Name: procurement and decellularization of rat hindlimbs using an ex vivo perfusion-based bioreactor for vascularized composite allotransplantation
Uploaded: 2022-06-09T15:00:00
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A Figura 3A foi criada em BioRender.com.

Ratos Lewis machos cadavéricos (300-430 g) obtidos do Toronto General Hospital Research Institute foram utilizados para todos os experimentos. Para todos os procedimentos cirúrgicos, instrumentos e suprimentos estéreis foram utilizados para manter a técnica asséptica (ver Tabela de Materiais). Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê de Cuidados com os Animais do Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Canadá)....

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	<li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration.">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+a+human+face+graft:+The+matrix+of+identity.">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+skin/adipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps.">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li><li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).</li><li>Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+rat+hind+limb+transplant+as+an+experimental+model+of+vascularized+composite+allotransplantation:+Approaches+and+advantages.">Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages.</a> SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).</li><li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+and+disinfection+methods+for+decellularized+matrix+materials:+Review,+consideration+and+proposal.">Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal.</a> Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).</li><li>Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+composite+tissue+as+a+bioartificial+limb+graft.">Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft.</a> Biomaterials. 61, 246-256 (2015).</li></ol>

Membros posteriores de ratos são úteis como modelos experimentais na VCA5. A engenharia tecidual de andaimes acelulares representa o primeiro passo para abordar as deficiências dos regimes de imunossupressão a longo prazo associados à VCA. O uso de enxertos compostos representa um desafio adicional, dada a presença de múltiplos tecidos, cada um com propriedades funcionais, imunogênicas e estruturais únicas. O presente protocolo mostra um método bem-sucedido para a obtenção de membros p...

A VCA é uma opção emergente para pacientes que necessitam de reconstrução cirúrgica complexa. Lesões traumáticas ou ressecções tumorais resultam em perda volumétrica de tecido que pode ser difícil de reconstruir. A VCA oferece o transplante de múltiplos tecidos, como pele, osso, músculo, nervos e vasos, como um enxerto composto de um doador para um receptor1. Apesar de sua natureza promissora, a VCA é limitada devido a regimes imunossupressores de longo prazo. O uso ao longo da vida dessas drogas resulta em aumento do risco de infecções oportunistas, neoplasias malignas e toxicidade de órgãos-alvo 1,2,3. Para ajudar a reduzir e/ou eliminar a necessidade de imunossupressão, os andaimes de engenharia de tecidos usando abordagens de descelularização para VCA mostram grande promessa.
A descelularização tecidual implica a retenção da estrutura da matriz extracelular enquanto remove o conteúdo celular e nuclear. Este andaime descelularizado pode ser repovoado com células específicas do paciente4. No entanto, preservar a rede de ECM de tecidos compostos é um desafio adicional. Isto é devido à presença de vários tipos de tecido com diferentes densidades de tecido, arquiteturas e locais anatômicos dentro de um andaime. O presente protocolo oferece uma técnica cirúrgica e um método de descelularização para um membro posterior de rato. Este é um modelo de prova de conceito para aplicar esta técnica de engenharia de tecidos a tecidos compósitos. Isso também pode levar a esforços subsequentes para regenerar tecidos compostos através da recelularização.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL</td>
			<td>Baxter Corporation</td>
			<td>JB1308M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Disposable Serological Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75816-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cc Disposable Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Stopcock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5cc Disposable Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropyl Alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28143-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter 24 G 19 mm (&#190;&#8221;)&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>38112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutter</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12029-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connectors for&#160; 1/16&#34; to 1/8&#34; Tubes</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>5117K52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8&#34; ID</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>51525K328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps with Micro-Blunted Tips</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL</td>
			<td>LEO Pharma Inc.</td>
			<td>006174-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8&#34; ID</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>51525K322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle Holder</td>
			<td>WLorenz</td>
			<td>04-4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>WLorenz</td>
			<td>SP-4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>269336-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump, 3-Channel</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-78001-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Surgical Scrub Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade - #10</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: &#62;99%, 1 kg</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SDS003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Suture #6-0</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VS889</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procurement and decellularization of rat hindlimbs using an ex vivo perfusion-based bioreactor for vascularized composite allotransplantation

Pacientes com lesões traumáticas graves e perda tecidual requerem reconstrução cirúrgica complexa. O alotransplante composto vascularizado (VCA) é uma via reconstrutiva em evolução para a transferência de múltiplos tecidos como uma subunidade composta. Apesar da natureza promissora da VCA, as necessidades imunossupressoras a longo prazo são uma limitação significativa devido ao aumento do risco de malignidades, toxicidade de órgãos-alvo e infecções oportunistas. A engenharia tecidual de andaimes compostos acelulares é uma alternativa potencial na redução da necessidade de imunossupressão. Neste documento, descreve-se a aquisição de um membro posterior de um rato e sua subsequente descelularização usando dodecil sulfato de sódio (SDS). A estratégia de aquisição apresentada baseia-se na artéria femoral comum. Um sistema de biorreator baseado em perfusão mecânica foi construído e utilizado para descelularização ex vivo do membro posterior. A descelularização perfusional bem-sucedida foi realizada, resultando em uma aparência branca translúcida do membro posterior. Observou-se uma rede vascular intacta, perfusável, em todo o membro posterior. As análises histológicas mostraram a remoção do conteúdo nuclear e a preservação da arquitetura tecidual em todos os compartimentos teciduais.

O protocolo de aquisição foi bem sucedido em isolar e canular as artérias femorais comuns para as etapas subsequentes de perfusão. As imagens de dissecção representativas da Figura 1A,B mostram a localização da incisão e a exposição dos vasos femorais com distância suficiente dos pontos de bifurcação. A Figura 2 mostra o aparelho necessário para a preparação do biorreator e do circuito de perfusão. O desfecho da descelulariza?...

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Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Descrevemos a técnica cirúrgica e o processo de descelularização de membros posteriores compostos de ratos. A descelularização é realizada usando dodecil sulfato de sódio de baixa concentração através de um sistema de perfusão de máquina ex vivo.

Captação e Descelularização de Membros Posteriores de Rato Usando Biorreator Ex Vivo à Base de Perfusão para Alotransplante Composto Vascularizado

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Estabelecemos um modelo de pequenos animais para a descelularização de um membro. Isso é útil para facilitar a pesquisa de prova de conceito sobre a de e recelularização de tecidos compostos vascularizados. Os esquemas de imunossupressão são uma das principais limitações no alotransplante composto vascularizado.A imunogenicidade tecidual pode ser reduzida com descelularização. Para começar, faça uma incisão na pele usando uma lâmina cirúrgica número 10 ao longo do ligamento inguinal, movendo-se de uma direção lateral para uma medial, enquanto segura a pele circundante com pinça de Adson. Quando a gordura subjacente estiver exposta, use a dissecção contusa para dissecar cuidadosamente a gordura e localizar os vasos epigástricos superiores.Usando micro tesoura, disseque proximalmente e exponha o nervo femoral subjacente, artéria e veia no nível do ligamento inguinal. Sob um microscópio de dissecção, identifique os vasos femorais e disseque a artéria e a veia proximalmente usando pinça fina para obter comprimento suficiente dos pontos de bifurcação da rede arterial. Em seguida, ligue a veia e a artéria femoral separadamente usando suturas 6-0.Em seguida, realizar a dissecção circunferencial ao redor do restante do membro posterior sem interromper os vasos femorais ligados e transeccionar o osso femoral de médio comprimento usando um cortador ósseo. Para isolar completamente o membro posterior, transectar os vasos femorais ligados distais às ligaduras usando microtesouras e canular a artéria femoral usando um angiocateter de calibre 24 sob o microscópio de dissecção. Em seguida, lave com soro fisiológico heparinizado até que se observe uma saída clara da veia femoral.Fixe a cânula amarrando uma sutura ao redor do vaso canulado em outra sutura distalmente ao redor da própria cânula, garantindo que a cânula seja colocada proximalmente para evitar o bloqueio dos pontos de bifurcação. Posteriormente, submergir os membros posteriores adquiridos e o PBS até a descelularização. Para construir o biorreator, coloque a câmara esterilizada e parafuse em três torneiras de três vias de uso único nas linhas de entrada, saída e reabastecimento, garantindo que a torneira para a porta de reabastecimento seja tampada em suas duas portas restantes para evitar vazamentos.Fixe os tubos de silicone previamente feitos às torneiras nas linhas de entrada e saída. Em seguida, conecte a tubulação peristáltica aos tubos de silicone. Depois de fixar o na tubulação peristáltica, coloque-o na bomba peristáltica.Em seguida, conecte um dos tubos de silicone ao final do tubo peristáltico da linha de saída a partir do degrau acima. Na outra extremidade, ligue uma pipeta serológica de um mililitro e ressuspenda a extremidade fixada com uma pipeta serológica no balão do reservatório de resíduos. Em seguida, suspenda a extremidade do tubo ligado à pipeta serológica no reservatório de detergente e sele imediatamente a abertura do balão do reservatório de detergente com parafilme.Adicione 0,25%SDS do frasco de vidro de um litro na câmara do biorreator no nível intermediário. Em seguida, pegue o membro traseiro adquirido usando o Adson Forceps e suspenda-o na câmara do biorreator com cuidado. Usando dois pares de pinça de Adson, guie a porção canulada do membro posterior até a linha de entrada enquanto segura a cânula com um par de pinças.Use o outro par de pinças para torcer e fixar a linha de entrada à cânula. Uma vez fixado, adicione mais 0,25% SDS do frasco de vidro de um litro para submergir totalmente o membro, conforme necessário, garantindo que a porta de saída também esteja submersa no reservatório do biorreator e o fluxo de saída consistente seja mantido. Em seguida, prenda um filtro de seringa de uso único à porta de ventilação na tampa da câmara do biorreator e prenda a tampa do biorreator, garantindo que a câmara esteja selada de todos os lados.Para remover o ar da tubulação e preparar o circuito de perfusão, use uma nova seringa de 10 mililitros de uso único para extrair detergente do reservatório de detergente usando uma torneira de três vias na linha de entrada. Uma vez desenhado, use o mesmo fluido para inserir na torneira de três vias na linha de saída. Em seguida, pressione para baixo e prenda as com a tubulação na bomba peristáltica.Em seguida, ligue a bomba peristáltica usando o botão liga/desliga. Na tela da bomba peristáltica, prossiga para a segunda guia usando a tecla de seta para definir a taxa de perfusão para o primeiro canal com a taxa de fluxo de entrada como o modo de entrega e defina a taxa de perfusão em um mililitro por minuto, garantindo que a direção do fluxo esteja correta de acordo com a configuração do aparelho. Calibre a bomba peristáltica para garantir que a quantidade de fluido fornecida através da linha de entrada e/ou retirada da linha de saída flua consistentemente entre as duas, garantindo que o ID da tubulação seja ajustado para 1,85 milímetros.Inicie a descelularização via perfusão da máquina a um mililitro por minuto para as linhas de entrada e saída pressionando o botão liga/desliga no teclado. Monitore e garanta que o fluxo esteja e em andamento nas linhas de entrada e saída. Usando 1 litro de 0,25% STS, reabasteça o reservatório do biorreator através da porta de reabastecimento, conforme necessário.Em seguida, procure uma aparência branca translúcida do tecido, que aparecerá no quinto dia, indicando descelularização dos membros posteriores do rato. Após a confirmação da descelularização, substituir o reservatório de detergente pelo reservatório de PBS e 1% de antibiótico-antimicótico e selar a abertura do frasco com parafilme. Comece a perfusão PBS e 1%Antibiótico-Antimicótico a um mililitro por minuto e continue por dois dias.Substitua o reservatório PBS e 1%Antibiótico-Antimicótico por 200 mililitros de ácido parasitário a 0,1%, reservatório de etanol a 4% e inicie a perfusão a um mililitro por minuto durante duas horas. Sob um gabinete de biossegurança, desconecte o membro posterior da linha de entrada usando dois pares de pinças de Adson estéreis com um par de pinças para torcer a linha de entrada e o outro segurando a cânula, garantindo que a cânula não seja puxada para evitar a decanulação. Armazene o membro em um frasco de vidro de 500 mililitros contendo PBS e 1% de antibiótico-antimicótico a 4 graus Celsius até uso posterior.Tanto a artéria femoral descelularizada quanto a veia mostraram perda de conteúdo nuclear em todas as camadas e no tecido conjuntivo circundante, dada a falta de núcleos corados de azul presentes nos vasos nativos. A túnica íntima média e a adventícia da veia femoral e das artérias foram mantidas nos vasos descelularizados. O nervo femoral apresentou preservação da estrutura tecidual, incluindo o endoneurium.O osso apresentou retenção estrutural global com perda de núcleos corados de osteócitos e das camadas circundantes do endósteo e do periósteo pós-descelularização. A pele apresentou perda de células da epiderme e derme. A derme apresentava fibras colágenas retidas semelhantes ao tecido cutâneo nativo.Por fim, a visão transversal do músculo esquelético mostrou perda de núcleos de outra forma localizados nas periferias do endomísio. O conteúdo de miofibrilas permaneceu retido dentro dos respectivos fascículos pós-descelularização. A quantificação do DNA usando PicoGreen também foi realizada, onde o conteúdo de DNA foi significativamente reduzido nos vasos femorais, nervos, pele, músculo e osso.Seguindo esse protocolo, o membro descelularizado pode ser caracterizado posteriormente. Isso envolve o exame da matriz extracelular usando métodos histológicos e bioquímicos e avaliando o vascular usando imagens. O caule descelularizado também pode ser recelularizado usando células específicas do tecido.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de perfusão da placenta humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Funcionamento de um biorreator de bancada

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Procedimento para Decelularização de fígados de rato em uma Perfusão dispositivo oscilante pressão

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization e Recellularization metodologia para as veias safena humanas

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Uma nova técnica cirúrgica como fundamento na Vivo parcial engenharia fígado de rato

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Um modelo confiável de retalho fasciocutâneo suíno para estudos de bioengenharia de aloenxertos compostos vascularizados

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...