Name: procurement and decellularization of rat hindlimbs using an ex vivo perfusion-based bioreactor for vascularized composite allotransplantation
Uploaded: 2022-06-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation at JoVE.com

Abbildung 3A wurde BioRender.com erstellt.

Leichenförmige männliche Lewis-Ratten (300-430 g), die vom Toronto General Hospital Research Institute erhalten wurden, wurden für alle Experimente verwendet. Für alle chirurgischen Eingriffe wurden sterile Instrumente und Verbrauchsmaterialien verwendet, um die aseptische Technik aufrechtzuerhalten (siehe Materialtabelle). Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care Committee am Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Kan...

<ol>
	<li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration.">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+a+human+face+graft:+The+matrix+of+identity.">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+skin/adipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps.">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li><li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).</li><li>Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+rat+hind+limb+transplant+as+an+experimental+model+of+vascularized+composite+allotransplantation:+Approaches+and+advantages.">Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages.</a> SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).</li><li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+and+disinfection+methods+for+decellularized+matrix+materials:+Review,+consideration+and+proposal.">Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal.</a> Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).</li><li>Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+decellularized+liver+scaffolds+and+recellularized+liver+grafts.">Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts.</a> Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).</li><li>Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+generation+of+bioreactors+that+advance+extracellular+matrix+modelling+and+tissue+engineering.">New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering.</a> Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).</li><li>Cohen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+vascular+chimerism+within+donor+organs.">Generation of vascular chimerism within donor organs.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).</li><li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds:+A+systematic+review.">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularised+skeletal+muscles+allow+functional+muscle+regeneration+by+promoting+host+cell+migration.">Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).</li><li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+composite+tissue+as+a+bioartificial+limb+graft.">Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft.</a> Biomaterials. 61, 246-256 (2015).</li></ol>

Rattenhinterbeine sind als experimentelle Modelle in VCA5 nützlich. Das Tissue Engineering von azellulären Gerüsten stellt den ersten Schritt dar, um die Mängel langfristiger Immunsuppressionsregime im Zusammenhang mit VCA zu beheben. Die Verwendung von Komposittransplantaten stellt eine zusätzliche Herausforderung dar, da mehrere Gewebe vorhanden sind, von denen jedes einzigartige funktionelle, immunogene und strukturelle Eigenschaften aufweist. Das vorliegende Protokoll zeigt eine erfolgrei...

VCA ist eine neue Option für Patienten, die eine komplexe chirurgische Rekonstruktion benötigen. Traumatische Verletzungen oder Tumorresektionen führen zu einem volumetrischen Gewebeverlust, der schwer zu rekonstruieren ist. VCA bietet die Transplantation mehrerer Gewebe wie Haut, Knochen, Muskeln, Nerven und Gefäße als zusammengesetztes Transplantat von einem Spender an einen Empfängeran 1. Trotz seiner vielversprechenden Natur ist VCA aufgrund langfristiger immunsuppressiver Therapien begrenzt. Der lebenslange Gebrauch solcher Medikamente führt zu einem erhöhten Risiko für opportunistische Infektionen, Malignome und Endorgantoxizität 1,2,3. Um die Notwendigkeit einer Immunsuppression zu reduzieren und / oder zu eliminieren, sind Tissue-Engineering-Gerüste mit Dezellularisierungsansätzen für VCA vielversprechend.
Die Dezellularisierung des Gewebes beinhaltet die Beibehaltung der extrazellulären Matrixstruktur bei gleichzeitiger Entfernung des zellulären und nukleären Inhalts. Dieses dezellularisierte Gerüst kann mit patientenspezifischen Zellen wieder bevölkert werden4. Die Erhaltung des ECM-Netzwerks aus zusammengesetzten Geweben ist jedoch eine zusätzliche Herausforderung. Dies ist auf das Vorhandensein mehrerer Gewebetypen mit unterschiedlichen Gewebedichten, Architekturen und anatomischen Positionen innerhalb eines Gerüsts zurückzuführen. Das vorliegende Protokoll bietet eine Operationstechnik und eine Dezellularisierungsmethode für eine Rattenhinterbeine. Dies ist ein Proof-of-Concept-Modell für die Anwendung dieser Tissue-Engineering-Technik auf zusammengesetzte Gewebe. Dies kann auch zu nachfolgenden Bemühungen führen, Kompositgewebe durch Rezellularisierung zu regenerieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL</td>
			<td>Baxter Corporation</td>
			<td>JB1308M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Disposable Serological Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75816-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cc Disposable Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Stopcock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5cc Disposable Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropyl Alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28143-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter 24 G 19 mm (&#190;&#8221;)&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>38112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutter</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12029-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connectors for&#160; 1/16&#34; to 1/8&#34; Tubes</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>5117K52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8&#34; ID</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>51525K328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps with Micro-Blunted Tips</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL</td>
			<td>LEO Pharma Inc.</td>
			<td>006174-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8&#34; ID</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>51525K322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle Holder</td>
			<td>WLorenz</td>
			<td>04-4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>WLorenz</td>
			<td>SP-4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>269336-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump, 3-Channel</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-78001-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Surgical Scrub Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade - #10</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: &#62;99%, 1 kg</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SDS003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Suture #6-0</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VS889</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procurement and decellularization of rat hindlimbs using an ex vivo perfusion-based bioreactor for vascularized composite allotransplantation

Patienten mit schweren traumatischen Verletzungen und Gewebeverlust benötigen eine komplexe chirurgische Rekonstruktion. Vaskularisierte Komposit-Allotransplantation (VCA) ist ein sich entwickelnder rekonstruktiver Weg zum Transfer mehrerer Gewebe als zusammengesetzte Untereinheit. Trotz der vielversprechenden Natur von VCA sind die langfristigen immunsuppressiven Anforderungen aufgrund des erhöhten Risikos von Malignomen, Endorgantoxizität und opportunistischen Infektionen eine signifikante Einschränkung. Das Tissue Engineering von azellulären Kompositgerüsten ist eine mögliche Alternative zur Verringerung des Bedarfs an Immunsuppression. Hierin wird die Beschaffung eines Rattenhinterbeins und dessen anschließende Dezellularisierung unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) beschrieben. Die vorgestellte Beschaffungsstrategie basiert auf der Arteria femoralis. Ein maschinelles perfusionsbasiertes Bioreaktorsystem wurde konstruiert und zur ex vivo Dezellularisierung der Hinterbeine eingesetzt. Eine erfolgreiche Perfusionsdezellularisierung wurde durchgeführt, was zu einem weißen, durchscheinenden Aussehen der Hinterbeine führte. Ein intaktes, perfusierbares, vaskuläres Netzwerk in der gesamten Hinterbeine wurde beobachtet. Histologische Analysen zeigten die Entfernung von Kerninhalten und die Erhaltung der Gewebearchitektur über alle Gewebekompartimente hinweg.

Das Beschaffungsprotokoll war erfolgreich bei der Isolierung und Kanülierung der gemeinsamen Oberschenkelarterien für nachfolgende Perfusionsschritte. Die repräsentativen Dissektionsbilder in Abbildung 1A,B zeigen die Inzisionslage und Exposition der Femurgefäße mit ausreichendem Abstand zu den Bifurkationspunkten. Abbildung 2 zeigt die Apparatur, die für die Vorbereitung des Bioreaktors und des Perfusionskreislaufs erforderlich ist. Der ...

Watch this Scientific Journal Video about Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation at JoVE.com

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Wir beschreiben die Operationstechnik und den Dezellularisierungsprozess für zusammengesetzte Rattenhinterbeine. Die Dezellularisierung erfolgt unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat mit niedriger Konzentration durch ein Ex-vivo-Maschinenperfusionssystem.

Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Wir haben ein Kleintiermodell für die Dezellularisierung einer Extremität etabliert. Dies ist nützlich, um die Proof-of-Concept-Forschung zur De- und Rezellularisierung von vaskularisierten Kompositgeweben zu erleichtern. Immunsuppressionsschemata sind eine der Haupteinschränkungen bei der vaskularisierten Komposit-Allotransplantation.Die Immunogenität des Gewebes kann durch Dezellularisierung reduziert werden. Um zu beginnen, machen Sie einen Hautschnitt mit einer chirurgischen Klinge Nummer 10 entlang des Leistenbandes, bewegen Sie sich von einer lateralen zu einer medialen Richtung, während Sie die umgebende Haut mit Adson Pinzette halten. Wenn das darunter liegende Fett freigelegt ist, verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um das Fett sorgfältig zu sezieren und die oberen Oberbauchgefäße zu lokalisieren.Mit einer Mikroschere proximal sezieren und den darunter liegenden Oberschenkelnerv, die Arterie und die Vene auf Leistenbandebene freilegen. Identifizieren Sie unter einem Dissektionsmikroskop die Femurgefäße und sezieren Sie die Arterie und Vene proximal mit feinen Pinzetten, um eine ausreichende Länge von den Bifurkationspunkten des arteriellen Netzwerks zu erhalten. Dann ligieren Sie die Oberschenkelvene und die Arterie separat mit 6-0-Nähten.Als nächstes führen Sie eine umlaufende Dissektion um den Rest der Hinterbeine durch, ohne die ligierten Femurgefäße zu stören, und durchqueren Sie den Oberschenkelknochen in der Mitte mit einem Knochenschneider. Um die Hinterbeine vollständig zu isolieren, transektieren Sie die ligierten Femurgefäße distal zu den Ligaturen mit einer Mikroschere und kanülieren Sie die Oberschenkelarterie mit einem 24-Gauge-Angiokatheter unter dem Dissektionsmikroskop. Dann mit heparinisierter Kochsalzlösung spülen, bis ein deutlicher Abfluss aus der Oberschenkelvene beobachtet wird.Sichern Sie die Kanüle, indem Sie eine Naht um das kanülierte Gefäß in einer anderen Naht distal um die Kanüle selbst binden und sicherstellen, dass die Kanüle in der Nähe platziert wird, um eine Blockierung der Gabelungspunkte zu verhindern. Danach tauchen Sie die beschafften Hinterbeine und PBS bis zur Dezellularisierung ein. Um den Bioreaktor zu konstruieren, platzieren Sie die sterilisierte Kammer und schrauben Sie drei Einweg-Dreiwege-Absperrhähne an den Einlass-, Auslass- und Nachschubleitungen, um sicherzustellen, dass der Absperrhahn für den Nachfüllanschluss an den verbleibenden zwei Anschlüssen verschlossen ist, um ein Auslaufen zu verhindern.Befestigen Sie die zuvor hergestellten Silikonschläuche an den Absperrhähnen an den Ein- und Auslassleitungen. Verbinden Sie dann den Schlauch mit den Silikonschläuchen. Nachdem Sie die Kassette auf dem Schlauch befestigt haben, legen Sie sie auf die Schlauchpumpe.Als nächstes verbinden Sie einen der Silikonschläuche mit dem Ende des Schlauchs der Auslassleitung aus dem obigen Schritt. Schließen Sie am anderen Ende eine serologische Ein-Milliliter-Pipette an und suspendieren Sie das Ende mit einer serologischen Pipette im Abfallbehälterkolben. Als nächstes hängen Sie das Ende des Röhrchens, das an der serologischen Pipette befestigt ist, in den Waschmittelbehälter und verschließen sofort die Öffnung des Waschmittelbehälterkolbens mit Parafilm.0,25% SDS aus dem Ein-Liter-Glasgefäß auf halber Höhe in die Bioreaktorkammer geben. Nehmen Sie dann das beschaffte Hinterbein mit einer Adson-Pinzette und hängen Sie es vorsichtig in die Bioreaktorkammer auf. Führen Sie den kanülierten Teil der Hinterbeine mit zwei Paar Adson-Pinzetten zur Einlasslinie, während Sie die Kanüle mit einer Pinzette halten.Verwenden Sie die andere Pinzette, um die Einlassleitung an der Kanüle zu drehen und zu befestigen. Fügen Sie nach dem Sichern weitere 0,25% SDS aus dem Ein-Liter-Glasgefäß hinzu, um die Extremität nach Bedarf vollständig einzutauchen, um sicherzustellen, dass der Auslassanschluss auch in das Bioreaktorreservoir eingetaucht ist und ein gleichmäßiger Abfluss aufrechterhalten wird. Befestigen Sie dann einen Einwegspritzenfilter an der Belüftungsöffnung am Deckel der Bioreaktorkammer und befestigen Sie den Deckel am Bioreaktor, um sicherzustellen, dass die Kammer von allen Seiten abgedichtet ist.Um Luft aus dem Schlauch zu entfernen und den Perfusionskreislauf anzusaugen, verwenden Sie eine neue 10-Milliliter-Einwegspritze, um Reinigungsmittel aus dem Waschmittelbehälter mit einem Dreiwegehahn an der Einlassleitung zu ziehen. Verwenden Sie nach dem Ziehen die gleiche Flüssigkeit, um sie in den Dreiwegehahn an der Auslassleitung einzuführen. Als nächstes drücken und befestigen Sie die Kassetten mit dem Schlauch in der Schlauchpumpe.Schalten Sie dann die Schlauchpumpe mit dem Netzschalter ein. Fahren Sie auf dem Bildschirm der Schlauchpumpe mit der Pfeiltaste zur zweiten Registerkarte fort, um die Perfusionsrate für den ersten Kanal mit der Eingangsdurchflussrate als Lieferart einzustellen, und stellen Sie die Perfusionsrate auf einen Milliliter pro Minute ein, um sicherzustellen, dass die Strömungsrichtung entsprechend der Gerätekonfiguration korrekt ist. Kalibrieren Sie die Schlauchpumpe, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeitsmenge, die durch die Einlassleitung geliefert wird, und/oder die aus der Auslassleitung entnommen wird, konsistent zwischen den beiden fließt, um sicherzustellen, dass die Schlauch-ID auf 1,85 Millimeter eingestellt ist.Beginnen Sie mit der Dezellularisierung über Maschinenperfusion bei einem Milliliter pro Minute sowohl für die Einlass- als auch für die Ausgangsleitungen, indem Sie den Netzschalter auf der Tastatur drücken. Überwachen und stellen Sie sicher, dass der Durchfluss sowohl an den Einlass- als auch an den Auslassleitungen kontinuierlich ist. Verwenden Sie 1 Liter 0,25% STS, füllen Sie das Bioreaktorreservoir nach Bedarf durch den Nachfüllanschluss auf.Suchen Sie dann nach einem weißen, durchscheinenden Aussehen des Gewebes, das am fünften Tag erscheint, was auf eine Dezellularisierung der Hinterbeine der Ratte hinweist. Nach Bestätigung der Dezellularisierung ersetzen Sie das Waschmittelreservoir durch das PBS- und 1%Antibiotic-Antimycotic-Reservoir und verschließen die Öffnung des Kolbens mit Parafilm. Beginnen Sie PBS und 1% Antibiotika-Antimykotische Perfusion bei einem Milliliter pro Minute und fahren Sie zwei Tage lang fort.Ersetzen Sie das PBS- und 1%Antibiotika-Antimykotika-Reservoir durch 200 Milliliter 0,1%Parasitensäure, 4%Ethanolreservoir und beginnen Sie zwei Stunden lang mit der Perfusion bei einem Milliliter pro Minute. Trennen Sie die Hinterbeine unter einer Biosicherheitswerkbank von der Einlassleitung mit zwei Paaren steriler Adson-Pinzetten mit einer Pinzette, um die Einlassleitung zu drehen, und der anderen, die die Kanüle hält, um sicherzustellen, dass die Kanüle nicht gezogen wird, um eine Dekanülierung zu verhindern. Lagern Sie die Extremität in einem 500-Milliliter-Glasgefäß mit PBS und 1% Antibiotikum-Antimykotikum bei 4 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung.Sowohl die dezellularisierte Oberschenkelarterie als auch die Vene zeigten einen Verlust des Kerngehalts in allen Schichten und im umgebenden Bindegewebe, da in den nativen Gefäßen keine blau gefärbten Kerne vorhanden waren. Die Tunica intima media und die Adventitia sowohl der Oberschenkelvene als auch der Arterien wurden in den dezellularisierten Gefäßen aufrechterhalten. Der Femurnerv zeigte eine Erhaltung der Gewebestruktur, einschließlich des Endoneuriums.Der Knochen zeigte eine allgemeine strukturelle Retention mit Verlust von gefärbten Kernen von Osteozyten und von umgebenden Endosteum- und Periostschichten nach der Dezellularisierung. Die Haut zeigte einen Zellverlust aus Epidermis und Dermis. Die Dermis zeigte zurückgehaltene Kollagenfasern, die nativem Hautgewebe ähnelten.Schließlich zeigte die Queransicht der Skelettmuskulatur den Verlust von Kernen, die sich sonst in den Peripherien des Endomysiums befinden. Der Myofibrillengehalt blieb nach der Dezellularisierung in den jeweiligen Faszikeln erhalten. Es wurde auch eine DNA-Quantifizierung mit PicoGreen durchgeführt, bei der der DNA-Gehalt über die Oberschenkelgefäße, Nerven, Haut, Muskeln und Knochen signifikant reduziert wurde.Nach diesem Protokoll kann die dezellularisierte Extremität weiter charakterisiert werden. Dies beinhaltet die Untersuchung der extrazellulären Matrix sowohl mit histologischen als auch mit biochemischen Methoden und die Beurteilung der vaskulären Matrix mittels Bildgebung. Der dezellularisierte Stamm kann auch mit gewebespezifischen Zellen rezellularisiert werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Betrieb einer Tischbioreaktor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization und Recellularization Methoden für menschliche Saphenous Adern

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Eine neuartige Operationstechnik als Grundlage für In Vivo teilweise Leber Engineering in der Ratte

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Ein zuverlässiges schweinisches Faszien-Hautlappenmodell für vaskularisierte Komposit-Allografts Bioengineering-Studien

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...