Name: procurement and decellularization of rat hindlimbs using an ex vivo perfusion-based bioreactor for vascularized composite allotransplantation
Uploaded: 2022-06-09T15:00:00
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그림 3A 는 BioRender.com 년에 작성되었습니다.

토론토 종합병원 연구소로부터 입수한 사체 수컷 루이스 래트(300-430 g)를 모든 실험에 사용하였다. 모든 수술 절차에서 무균 기술을 유지하기 위해 멸균 도구와 용품이 사용되었습니다( 재료 표 참조). 모든 절차는 토론토 종합 병원 연구소, 대학 건강 네트워크 (토론토, 온타리오, 캐나다)의 동물 관리위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 총 4 개의 뒷다리가 탈세포화되었습니다.
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쥐 뒷다리는 VCA5에서 실험 모델로 유용합니다. 무세포 스캐폴드의 조직 공학은 VCA와 관련된 장기 면역억제 요법의 단점을 해결하는 첫 번째 단계입니다. 복합 이식편의 사용은 각각 고유한 기능, 면역원성 및 구조적 특성을 갖는 여러 조직의 존재를 고려할 때 추가적인 문제를 제기합니다. 본 프로토콜은 무세포 복합 래트 뒷다리를 얻기 위한 성공적인 방법을 나타낸다. 이러한 ?...

VCA는 복잡한 외과적 재건이 필요한 환자를 위한 새로운 옵션입니다. 외상성 부상이나 종양 절제술은 재건하기 어려울 수 있는 체적 조직 손실을 초래합니다. VCA는 피부, 뼈, 근육, 신경 및 혈관과 같은 여러 조직을 기증자로부터 수혜자1에게 복합 이식편으로 이식하는 것을 제공합니다. 유망한 특성에도 불구하고 VCA는 장기간의 면역 억제 요법으로 인해 제한적입니다. 이러한 약물을 평생 사용하면 기회 감염, 악성 종양 및 말단 장기 독성의 위험이 증가합니다 1,2,3. 면역억제의 필요성을 감소 및/또는 제거하는 데 도움이 되도록 VCA에 대한 탈세포화 접근법을 사용하는 조직 공학 스캐폴드는 큰 가능성을 보여줍니다.
조직 탈세포화는 세포 및 핵 내용물을 제거하면서 세포외 기질 구조를 유지하는 것을 수반합니다. 이 탈세포화된 스캐폴드는 환자-특이적 세포4로 재채워질 수 있다. 그러나 복합 조직의 ECM 네트워크를 보존하는 것은 추가적인 과제입니다. 이것은 스캐폴드 내에서 다양한 조직 밀도, 구조 및 해부학적 위치를 가진 여러 조직 유형이 존재하기 때문입니다. 본 프로토콜은 래트 뒷다리에 대한 수술 기술 및 탈세포화 방법을 제공한다. 이것은 이 조직 공학 기술을 복합 조직에 적용하기 위한 개념 증명 모델입니다. 이것은 또한 재세포화를 통해 복합 조직을 재생하려는 후속 노력을 촉발할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL</td>
			<td>Baxter Corporation</td>
			<td>JB1308M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Disposable Serological Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75816-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cc Disposable Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Stopcock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5cc Disposable Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropyl Alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28143-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter 24 G 19 mm (&#190;&#8221;)&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>38112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutter</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12029-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connectors for&#160; 1/16&#34; to 1/8&#34; Tubes</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>5117K52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8&#34; ID</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>51525K328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps with Micro-Blunted Tips</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL</td>
			<td>LEO Pharma Inc.</td>
			<td>006174-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8&#34; ID</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>51525K322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle Holder</td>
			<td>WLorenz</td>
			<td>04-4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>WLorenz</td>
			<td>SP-4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>269336-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump, 3-Channel</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-78001-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Surgical Scrub Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade - #10</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: &#62;99%, 1 kg</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SDS003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Suture #6-0</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VS889</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procurement and decellularization of rat hindlimbs using an ex vivo perfusion-based bioreactor for vascularized composite allotransplantation

심한 외상성 부상 및 조직 손실 환자는 복잡한 외과 적 재건이 필요합니다. 혈관화 복합 동종 이식(VCA)은 여러 조직을 복합 서브유닛으로 이식하기 위한 진화하는 재건 방법입니다. VCA의 유망한 특성에도 불구하고, 장기 면역 억제 요구 사항은 악성 종양, 말단 기관 독성 및 기회 감염의 위험 증가로 인해 상당한 한계입니다. 무세포 복합 스캐폴드의 조직 공학은 면역억제의 필요성을 감소시키는 잠재적인 대안이다. 본원에서, 래트 뒷다리의 조달 및 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)를 사용한 후속 탈세포화가 설명된다. 제시된 조달 전략은 총 대퇴 동맥을 기반으로합니다. 기계 관류 기반 생물 반응기 시스템이 구축되어 뒷다리의 생체 외 탈세포화에 사용되었습니다. 성공적인 관류 탈세포화가 수행되어 뒷다리의 흰색 반투명 모양이 나타났습니다. 뒷다리 전체에 온전하고 향수가있는 혈관 네트워크가 관찰되었습니다. 조직학적 분석은 모든 조직 구획에서 핵 내용물의 제거와 조직 구조의 보존을 보여주었습니다.

조달 프로토콜은 후속 관류 단계를 위해 대퇴 동맥을 분리하고 캐뉼러하는 데 성공했습니다. 그림 1A, B 의 대표적인 해부 이미지는 분기점에서 충분한 거리를 둔 대퇴 혈관의 절개 위치와 노출을 보여줍니다. 도 2 는 바이오리액터 및 관류 회로를 제조하는데 필요한 장치를 나타낸다. 탈세포화의 종점은 조직의 흰색, 반투명과 같은 외관을...

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Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

우리는 복합 쥐 뒷다리에 대한 수술 기술과 탈세포화 과정을 설명합니다. 탈세포화는 생체 외 기계 관류 시스템을 통해 저농도 도데실 황산나트륨을 사용하여 수행됩니다.

혈관화된 복합 동종 이식을 위한 생체 내 관류 기반 생물반응기를 사용한 쥐 뒷다리의 조달 및 탈세포화

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

우리는 사지의 탈세포화를 위한 작은 동물 모델을 구축했습니다. 이는 혈관화된 복합 조직의 de 및 재세포화에 대한 개념 증명 연구를 용이하게 하는 데 유용합니다. 면역 억제 요법은 혈관 화 복합 동종 이식의 주요 한계 중 하나입니다.조직 면역원성은 탈세포화를 사용하여 감소될 수 있다. 시작하려면 사타구니 인대를 따라 10 번 수술 블레이드를 사용하여 Adson Forceps로 주변 피부를 유지하면서 측면에서 내측 방향으로 이동하여 피부 절개를하십시오. 밑에있는 지방이 노출되면 무딘 해부를 사용하여 지방을 조심스럽게 해부하고 상복부 혈관을 찾습니다.마이크로 가위를 사용하여 근위를 해부하고 사타구니 인대 수준에서 밑에있는 대퇴 신경, 동맥 및 정맥을 노출시킵니다. 해부 현미경으로 대퇴 혈관을 식별하고 미세한 집게를 사용하여 동맥과 정맥을 근위로 해부하여 동맥 네트워크의 분기점에서 충분한 길이를 얻습니다. 그런 다음 6-0 봉합사를 사용하여 대퇴 정맥과 동맥을 별도로 결찰합니다.다음으로, 결찰된 대퇴 혈관을 방해하지 않고 뒷다리의 나머지 부분을 원주 박리하고 뼈 절단기를 사용하여 대퇴골 중간 길이를 횡단합니다. 뒷다리를 완전히 분리하려면 마이크로 가위를 사용하여 합자 원위에있는 결찰 된 대퇴 혈관을 횡단하고 해부 현미경으로 24 게이지 혈관 카테터를 사용하여 대퇴 동맥을 캐뉼레이션합니다. 그런 다음 대퇴 정맥에서 명확한 유출이 관찰 될 때까지 헤파린 화 된 식염수로 씻어냅니다.캐뉼러 자체 주변의 다른 봉합사에서 캐뉼러 용기 주위에 하나의 봉합사를 묶어 캐뉼러를 고정하고 캐뉼러가 분기점을 막지 않도록 근위부에 배치되도록합니다. 그 후, 조달 된 뒷다리와 PBS를 탈세포화 될 때까지 담그십시오. 생물 반응기를 건설하려면 멸균 된 챔버를 배치하고 입구, 출구 및 보충 라인에 3 개의 일회용 3 방향 스톱 콕을 조여 보충 포트의 스톱 콕이 누출을 방지하기 위해 나머지 2 개의 포트에 캡핑되도록합니다.이전에 만든 실리콘 튜브를 입구 및 출구 라인의 스톱 콕에 부착하십시오. 그런 다음 연동 튜브를 실리콘 튜브에 연결합니다. 카세트를 연동 튜브에 고정한 후 연동 펌프에 놓습니다.그런 다음 실리콘 튜브 중 하나를 위 단계에서 배출 라인의 연동 튜브 끝에 연결합니다. 다른 쪽 끝에는 1 밀리리터의 혈청 학적 피펫을 연결하고 혈청 학적 피펫으로 부착 된 끝을 폐기물 저장소 플라스크에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 혈청 피펫에 부착 된 튜브의 끝을 세제 저장소에 매달고 즉시 세제 저장소 플라스크의 개구부를 파라 필름으로 밀봉합니다.1 리터 유리 병에서 0.25 % SDS를 중간 수준의 생물 반응기 챔버에 추가합니다. 그런 다음 Adson Forceps를 사용하여 조달 된 뒷다리를 가져 와서 생물 반응기 챔버에 조심스럽게 매달아 놓습니다. 두 쌍의 Adson 겸자를 사용하여 한 쌍의 집게로 캐뉼러를 잡고 뒷다리의 캐뉼러 부분을 입구 라인으로 안내합니다.다른 한 쌍의 집게를 사용하여 입구 라인을 캐뉼라에 비틀고 고정합니다. 일단 고정되면 1 리터 유리 병에서 0.25 % SDS를 더 추가하여 필요에 따라 사지를 완전히 잠수시켜 출구 포트도 생물 반응기 저장소에 잠기고 일관된 유출이 유지되도록합니다. 그런 다음 일회용 주사기 필터를 생물 반응기 챔버 뚜껑의 환기구에 부착하고 생물 반응기의 뚜껑을 고정하여 챔버가 모든면에서 밀봉되도록합니다.튜브에서 공기를 제거하고 관류 회로를 프라이밍하려면 새로운 일회용 10 밀리리터 주사기를 사용하여 입구 라인에서 3 방향 스톱 콕을 사용하여 세제 저장소에서 세제를 끌어옵니다. 일단 당겨지면 동일한 유체를 사용하여 출구 라인의 3 방향 스톱 콕에 삽입하십시오. 그런 다음 튜브가있는 카세트를 아래로 눌러 연동 펌프에 고정합니다.그런 다음 전원 버튼을 사용하여 연동 펌프를 켭니다. 연동 펌프 화면에서 화살표 키를 사용하여 두 번째 탭으로 이동하여 입력 유량을 전달 모드로 사용하는 첫 번째 채널의 관류 속도를 설정하고 관류 속도를 분당 1밀리리터로 설정하여 장치 설정에 따라 흐름 방향이 올바른지 확인합니다. 연동 펌프를 보정하여 입구 라인을 통해 전달되거나 출구 라인에서 가져온 유체의 양이 둘 사이에서 일관되게 흐르도록 하여 튜브 ID가 1.85mm로 설정되도록 합니다.키패드의 전원 버튼을 눌러 입구 및 출구 라인 모두에 대해 분당 1밀리리터의 기계 관류를 통해 탈세포화를 시작합니다. 흐름이 입구 및 출구 라인 모두에서 진행 중인지 모니터링하고 확인합니다. 1 리터의 0.25 % STS를 사용하여 필요에 따라 보충 포트를 통해 생물 반응기 저장소를 보충합니다.그런 다음 5 일째에 나타날 조직의 흰색 반투명 모양을 찾아 쥐 뒷다리의 탈 세포화를 나타냅니다. 탈세포화를 확인한 후 세제 저장소를 PBS 및 1%항생제-항진균제 저장소로 교체하고 플라스크의 입구를 파라필름으로 밀봉합니다. 분당 1 밀리리터로 PBS와 1 % 항생제-항진균제 관류를 시작하고 이틀 동안 계속하십시오.PBS와 1 % 항생제-항진균제 저장소를 200 밀리리터의 0.1 % 기생산, 4 % 에탄올 저장소로 교체하고 2 시간 동안 분당 1 밀리리터로 관류를 시작하십시오. 생물 안전 캐비닛 아래에서 두 쌍의 멸균 Adson 겸자와 한 쌍의 집게를 사용하여 입구 라인을 비틀고 다른 한 쌍의 집게가 캐뉼러를 잡고 캐뉼러가 탈환 현상을 방지하기 위해 당겨지지 않도록하여 입구 라인에서 뒷다리를 분리합니다. 팔다리를 PBS가 들어있는 500 밀리리터 유리 병에 보관하고 추가 사용 될 때까지 섭씨 4도에서 1 % 항생제-항진균제를 보관하십시오.탈세포화된 대퇴 동맥과 정맥 모두 모든 층과 주변 결합 조직에서 핵 함량의 손실을 나타냈는데, 이는 천연 혈관에 존재하는 청색 염색 핵이 없기 때문입니다. 대퇴 정맥과 동맥의 망막 및 외막은 탈세포화된 혈관에서 유지되었습니다. 대퇴 신경은 내신경을 포함한 조직 구조의 보존을 보였다.뼈는 골세포의 염색된 핵의 손실과 탈세포화 후 주변 내막 및 골막 층에서 전반적인 구조적 유지를 보였습니다. 피부는 표피와 진피에서 세포의 손실을 보였다. 진피는 천연 피부 조직과 유사한 콜라겐 섬유가 유지되는 것으로 나타났습니다.마지막으로, 골격근의 횡단면도는 endomysium의 주변에 위치한 핵의 손실을 보여주었습니다. 근원섬유 함량은 탈세포화 후 각각의 근막 내에서 유지되었습니다. PicoGreen을 사용한 DNA 정량화도 수행되었으며, 여기서 대퇴 혈관, 신경, 피부, 근육 및 뼈에 걸쳐 DNA 함량이 크게 감소했습니다.이 프로토콜에 따라, 탈세포화된 사지를 추가로 특성화할 수 있다. 여기에는 조직 학적 및 생화학 적 방법을 사용하여 세포 외 기질을 검사하고 이미징을 사용하여 혈관을 평가하는 것이 포함됩니다. 탈세포화된 줄기는 또한 조직-특이적 세포를 사용하여 재세포화될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

연구

생체공학

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

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태반의 맞은 편에 생체이 물과 나노 물질의 전송 속도의 결정을 사용하여<em&gt; 생체</em&gt; 인간 태반 관류 모델

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

벤치 탑 생물 반응기의 운전

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

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진동 압 관류 장치에서 쥐 간을의 탈세 포화 절차

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

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Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

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Decellularization 및 Recellularization 방법론을 인간의 Saphenous 정 맥에 대 한

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐를 기초로 새로운 수술 기법

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

혈관화된 복합 동종이식편 생명공학 연구를 위한 신뢰할 수 있는 돼지 근막-피부 피판 모델

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...