Name: procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor at JoVE.com

Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Red Universitaria de Salud (IACUC) y se realizan de acuerdo con el protocolo y los procedimientos del Centro de Recursos Animales de la Red Universitaria de Salud y las Pautas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Se utilizaron cinco cerdos de Yorkshire (35-50 kg; edad aproximada 12 semanas de edad) para todos los experimentos.
1. Fabricación de biorreactores ...

<ol>
	<li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity:+A+Prospective+Study.">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li><li>Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-site+morbidity+after+pedicled+or+free+TRAM+flap+surgery:+A+prospective+and+objective+study.">Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+free-style+flaps:+Risk+analysis+of+complications.">A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).</li><li>Issa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allograft-specific+characteristics+of+immune+responses.">Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses.</a> Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).</li><li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration.">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li><li>Iske, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+tissue+allotransplantation:+Opportunities+and+challenges.">Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges.</a> Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).</li><li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine.">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).</li><li>Colazo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applied+bioengineering+in+tissue+reconstruction,+replacement,+and+regeneration.">Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+in+tissue+engineering.">Vascularization in tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+skin/adipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps.">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li><li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+bioengineered+skin+flap+scaffold+with+a+perfusable+vascular+pedicle.">Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle.</a> Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).</li><li>Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. 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H., Panje, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+for+multiple+musculocutaneous+flaps.">A porcine model for multiple musculocutaneous flaps.</a> The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).</li><li>Khachatryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+Forearm+Flap.">Radial Forearm Flap.</a> Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).</li><li>Hammouda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+nanostructure+of+SDS+micelles+in+water.">Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).</li><li>Qu, J., Van Hogezand, R. 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Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).</li><li>Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+tissues+by+perfusion+decellularization/recellularization:+Review.">Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.</a> Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).</li><li>Adil, A., Xu, M., Haykal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recellularization+of+bioengineered+scaffolds+for+vascular+composite+allotransplantation.">Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation.</a> Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).</li><li>Phelps, E. A., Garc&#237;a, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+more+than+a+cell:+Vascularization+strategies+in+tissue+engineering.">Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).</li><li>Pozzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+porcine+fascio-cutaneous+flap+model+for+vascularized+composite+allografts+bioengineering+studies.">A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).</li><li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+repopulation+and+preparation+of+rodent+extracellular+matrix+scaffolds+for+renal+tissue+development.">Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).</li><li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system.">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li><li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+systems+and+devices:+State-of-the-art.">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li><li>Schilling, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+an+automatable,+3D+printed+perfusion+device+for+tissue+infusion+and+perfusion+engineering.">Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).</li></ol>

El protocolo propuesto utiliza la perfusión de SDS de baja concentración para descelularizar una gama de colgajos derivados de porcinos. Con este procedimiento, el epiplón acelular, el tensor de la fascia lata y los colgajos radiales del antebrazo se pueden descelularizar con éxito utilizando un protocolo que favorece la baja concentración de SDS. Los experimentos preliminares de optimización han determinado que la SDS a una concentración baja (0,05%) entre 2 días y 5 días es capaz de eliminar material celular p...

La lesión traumática y la extirpación del tumor pueden conducir a defectos grandes y complejos de tejidos blandos. Estos defectos pueden afectar la calidad de vida del paciente, causar pérdida de la función y provocar una discapacidad permanente. Si bien técnicas como la transferencia de colgajo de tejido autólogo se han practicado comúnmente, los problemas con la disponibilidad de colgajo y la morbilidad del sitio donante son limitaciones importantes 1,2,3. El alotrasplante compuesto vascularizado (ACV) es una alternativa prometedora que transfiere tejidos compuestos, por ejemplo, músculo, piel, vasculatura, como una sola unidad a los receptores. Sin embargo, VCA requiere inmunosupresión a largo plazo, lo que conduce a toxicidad farmacológica, infecciones oportunistas y neoplasias malignas 4,5,6.
Los andamios acelulares de ingeniería tisular son una solución potencial a estas limitaciones7. Los andamios de tejido acelular se pueden obtener utilizando métodos de descelularización, que eliminan el material celular de los tejidos nativos al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). En contraste con el uso de materiales sintéticos en la ingeniería de tejidos, el uso de andamios derivados biológicamente ofrece un sustrato de ECM biomimético que permite la biocompatibilidad y el potencial para la traducción clínica8. Después de la descelularización, la posterior recelularización de andamios con células específicas del receptor puede generar tejidos funcionales, vascularizados y con poca o ninguna inmunogenicidad 9,10,11. Mediante el desarrollo de un protocolo eficaz para obtener tejidos acelulares utilizando técnicas de descelularización de perfusión, se puede diseñar una amplia gama de tipos de tejidos. A su vez, la construcción de esta técnica permite la aplicación a tejidos más complejos. Hasta la fecha, la descelularización por perfusión de tejidos blandos vascularizados se ha investigado utilizando tejidos vascularizados simples, como un colgajo fasciocutáneo de espesor total en roedores 12, porcinos13 y modelos humanos 14, así como músculo esquelético recto abdominal porcino15. Además, los tejidos vascularizados complejos también han sido descelularizados por perfusión, como se demostró en los modelos de oído porcino y humano 16,17 y en los modelos de injerto de cara completa humana18.
Aquí, el protocolo describe la descelularización de colgajos libres vascularizados utilizando andamios de ECM derivados biológicamente. Presentamos la descelularización de tres colgajos clínicamente relevantes: 1) el epiplón, 2) el tensor de la fascia lata, y 3) el antebrazo radial, todos los cuales son representativos de los colgajos de caballo de batalla utilizados rutinariamente en cirugía reconstructiva y no han sido examinados previamente en estudios con animales en el contexto de la descelularización tisular. Estos colgajos de bioingeniería ofrecen una plataforma versátil y fácilmente disponible que tiene el potencial de aplicaciones clínicas para su uso en el campo de la reparación y reconstrucción de grandes defectos de tejidos blandos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.2 &#181;m pore Acrodisk Filter</td>
			<td >VWR</td>
			<td >CA28143-310</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JF7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 L Polypropylene Carboy</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-62507-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>&#160;LS639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-way Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-30600-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Atropine Sulphate 15 mg/30ml</td>
			<td>Rafter 8 Products</td>
			<td>238481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 20-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 22-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Angiocath 24-Gauge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD381112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS, 10X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-415-CL</td>
			<td>&#160;without Ca++/Mg++</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin, 1000 I.U./mL</td>
			<td>Leo Pharma A/S</td>
			<td>453811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine Hydrochloride&#160; 5000 mg/50 ml</td>
			<td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>612316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td>Internal Diameter:&#160; 1.85 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec REGLO 4-Channel Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>78001-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ismatec Tubing Cassettes</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-78016-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane 99.9%, 250 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2231929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Lennox</td>
			<td>Bioshop Canada</td>
			<td>LBL406.500</td>
			<td>Sterility testing agar plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>DNAse Co-factor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Masterflex L/S 16 Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam 50 mg/10 ml</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>2242905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopolar Cautery Pencil</td>
			<td>Valleylab</td>
			<td>E2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Buffered Formalin, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#176;11 scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Connector for 1/4&#34; to 1/8&#34; Tube ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Barbed Tube 90&#176; Elbow Connectors</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5117K76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Plugs</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K143</td>
			<td>Male Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Quick-Turn Tube Sockets</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K293</td>
			<td>Female Luer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Punch Biopsy Tool</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>3332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride 40 mEq/20 ml</td>
			<td>Hospira Healthcare Corporation</td>
			<td>37869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine, 10%</td>
			<td>Rougier</td>
			<td>833133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serological Pipet, 2mL</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Snap Lid Airtight Containers</td>
			<td>SnapLock</td>
			<td>142-3941-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical Metal Ligation Clips, Small</td>
			<td >Teleflex</td>
			<td >001200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >BC004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TruWave Pressure Monitoring Set</td>
			<td >Edwards Lifesciences</td>
			<td >PX260</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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procurement and perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized perfusion bioreactor

Los defectos de tejido blando de gran volumen conducen a déficits funcionales y pueden afectar en gran medida la calidad de vida del paciente. Aunque la reconstrucción quirúrgica se puede realizar mediante transferencia autóloga de colgajo libre o alotrasplante compuesto vascularizado (VCA), tales métodos también tienen desventajas. Problemas como la morbilidad del sitio donante y la disponibilidad de tejido limitan la transferencia autóloga de colgajo libre, mientras que la inmunosupresión es una limitación significativa de VCA. Los tejidos diseñados en cirugía reconstructiva utilizando métodos de descelularización/recelularización representan una posible solución. Los tejidos descelularizados se generan utilizando métodos que eliminan el material celular nativo al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). Estos andamios acelulares pueden ser posteriormente recelularizados con células específicas del receptor.
Este protocolo detalla los métodos de adquisición y descelularización utilizados para lograr andamios acelulares en un modelo de cerdo. Además, también proporciona una descripción del diseño y la configuración del biorreactor de perfusión. Los colgajos incluyen el epiplón porcino, la fascia lata tensora y el antebrazo radial. La descelularización se realiza mediante perfusión ex vivo de detergente de dodecil sulfato de sodio (SDS) de baja concentración, seguido de un tratamiento con enzimas DNasa y esterilización con ácido peracético en un biorreactor de perfusión personalizado.
La descelularización tisular exitosa se caracteriza por una apariencia blanco-opaca de colgajos macroscópicamente. Los colgajos acelulares muestran la ausencia de núcleos en la tinción histológica y una reducción significativa en el contenido de ADN. Este protocolo se puede utilizar de manera eficiente para generar andamios de tejidos blandos descelularizados con ECM preservada y microarquitectura vascular. Tales andamios se pueden utilizar en estudios posteriores de recelularización y tienen el potencial de traducción clínica en cirugía reconstructiva.

Este protocolo para descelularizar colgajos porcinos vascularizados se basa en la perfusión de un detergente de base iónica, SDS, a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado. Antes de la descelularización, se adquirieron tres colgajos vascularizados en un modelo porcino y se canularon de acuerdo con sus principales vasos suministradores. Las aletas se enjuagaron inmediatamente después de la adquisición para mantener una vasculatura patentada y perfusible para permitir una de...

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Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

El protocolo describe la obtención quirúrgica y la posterior descelularización de colgajos porcinos vascularizados mediante la perfusión de detergente dodecil sulfato de sodio a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado.

Obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Este método describe la obtención quirúrgica de tres colgajos porcinos vascularizados y su posterior descelularización por perfusión. Este método puede ayudar a los esfuerzos para regenerar colgajos porcinos utilizando un enfoque de descelularización y recelularización de tejidos. La principal ventaja de esta técnica es su versatilidad para lograr la descelularización por profusión a través de una variedad de colgajos porcinos vascularizados en una configuración de biorreactor simple de ensamblar.La técnica descrita aquí se puede aplicar ampliamente a otros colgajos vascularizados como una posible solución de ingeniería de tejidos utilizando colgajos porcinos en cirugía reconstructiva. Para comenzar, haga un tubo de entrada y salida midiendo aproximadamente 50 centímetros de tubo de silicona recubierto de platino LS16. Conecte un extremo a un tubo amarillo de bomba de 3 paradas y el otro a una pipeta serológica estéril de 2 mililitros para transportar perfusato desde los depósitos de detergente a la cámara del biorreactor.Autoclave la cámara y los tubos en envases estériles envueltos individualmente. Para la obtención de colgajo omental, coloque un cerdo Yorkshire anestesiado de 12 semanas de edad en posición supina y luego prepare el abdomen de la manera estéril habitual. Realizar una laparotomía xifo-umbilical para entrar en el abdomen y movilizar la cefalada estomacal, y colocar el epiplón en el campo operatorio.Comenzando en el aspecto izquierdo de la curvatura mayor, donde la arteria gastroepiploica izquierda se une a la arteria esplénica, esqueletizar la arteria gastroepiploica izquierda y la vena utilizando tijeras rectas de tenotomía de Stevens. Luego liga y divide ambos por separado usando lazos quirúrgicos o clips. Proceder a lo largo de la curvatura mayor del estómago de izquierda a derecha para ligar y dividir las ramas vasculares cortas que surgen del epiplón, suministrando la curvatura mayor del estómago.Continuar la movilización del epiplón mayor hasta que se encuentre la unión de los vasos gastroepiploicos derechos y la arteria gastroduodenal. Luego ligar y dividir la arteria gastroepiploica derecha y la vena para liberar el colgajo omental y permitir la canulación del colgajo más tarde. Para la obtención del colgajo tensor de la fascia lata, coloque el cerdo en la posición de decúbito lateral.Marque el límite interior del colgajo desde la espina ilíaca superior anterior, o ASIS, hacia la rótula lateral, y un límite posterior de aproximadamente 8 a 10 centímetros caudalmente. Use un bisturí para hacer una incisión aguda en el margen distal en la rótula. Profundice la incisión a través de los tejidos subcutáneos para llegar a la fascia que recubre el recto femoral, y continúe las incisiones hacia el ASIS a lo largo de los límites marcados.Para aislar solo el colgajo fascial, retire el componente de la piel suprayacente de la capa subyacente de la fascia. Luego ligar o cauterizar pequeños vasos perforadores a la piel. Regrese al borde distal del colgajo e incise la fascia profunda.Movilizar la fascia del músculo vasto lateral subyacente hacia el ASIS. Después de trazar el pedículo hacia los vasos femorales profundos, esqueletizar la arteria femoral circunfleja lateral y la vena que suministra el colgajo fascial. Luego ligan y dividen los vasos colgajos proximalmente, donde se unen a los vasos femorales profundos y permiten una canulación posterior.Para la adquisición del colgajo radial del antebrazo, marque un cuadrado de 3 por 3 centímetros en el aspecto radial de un antebrazo de cerdo extendido. Dibuje una línea entre el punto medio del margen del colgajo proximal y la fosa antecubital para denotar el curso aproximado del pedículo de la arteria radial. Confirmar el curso arterial con palpación.A continuación, incide la piel con un bisturí en la cara distal con una profundidad hasta la fascia antebraquial. Disección contundente con tijeras de tenotomía hasta encontrar la arteria radial distal y su vena comitantes. Luego ligar y dividir la arteria y las venas con lazos quirúrgicos o clips.Continúe las incisiones cutáneas en los márgenes radial y cubital del cuadrado marcado de la piel. Luego movilice el colgajo del hueso radial subyacente con una cuchilla quirúrgica o cauterización, procediendo de una dirección cubital a radial mientras eleva el colgajo de piel proximalmente hacia la fosa antecubital. Usando tijeras de tenotomía, esqueletizar la arteria radial y la vena comitantes proximalmente en la fosa antecubital, donde se unen la arteria braquial y las venas, respectivamente.Diseccionar los vasos de los tejidos fibrograsos circundantes para aislar el pedículo vascular. Luego ligar y dividir la arteria y la vena por separado para liberar el colgajo radial del antebrazo. A continuación, cannule los vasos pediculares con un angiocatéter de calibre 20 a 24 asegurado con lazos de seda 3-0.Enjuague la solución salina heparinizada en la cánula arterial del colgajo hasta que se observe una salida venosa clara. Mientras trabaja en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar, coloque colgajos en la cámara de tejido del biorreactor. Tubo de entrada primario con solución salina heparinizada estéril para eliminar el aire residual y colocar colgajos para permitir la conexión entre la cánula arterial del colgajo y el conector luer macho.Luego use hemostáticos estériles para atornillar la cánula arterial en el conector. Luego enjuague la solución salina heparinizada a través de la llave de paso para verificar que la conexión luer no tenga fugas y que los flops puedan perfundirse con evidencia de flujo venoso. Después de cerrar la tapa de la cámara de tejido, conecte el tubo de entrada con un tubo amarillo de bomba de 3 paradas a la llave de paso de entrada de la cámara de tejido.Además, conecte un transductor de sensor de presión en línea a la llave de paso de 3 vías de entrada para el monitoreo de la presión de perfusión. A continuación, encienda la bomba peristáltica de entrada y, en la pantalla inicial, vaya a la tercera pestaña usando la flecha para ajustar el ID del tubo a 1,85 milímetros. A continuación, establezca la velocidad de perfusión desde la segunda pestaña.La velocidad de entrada como modo de entrega se establece en 2 mililitros por minuto. Asegúrese de que la dirección del flujo sea correcta como se muestra en la pantalla. Cargue el tubo de la bomba de 3 pasos en la bomba peristáltica con un cassette compatible.Ajuste la configuración de la bomba de salida a una velocidad de 4 mililitros por minuto. Conecte el tubo de salida con un tubo amarillo de bomba de 3 paradas a la llave de paso de salida de la cámara de tejido. Luego cargue el tubo de la bomba de 3 paradas en la bomba peristáltica y comience el flujo para ambas bombas presionando el botón de encendido en cada bomba.Comience la descelularización de perfusión de colgajos con solución salina heparinizada en la cámara del tejido durante 15 minutos para eliminar cualquier coágulo de sangre retenido. Al finalizar, reemplace la solución salina residual con 500 mililitros de dodecil sulfato de sodio, o SDS, solución de descelularización para sumergir el colgajo. A continuación, transfiera el tubo de entrada a la solución SDS y profunde el tejido.Después de la descelularización de SDS, aspire la SDS restante antes de perfundir el colgajo con PBS durante un día. Después de la descelularización por perfusión de SDS, perfundir secuencialmente los colgajos en solución de ADN durante dos horas, y luego en PBS durante un día, seguido de transferir el tubo de entrada a ácido peracético y etanol en agua destilada para esterilizar los colgajos perfundiendo durante tres horas. Una vez hecho esto, retire los colgajos asépticamente y sumérjalos en dos lavados de PBS que contienen antibióticos antimicóticos al 1% durante 15 minutos cada uno.Guarde los colgajos a 4 grados centígrados hasta que estén listos para la recelularización. Utilice una herramienta de biopsia por punción de 3 a 10 milímetros para obtener muestras de tejido para la evaluación de colgajos descelularizados. Los colgajos descelularizados aislados enjuagados bajo control manual demostraron evidencia de salida de la cánula venosa de drenaje libre del epiplón, el tensor de la fascia lata y el colgajo radial del antebrazo.La morfología macroscópica del epiplón nativo, el tensor de la fascia lata y las aletas radiales del antebrazo aparecieron de color rosado inmediatamente después de la adquisición. En comparación, los tejidos descelularizados eran característicamente blancos u opacos en apariencia. El examen histológico de los tejidos nativos con hematoxilina y eosina mostró la presencia de núcleos azules.En colgajos descelularizados, la tinción histológica reveló pérdida de material celular sin tinción nuclear azul, lo que indica un andamio de tejido acelular. La cuantificación adicional del contenido de ADN mostró una disminución significativa en el ADN en los andamios acelulares en comparación con los tejidos nativos. La consideración más importante es una técnica quirúrgica utilizada durante la obtención, teniendo cuidado de evitar daños en el pedículo del colgajo para permitir la posterior descelularización de la perfusión.Después de la descelularización por perfusión, los colgajos resultantes pueden ser recelularizados con poblaciones celulares específicas de tejido para regenerar los compartimentos de tejido nativo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Procedimiento para descelularización de corazón porcino por perfusión coronaria retrógrada

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Investigación

Bioingeniería

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Diseño de un Carga mecánica Biaxial biorreactor para Ingeniería de Tejidos

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

La operación de un biorreactor de sobremesa

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Diseñado vascularizado colgajo de músculo

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularizado de Bioprinting de microfluidos para la ingeniería de tejidos y organitas

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Biorreactor guiado por imágenes para generar tejido biodiseñado de las vías respiratorias

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Un modelo confiable de colgajo fascio-cutáneo porcino para estudios de bioingeniería de aloinjertos compuestos vascularizados

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

A Friction Testing-Bioreactor Device for Study of Synovial Joint Biomechanics, Mechanobiology, and Physical Regulation

Un dispositivo de prueba de fricción-biorreactor para el estudio de la biomecánica de la articulación sinovial, la mecanobiología y la regulación física

In primary osteoarthritis (OA), normal 'wear and tear' associated with aging inhibits the ability of cartilage to sustain its load-bearing and lubrication ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Fabricación de colgajos vasculares de ingeniería utilizando tecnologías de impresión 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Biorreactor de perfusión multiflujo integrado con fraccionamiento de salida para cultivo celular dinámico

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...