotomia, esqueletizar a artéria radial e a veia comitante proximalmente na fossa antecubital, onde se unem à artéria braquial e às veias, respectivamente.Dissecar os vasos dos tecidos fibro-gordurosos circundantes para isolar o pedículo vascular. Em seguida, ligue e divida a artéria e a veia separadamente para liberar o retalho radial do antebraço. Em seguida, canular os vasos pediculares com angiocateter de calibre 20 a 24 fixado com laços de seda 3-0.Lavar soro fisiológico heparinizado na cânula arterial do retalho até que se observe um fluxo venoso claro. Ao trabalhar em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar, coloque abas na câmara de tecido do biorreator. Tubo de entrada primário com solução salina heparinizada estéril para remover o ar residual e organizar os retalhos para permitir a conexão entre a cânula arterial do retalho e o conector luer masculino.Em seguida, use hemostatos estéreis para parafusar a cânula arterial no conector. Em seguida, lave a solução salina heparinizada através da torneira para verificar se a conexão luer está sem vazamentos e se os flops podem ser perfundidos com evidências de saída venosa. Depois de fechar a tampa da câmara de tecido, conecte a tubulação de entrada com uma tubulação de bomba amarela de 3 paradas à torneira de entrada da câmara de tecido.Além disso, conecte um transdutor de sensor de pressão em linha à torneira de 3 vias de entrada para monitoramento da pressão de perfusão. Em seguida, ligue a bomba peristáltica de entrada e, na tela inicial, vá para a terceira guia usando a seta para definir o ID da tubulação para 1,85 milímetros. Em seguida, defina a taxa de perfusão a partir da segunda guia.A taxa de entrada como o modo de entrega é definida como 2 mililitros por minuto. Verifique se a direção do fluxo está correta, conforme exibido na tela. Carregue a tubulação da bomba de 3 paradas na bomba peristáltica com um compatível.Defina a configuração da bomba de saída para uma taxa de 4 mililitros por minuto. Conecte a tubulação de saída com uma tubulação de bomba amarela de 3 paradas à torneira de saída da câmara de tecido. Em seguida, carregue a tubulação da bomba de 3 paradas na bomba peristáltica e inicie o fluxo para ambas as bombas pressionando o botão liga/desliga em cada bomba.Iniciar a descelularização perfusional dos retalhos com solução salina heparinizada na câmara tecidual por 15 minutos para remover quaisquer coágulos sanguíneos retidos. Após a conclusão, substitua a solução salina residual por 500 mililitros de dodecil sulfato de sódio, ou SDS, solução de descelularização para submergir o retalho. Em seguida, transfira a tubulação de entrada para a solução SDS e profuse o tecido.Após a descelularização do SDS, aspirar o SDS restante antes de perfundir o retalho com PBS por um dia. Após a descelularização da perfusão SDS, perfundir sequencialmente os retalhos em solução de DNA por duas horas e, em seguida, em PBS por um dia, seguido de transferência da tubulação de entrada em ácido peracético e etanol em água destilada para esterilizar os retalhos por perfusão por três horas. Uma vez feito, remova os retalhos assepticamente e mergulhe-os em duas lavagens de PBS contendo 1% de antibióticos antimicóticos por 15 minutos cada.Armazene as abas a 4 graus Celsius até que esteja pronto para a recelularização. Use uma ferramenta de biópsia por punção de 3 a 10 milímetros para obter amostras de tecido para avaliação de retalhos descelularizados. Os retalhos descelularizados isolados lavados sob controle manual demonstraram evidências de saída da cânula venosa de drenagem livre do omento, do tensor da fáscia lata e do retalho radial do antebraço.A morfologia macroscópica do omento nativo, do tensor da fáscia lata e dos retalhos radiais do antebraço apareceu de cor rosa imediatamente após a aquisição. Em comparação, os tecidos descelularizados eram caracteristicamente brancos ou opacos na aparência. O exame histológico dos tecidos nativos com hematoxilina e eosina mostrou a presença de núcleos azuis.Nos retalhos descelularizados, a coloração histológica revelou perda de material celular sem coloração nuclear azul, indicando um andaime tecidual acelular. A quantificação adicional do conteúdo de DNA mostrou uma diminuição significativa no DNA em andaimes acelulares em comparação com os tecidos nativos. A consideração mais importante é uma técnica cirúrgica utilizada durante a aquisição, tomando o cuidado de evitar danos ao pedículo do retalho, a fim de permitir a subsequente descelularização da perfusão.Após a descelularização da perfusão, os retalhos resultantes podem ser recelularizados com populações celulares específicas do tecido, a fim de regenerar os compartimentos teciduais nativos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Procedimento para decelularização do Coração Suínos por perfusão coronariana retrógrada

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Bioengenharia

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Funcionamento de um biorreator de bancada

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Projetado retalho do músculo vascularizada

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Bioreator guiado por imagem para geração de tecido das vias aéreas bioengenharia

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Um modelo confiável de retalho fasciocutâneo suíno para estudos de bioengenharia de aloenxertos compostos vascularizados

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

A Friction Testing-Bioreactor Device for Study of Synovial Joint Biomechanics, Mechanobiology, and Physical Regulation

Um dispositivo de teste de atrito-bioreator para estudo de biomecânica articular sinovial, mecanobiologia e regulação física

In primary osteoarthritis (OA), normal 'wear and tear' associated with aging inhibits the ability of cartilage to sustain its load-bearing and lubrication ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Fabricação de retalhos vasculares projetados usando tecnologias de impressão 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Bioreator de perfusão multi-fluxo integrado com fracionamento de saída para cultura celular dinâmica

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...