Name: procurement and decellularization of rat hindlimbs using an ex vivo perfusion-based bioreactor for vascularized composite allotransplantation
Uploaded: 2022-06-09T15:00:00
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La figura 3A se creó en BioRender.com.

Para todos los experimentos se utilizaron ratas Lewis macho cadavéricas (300-430 g) obtenidas del Instituto de Investigación del Hospital General de Toronto. Para todos los procedimientos quirúrgicos, se utilizaron instrumentos y suministros estériles para mantener la técnica aséptica (ver la Tabla de materiales). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado de Animales del Instituto de Investigación del Hospital General de Toronto, Red de Salud de l...

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	<li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration.">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li><li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+a+human+face+graft:+The+matrix+of+identity.">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+skin/adipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps.">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li><li>Londono, R., Gorantla, V. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+rat+hind+limb+transplant+as+an+experimental+model+of+vascularized+composite+allotransplantation:+Approaches+and+advantages.">Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages.</a> SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).</li><li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+and+disinfection+methods+for+decellularized+matrix+materials:+Review,+consideration+and+proposal.">Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal.</a> Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).</li><li>Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+composite+tissue+as+a+bioartificial+limb+graft.">Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft.</a> Biomaterials. 61, 246-256 (2015).</li></ol>

Las extremidades posteriores de rata son útiles como modelos experimentales en VCA5. La ingeniería tisular de andamios acelulares representa el primer paso para abordar las deficiencias de los regímenes de inmunosupresión a largo plazo asociados con VCA. El uso de injertos compuestos plantea un desafío adicional dada la presencia de múltiples tejidos, cada uno con propiedades funcionales, inmunogénicas y estructurales únicas. El presente protocolo muestra un método exitoso para obtener ex...

VCA es una opción emergente para los pacientes que requieren reconstrucción quirúrgica compleja. Las lesiones traumáticas o las resecciones tumorales resultan en pérdida volumétrica de tejido que puede ser difícil de reconstruir. VCA ofrece el trasplante de múltiples tejidos como la piel, el hueso, el músculo, los nervios y los vasos como un injerto compuesto de un donante a un receptor1. A pesar de su naturaleza prometedora, VCA es limitado debido a los regímenes inmunosupresores a largo plazo. El uso a lo largo de la vida de tales medicamentos resulta en un mayor riesgo de infecciones oportunistas, neoplasias malignas y toxicidad en órganos terminales 1,2,3. Para ayudar a reducir y/o eliminar la necesidad de inmunosupresión, los andamios de ingeniería tisular que utilizan enfoques de descelularización para VCA son muy prometedores.
La descelularización tisular implica retener la estructura de la matriz extracelular mientras se elimina el contenido celular y nuclear. Este andamio descelularizado puede ser repoblado con células específicas del paciente4. Sin embargo, preservar la red ECM de tejidos compuestos es un desafío adicional. Esto se debe a la presencia de múltiples tipos de tejidos con diferentes densidades de tejido, arquitecturas y ubicaciones anatómicas dentro de un andamio. El presente protocolo ofrece una técnica quirúrgica y un método de descelularización para una extremidad posterior de rata. Este es un modelo de prueba de concepto para aplicar esta técnica de ingeniería de tejidos a tejidos compuestos. Esto también puede provocar esfuerzos posteriores para regenerar tejidos compuestos a través de la recelularización.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL</td>
			<td>Baxter Corporation</td>
			<td>JB1308M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Disposable Serological Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75816-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cc Disposable Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Stopcock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5cc Disposable Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropyl Alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28143-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter 24 G 19 mm (&#190;&#8221;)&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>38112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutter</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12029-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connectors for&#160; 1/16&#34; to 1/8&#34; Tubes</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>5117K52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8&#34; ID</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>51525K328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps with Micro-Blunted Tips</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL</td>
			<td>LEO Pharma Inc.</td>
			<td>006174-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8&#34; ID</td>
			<td>McMasterCarr</td>
			<td>51525K322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle Holder</td>
			<td>WLorenz</td>
			<td>04-4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>WLorenz</td>
			<td>SP-4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>269336-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump, 3-Channel</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-78001-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Surgical Scrub Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Research Institution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96450-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade - #10</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: &#62;99%, 1 kg</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SDS003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Suture #6-0</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VS889</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procurement and decellularization of rat hindlimbs using an ex vivo perfusion-based bioreactor for vascularized composite allotransplantation

Los pacientes con lesiones traumáticas graves y pérdida de tejido requieren una reconstrucción quirúrgica compleja. El alotrasplante compuesto vascularizado (ACV) es una vía reconstructiva en evolución para transferir múltiples tejidos como una subunidad compuesta. A pesar de la naturaleza prometedora de VCA, los requisitos inmunosupresores a largo plazo son una limitación significativa debido al mayor riesgo de neoplasias malignas, toxicidad de órganos terminales e infecciones oportunistas. La ingeniería tisular de andamios compuestos acelulares es una alternativa potencial para reducir la necesidad de inmunosupresión. En este documento, se describe la obtención de una extremidad posterior de rata y su posterior descelularización utilizando dodecil sulfato de sodio (SDS). La estrategia de adquisición presentada se basa en la arteria femoral común. Se construyó un sistema de biorreactor basado en la máquina de perfusión y se utilizó para la descelularización ex vivo de la extremidad posterior. Se realizó con éxito la descelularización de perfusión, lo que resultó en una apariencia blanca translúcida de la extremidad posterior. Se observó una red vascular intacta y perfusible en toda la extremidad posterior. Los análisis histológicos mostraron la eliminación del contenido nuclear y la preservación de la arquitectura tisular en todos los compartimentos tisulares.

El protocolo de adquisición tuvo éxito en aislar y canular las arterias femorales comunes para los pasos posteriores de perfusión. Las imágenes representativas de disección en la Figura 1A,B muestran la ubicación de la incisión y la exposición de los vasos femorales con suficiente distancia de los puntos de bifurcación. La figura 2 muestra el aparato necesario para preparar el biorreactor y el circuito de perfusión. El punto final de ...

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Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Describimos la técnica quirúrgica y el proceso de descelularización para extremidades posteriores de ratas compuestas. La descelularización se lleva a cabo utilizando dodecil sulfato de sodio de baja concentración a través de un sistema de perfusión de máquina ex vivo .

Obtención y descelularización de extremidades posteriores de ratas utilizando un biorreactor basado en perfusión ex vivo para alotrasplante compuesto vascularizado

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Hemos establecido un modelo animal pequeño para la descelularización de una extremidad. Esto es útil para facilitar la investigación de prueba de concepto sobre la decelularización de tejidos compuestos vascularizados. Los regímenes de inmunosupresión son una de las principales limitaciones en el alotrasplante compuesto vascularizado.La inmunogenicidad tisular puede reducirse mediante la descelularización. Para comenzar, haga una incisión en la piel con una cuchilla quirúrgica número 10 a lo largo del ligamento inguinal, moviéndose de una dirección lateral a medial, mientras sostiene la piel circundante con pinzas Adson. Cuando la grasa subyacente está expuesta, use una disección roma para diseccionar cuidadosamente a través de la grasa y localizar los vasos epigástricos superiores.Usando microtijeras, diseccionar proximalmente y exponer el nervio femoral, la arteria y la vena subyacentes a nivel del ligamento inguinal. Bajo un microscopio de disección, identifique los vasos femorales y diseccione la arteria y la vena proximalmente usando fórceps finos para obtener suficiente longitud de los puntos de bifurcación de la red arterial. Luego, liga la vena femoral y la arteria por separado usando suturas 6-0.A continuación, realice una disección circunferencial alrededor del resto de la extremidad posterior sin interrumpir los vasos femorales ligados, y transecte el hueso femoral a la mitad de la longitud con un cortador de hueso. Para aislar completamente la extremidad posterior, transecto los vasos femorales ligados distales a las ligaduras usando microtijeras y canulación la arteria femoral usando un angiocatéter de calibre 24 bajo el microscopio de disección. Luego, enjuague con solución salina heparinizada hasta que se observe una salida clara de la vena femoral.Asegure la cánula atando una sutura alrededor del vaso canulado en otra sutura distalmente alrededor de la cánula misma, asegurando que la cánula se coloque proximalmente para evitar el bloqueo de los puntos de bifurcación. Después, sumerja las extremidades posteriores y PBS adquiridas hasta la descelularización. Para construir el biorreactor, coloque la cámara esterilizada y atornille tres llaves de paso de tres vías de un solo uso en las líneas de entrada, salida y reposición, asegurándose de que la llave de paso para el puerto de reposición esté tapada en sus dos puertos restantes para evitar fugas.Fije los tubos de silicona fabricados previamente a las llaves de paso en las líneas de entrada y salida. Luego, conecte el tubo peristáltico a los tubos de silicona. Después de asegurar el cassette en el tubo peristáltico, colóquelo en la bomba peristáltica.A continuación, conecte uno de los tubos de silicona al extremo del tubo peristáltico de la línea de salida desde el paso anterior. En el otro extremo, conectar una pipeta serológica de un mililitro y volver a suspender el extremo unido con una pipeta serológica en el matraz del depósito de residuos. A continuación, suspender el extremo del tubo conectado a la pipeta serológica en el depósito de detergente e inmediatamente sellar la abertura del matraz del depósito de detergente con parafilm.Agregue 0.25% SDS del frasco de vidrio de un litro en la cámara del biorreactor a nivel medio. Luego, tome la extremidad posterior adquirida con pinzas Adson y suspendala en la cámara del biorreactor con cuidado. Usando dos pares de pinzas Adson, guíe la porción canulada de la extremidad posterior hacia la línea de entrada mientras sostiene la cánula con un par de fórceps.Use el otro par de pinzas para torcer y asegurar la línea de entrada a la cánula. Una vez asegurado, agregue más 0.25% SDS del frasco de vidrio de un litro para sumergir completamente la extremidad según sea necesario, asegurando que el puerto de salida también esté sumergido en el depósito del biorreactor y se mantenga un flujo de salida constante. Luego, conecte un filtro de jeringa de un solo uso al puerto de ventilación en la tapa de la cámara del biorreactor y asegure la tapa del biorreactor, asegurándose de que la cámara esté sellada desde todos los lados.Para eliminar el aire del tubo y cebar el circuito de perfusión, use una nueva jeringa de 10 mililitros de un solo uso para extraer detergente del depósito de detergente utilizando una llave de paso de tres vías en la línea de entrada. Una vez extraído, use el mismo líquido para insertarlo en la llave de paso de tres vías en la línea de salida. A continuación, presione y asegure los casetes con el tubo en la bomba peristáltica.Luego, encienda la bomba peristáltica con el botón de encendido. En la pantalla de la bomba peristáltica, continúe con la segunda pestaña usando la tecla de flecha para establecer la velocidad de perfusión para el primer canal con el caudal de entrada como modo de entrega, y ajuste la velocidad de perfusión en un mililitro por minuto, asegurando que la dirección del flujo sea correcta de acuerdo con la configuración del aparato. Calibre la bomba peristáltica para garantizar que la cantidad de fluido suministrado a través de la línea de entrada y/o tomado de la línea de salida fluya constantemente entre las dos, asegurando que la identificación de la tubería esté ajustada a 1,85 milímetros.Comience la descelularización a través de la perfusión de la máquina a un mililitro por minuto para las líneas de entrada y salida presionando el botón de encendido en el teclado. Controle y asegúrese de que el flujo sea continuo tanto en las líneas de entrada como en las de salida. Usando 1 litro de 0.25% STS, reponga el depósito del biorreactor a través del puerto de reposición según sea necesario.Luego, busque una apariencia translúcida blanca del tejido, que aparecerá para el día cinco, lo que indica la descelularización de las extremidades posteriores de la rata. Tras la confirmación de la descelularización, sustituir el depósito de detergente por el PBS y el depósito antibiótico-antimicótico al 1%, y sellar la abertura del matraz con parafilm. Comience PBS y perfusión antibiótico-antimicótico al 1% a un mililitro por minuto, y continúe durante dos días.Reemplace el PBS y el depósito de antibióticos-antimicóticos al 1% con 200 mililitros de ácido parásito al 0,1%, depósito de etanol al 4% y comience la perfusión a un mililitro por minuto durante dos horas. Debajo de un gabinete de bioseguridad, desconecte la extremidad posterior de la línea de entrada usando dos pares de pinzas Adson estériles con un par de pinzas para torcer la línea de entrada y el otro sosteniendo la cánula, asegurándose de que la cánula no se tire para evitar la decanulación. Guarde la extremidad en un frasco de vidrio de 500 mililitros que contenga PBS y 1% de antibiótico-antimicótico a 4 grados centígrados hasta que se vuelva a usar.Tanto la arteria femoral descelularizada como la vena mostraron pérdida de contenido nuclear en todas las capas y tejido conectivo circundante, dada la falta de núcleos teñidos de azul presentes en los vasos nativos. La túnica íntima media y la adventicia tanto de la vena femoral como de las arterias se mantuvieron en los vasos descelularizados. El nervio femoral mostró preservación de la estructura del tejido, incluyendo el endoneuro.El hueso mostró retención estructural general con pérdida de núcleos teñidos de osteocitos, y de las capas circundantes de endosteum y periostio después de la descelularización. La piel mostró una pérdida de células de la epidermis y la dermis. La dermis mostró fibras de colágeno retenidas similares al tejido nativo de la piel.Por último, la vista transversal del músculo esquelético mostró pérdida de núcleos ubicados en las periferias del endomisio. El contenido de miofibrillas permaneció retenido dentro de los respectivos fascículos después de la descelularización. También se realizó la cuantificación de ADN con PicoGreen, donde el contenido de ADN se redujo significativamente en los vasos femorales, el nervio, la piel, los músculos y los huesos.Siguiendo este protocolo, la extremidad descelularizada puede caracterizarse aún más. Esto implica examinar la matriz extracelular utilizando métodos histológicos y bioquímicos, y mediante la evaluación vascular en el uso de imágenes. El tallo descelularizado también se puede recelularizar utilizando células específicas de tejido.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Descelularización y recelularización de hígados enteros

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Investigación

Bioingeniería

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determinación de la velocidad de transporte de xenobióticos y Nanomateriales través de la placenta mediante el<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo perfusión placentaria humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

La operación de un biorreactor de sobremesa

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Procedimiento para Descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularizado de Bioprinting de microfluidos para la ingeniería de tejidos y organitas

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Descelularización y recelularización metodología de venas safenas humanas

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Una novedosa técnica quirúrgica como base para In Vivo parcial ingeniería hígado de rata

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Un modelo confiable de colgajo fascio-cutáneo porcino para estudios de bioingeniería de aloinjertos compuestos vascularizados

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...