Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

تم دعم هذا العمل ماليا من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFD1400805) ، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا في مقاطعة جيانغشي (20194ABC28007) ، ومشاريع إدارة التعليم في جيانغشي (GJJ201449) ، والابتكار التعاوني للبحث العلمي الزراعي الحديث في مقاطعة جيانغشي (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).

1. بناء كاشف CLas
ملاحظة: بناء CLas-DETECTR هو عملية من أربع خطوات: تحضير المحلول ، وعزل الحمض النووي الكلي للحمضيات ، وتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، وتصور النتائج. يوضح الشكل 1 أ الرسم التخطيطي لمقايسة CLas-DETECTR.
<ol><li>إعداد الحل<ol><li>تحضير المخزن المؤقت A: 20 mM NaOH في 6...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR.">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37 (2009).</li><li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR.">Multiplex detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).</li><li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+from+Murraya+paniculata+in+Guandong,+China.">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).</li><li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+in+citrus,+and+identification+by+GeLC-MS/MS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens.">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272 (2016).</li><li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus,+a+causal+agent+of+citrus+Huanglongbing.">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing.</a> The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).</li><li>Ghosh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+recombinase+polymerase+based+isothermal+amplification+combined+with+lateral+flow+assay+(HLB-RPA-LFA)+for+rapid+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;.">Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;.</a> PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).</li><li>Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+solanacearum'+in+potatoes+and+psyllids.">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li><li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+diagnostics+with+CRISPR.">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13,+Cas12a,+and+Csm6.">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay.">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).</li><li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics.">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568 (2021).</li><li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV,+TEV,+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13.">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay.">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li><li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+amplification:+Basics,+applications+and+recent+advances.">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules.">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;:+Biological+implications+and+PCR+detection+application.">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020 (2016).</li><li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria,+eukaryotic+tissue+samples,+and+whole+blood.">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li><li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

تقدم هذه الدراسة طريقة سريعة ومحمولة للكشف عن CLas تسمى CLas-DETECTR ، والتي تجمع بين أنظمة RPA و CRISPR-Cas12a. يوضح الشكل 1 سير العمل. يكتشف CLas-DETECTR CLas بخصوصية وحساسية (الشكل 2 والشكل 3). علاوة على ذلك ، باستخدام عينات أوراق نيوهول ، يكتشف CLas-DETECTR CLas ب...

Huanglongbing (HLB) هي واحدة من أكثر أمراض الحمضيات إشكالية في جميع أنحاء العالم1. يحدث HLB بسبب البكتيريا المستعمرة لللحاء والحساسية Candidatus Liberibacter spp. ، بما في ذلك Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) و Ca. L. africanus و Ca. L. americanus2. أكثر الأنواع المرتبطة ب HLB انتشارا في الصين والولايات المتحدة الأمريكية هي CLas ، والتي تنتقل عن طريق سيلليدات الحمضيات الآسيوية (Diaphorina citri) أو من خلال التطعيم3. بعد الإصابة ب CLas ، تظهر أشجار الحمضيات انخفاضا في النمو حتى الموت2. الأعراض الشائعة لأوراق الحمضيات المصابة ب CLas هي بقع مرقطة ، وجزر خضراء (نقاط خضراء داكنة دائرية صغيرة) ، وعروق فلينية مرتفعة على أوراق سميكة وجلدية ، وبراعم اصفرار غير منتظمة2. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الثمار المصابة ب CLas صغيرة وغير متوازنة2.
نظرا لعدم وجود نوع من الحمضيات مقاوم ل HLB ولا يوجد علاج علاجي ل HLB ، فإن الوقاية من HLB تتطلب الحجر الصحي وعزل أشجار الحمضيات الإيجابيةCLas 2,3. لذلك ، يعد الاكتشاف المبكر أمرا بالغ الأهمية للمراقبة والحجر الصحي لمنع انتشار CLas وتقليل الخسائر الاقتصادية3. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى اكتشاف CLas الحساس بسبب انخفاض عيار CLas في النباتات خلال المرحلة المبكرة من العدوى3. في الصين ، عادة ما يتم إجراء اكتشاف CLas بواسطة بعض مراكز الاختبار المعتمدة. ومع ذلك ، فإن عملية الكشف عادة ما تستغرق ما لا يقل عن 1 أسبوع ، ورسوم الكشف باهظة الثمن. لذلك ، للمساعدة في مراقبة حدوث HLB
تم تطبيق تقنيات مختلفة لتشخيص HLB4،5،6،7،8،9. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) و PCR الكمي (qPCR) هما الأداتان الأكثر استخداما للكشف عن CLas نظرا لحساسيتهما العالية ونوعيتهما 4,5. غير أن هذه التكنولوجيات تعتمد اعتمادا كبيرا على أدوات باهظة الثمن وموظفين ذوي مهارات عالية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير العديد من طرق التضخيم متساوي الحرارة ، مثل التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) ، كبدائل جذابة لطرق تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية نظرا لبساطتها وسرعتها وتكلفتها المنخفضة8،9،10. ومع ذلك ، من الصعب تطبيقها للكشف بدقة عن CLas بسبب إشارات التضخيم غير المحددة ، والتي قد تسبب نتائج إيجابية خاطئة.
تم تطوير الكشف عن الحمض النووي النووي القائم على نوكلياز الداخلية الموجه بالحمض النووي الريبي (مجمعة بشكل منتظم بين التكرارات القصيرة المتباعدة / المرتبطة بكريسبر) كتقنية تشخيص جزيئي من الجيل التالي نظرا لحساسيتها العالية وخصوصيتها وموثوقيتها11،12،13،14. تعتمد تقنيات تشخيص CRISPR / Cas هذه على نشاط النيوكلياز الجانبي لبروتينات Cas لشق الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) المعدل باستخدام مراسل فلوري ومطفأ مضان في كل طرف من أطراف قليل النيوكليوتيدات ، بالإضافة إلى جهاز الكشف عن التألق لالتقاط المراسل الفلوري الذي تم إصداره11,12 . يمكن أن يؤدي نشاط النيوكلياز للعديد من مستجيبات Cas التي يتم تنشيطها بواسطة الازدواج المستهدف CRISPR RNA (crRNA) إلى شق ssDNA11 المحيط غير المستهدف بشكل عشوائي. يوضح CRISPR-Cas12a (ويسمى أيضا Cpf 1) ، وهو نظام V-A CRISPR / CAS من الفئة 2 ، العديد من المزايا مقارنة ب Cas9 ، مثل انخفاض تحمل عدم التطابق وخصوصية أكبر13. تم تطبيق نظام Cas12a / crRNA للكشف الحساس والمحدد للأحماض النووية لمسببات الأمراض البشرية ومسببات الأمراض النباتية14،15،16،17،18. لذلك ، فإن استخدام نظام Cas12a / crRNA يجب أن يتيح الكشف الدقيق والحساس للحمض النووي ل CLas.
Cas12a وحده ليس حساسا من الناحية النظرية بما يكفي للكشف عن مستويات منخفضة من الأحماض النووية. لذلك ، لتحسين حساسية الكشف ، يتم عادة دمج اكتشاف CRISPR-Cas12a مع خطوة تضخيم متساوي الحرارة14,15. يتيح تضخيم البوليميراز المعاد تجميعه (RPA) تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة الحساس والسريع في نطاق درجة حرارة من 37 درجة مئوية إلى 42 درجة مئوية19.
تم مؤخرا ابتكار منصة كشف تسمى DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) التي تجمع بين نشاط DNase ل Cas12a و RPA وقراءة مضان12 وقد ثبت أنها تكتشف الحمض النووي بحساسية أعلى20. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة إشارة التألق المنبعثة من العينات الإيجابية من خلال جهاز كشف مضان محمول باليد في الميدان.
نظرا لأننا قمنا بتضخيم الحمض النووي باستخدام RPA ، وصممنا crRNA الذي يستهدف الجين المكون من خمس نسخ nrdB (اختزال الريبونوكليوتيد β الوحدة الفرعية) الخاص ب CLas21 ، واستخدمنا نشاط DNase لبروتين Cas12a ، أطلقنا على طريقة الكشف عن CLas هذه CLas-DETECTR. بالمقارنة مع طرق الكشف عن CLas الحالية ، فإن CLas-DETECTR سريع ودقيق وحساس وقابل للنشر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

يسهل الكشف المبكر عن Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) من قبل مزارعي الحمضيات التدخل المبكر ويمنع انتشار المرض. يتم تقديم طريقة بسيطة لتشخيص Huanglongbing (HLB) السريع والمحمول هنا والتي تجمع بين تضخيم بوليميراز recombinase ومراسل الفلورسنت باستخدام نشاط النيوكلياز لنظام التكرارات القصيرة المتباعدة بانتظام / 12a المرتبط ب CRISPR (CRISPR-Cas12a). حساسية هذه التقنية أعلى بكثير من PCR. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه الطريقة نتائج مماثلة ل qPCR عند استخدام عينات الأوراق. بالمقارنة مع طرق الكشف عن CLas التقليدية ، يمكن إكمال طريقة الكشف المعروضة هنا في 90 دقيقة وتعمل في حالة متساوية الحرارة لا تتطلب استخدام أجهزة PCR. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصور النتائج من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول في الميدان.

هنا ، وصفنا منصة محمولة ، CLas-DETECTR ، تجمع بين أنظمة RPA و CRISPR-Cas12a لتشخيص HLB في الميدان. مخطط CLas-DETECTR موضح في الشكل 1A.
عندما خضعت عينات الأوراق من أشجار نيوهول المصابة ب HLB وغير المصابة ب HLB (الشكل 1B) ، والتي تم تأكيد وجود CLas لها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشك?...

Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

في هذا العمل ، تم تطوير طريقة كشف سريعة وحساسة ومحمولة ل Candidatus Liberibacter asiaticus على أساس تضخيم بوليميراز recombinase جنبا إلى جنب مع CRISPR-Cas12a.

الكشف عن المبيضات القابلة للنشر الميداني Liberibacter asiaticus باستخدام تضخيم بوليميراز Recombinase جنبا إلى جنب مع CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

هوانغ لونغ بينغ ، يختصر باسم HLB. إنه مرض حمضيات مدمر في جميع أنحاء العالم. في معظم البلدان المنتجة للحمضيات ، مثل الصين والولايات المتحدة الأمريكية ، يحدث HLB بسبب البكتيريا المقيدة باللحاء Candidatus Liberibacter asiaticus ، والمختصرة باسم CLas.كان الكشف المبكر عن CLas مهما للمزارعين لتسهيل التدخل المبكر ومنع انتشار المرض. لذلك قمنا هنا بتطوير طريقة جديدة لتشخيص HLB السريع والمحمول ، جنبا إلى جنب مع تضخيم بوليميراز recombinase ونظام CRISPR-Cas12a. أطلقنا عليه اسم CLas-DETECTR.حساسية منصتنا أعلى بكثير من PCR. علاوة على ذلك ، فإنه يظهر نتيجة مماثلة مع qPCR عند استخدام عينات الأوراق. بالمقارنة مع اكتشافات CLas التقليدية ، يمكن الانتهاء من طريقتنا في 90 دقيقة ، وتعمل في حالة متساوية الحرارة.يمكن أيضا تصور النتيجة من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول في الميدان. يحتوي CLas-DETECTR على أربع خطوات: تحضير المحلول ، وعزل الحمض النووي الكلي للحمضيات ، وتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، ونتائج التصور. يتم توضيح الرسم التخطيطي لمقايسة CLas-DETECTR هنا.يتم إعداد المخزن المؤقت A والحل B والحل C كما هو موضح في البروتوكول. لتوفير الوقت وجعل هذه الطريقة مناسبة للكشف عن CLas الميداني ، تم استخدام النهج القائم على E.coli البولي إيثيلين جلايكول للحصول على مستخلصات نباتية خام لتضخيم الحمض النووي. تستخدم أوراق الحمضيات في الأداة.لكمة القطع القليلة من أقراص الأوراق من ورقة. ضع أقراص الأوراق في أنبوب إيبندورف سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت أ إلى الأنبوب.طحن أقراص ورقة حتى تصبح ناعمة مع قضيب من البلاستيك يدويا. اترك الأنبوب دون إزعاج لمدة 10 دقائق. يتم تطبيق الطافي لاحقا على تضخيم الحمض النووي.لتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، أضف ميكرولترا واحدا من المادة الطافية من الخطوة 2.3 وميكرولترا واحدا من أسيتات المغنيسيوم إلى المحلول B واخلطه جيدا. في المختبر ، احتضنهم في حاضنة بسيطة عند 37 درجة لمدة 15 دقيقة. لتصور النتائج ، أضف 10 ميكرولتر من الخليط من الخطوة 3.2 إلى المحلول C واخلطه جيدا.احتضانها في حاضنة 37 درجة لمدة 60 دقيقة. ارتد نظارة واقية ، وراقب إشارة التألق الخضراء من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول باليد. لاختبار خصوصية CLas-DETECTR ، أول مستعمرات نقية من Agrobacterium tumefaciens GV3101 ، Xanthomonas citri subsp.تم استخدام الستري وهو العامل الممرض لقرحة الحمضيات وسلالة Burkholderia stabilis 1440 المعزولة في مختبرنا لاستخراج الحمض النووي الجينومي. ثم خضع هذا الحمض النووي الجينومي للبكتيريا الثلاثة والحمض النووي الجينومي لأوراق نيوهول الإيجابية CLas لاختبار CLas-DETECTR. لاختبار حساسية CLas-DETECTR ، تم الكشف عن سلسلة من تخفيفات شظايا الحمض النووي CLas باستخدام PCR و CLas-DETECTR و qPCR كما هو موضح في البروتوكول بعد اختبار الخصوصية والحساسية ، تم استخدام طريقة CLas-DETECTR للكشف عن وجود CLas في الحقل.عينات أوراق تم جمعها من شجرة البرتقال الحلو في نيوهول المزروعة في مشتل موارد الأصول الوراثية في حرم جامعة جانان نورمال ، جيانغشي ، الصين. كما تم تطبيق qPCR ، وهي طريقة مقنعة للكشف عن CLas تستخدم عادة في المختبر. تم إخضاع عينات الأوراق من شجرة نيوهول المصابة ب HLB وغير المصابة ب HLB ، والتي تم فيها تأكيد وجود CLas في مختبرنا ، لاختبار CLas-DETECTR.تم التقاط إشارة التألق الخضراء في العينة المصابة ب HLB ، ولكن ليس في العينة غير المصابة ب HLB والسيطرة السلبية. حددنا خصوصية CLas-DETECTR باستخدام الأحماض النووية المستخرجة من البكتيريا الأخرى. في مقايسة CLas-DETECTR ، أظهر gDNA فقط المستخرج من أوراق نيوهول الإيجابية CLas إشارات فلورية خضراء.gDNA المستخرج من Agrobacterium tumefaciens GV3101 و Xanthomonas citri subsp. citri و Burkholderia stabilis strain 1440 لم يفعل ذلك ، مما يعني أن CLas-DETECTR يمكنه اكتشاف CLas على وجه التحديد. اختبرنا أيضا حساسية CLas-DETECTR باستخدام سلسلة من تخفيفات الحمض النووي CLas ، المدرجة في البروتوكول.يمكن ل PCR اكتشاف 201 نسخة لكل ميغالتر. من ناحية أخرى ، يمكن ل CLas-DETECTR اكتشاف 2.01 نسخة لكل ميغالتر ، مما يشير إلى توفره كتشخيص مجال حساس. يمكن ل qPCR اكتشاف 0.201 نسخة لكل ميغالتر وقيمة Ct أعلى من 36.لذا فإن CLas-DETECTR هو أمران من حيث الحجم أكثر حساسية من PCR التقليدي وترتيب واحد من حجم أقل حساسية من qPCR عند استخدام مضخمات CLas المحددة المخففة. أخيرا ، إعادة فحص جدوى كاشف CLas-DETECTR للعينات الميدانية ، ومقارنة حساسيته مع qPCR. في الأرقام ، نرى.يمكننا ملاحظة أن قيمة Ct أعلى من 36 عندما يكون تركيز CLas أقل من 0.2 نسخة لكل ميغالتر، وهو تركيز منخفض جدا. من بين العينات ال 15 ، كانت قيمة التصوير المقطعي المحوسب للعينات 1 و 2 و 3 و 4 و 8 و 10 و 13 و 14 المكتشفة بواسطة qPCR أقل من 36. لوحظت إشارات مضان خضراء واضحة.من ناحية أخرى ، عندما لم يتم تحديد قيمة Ct للعينات 6 و 7 و 9 و 12 و 15 التي تم اكتشافها بواسطة qPCR ، لم تلاحظ أي إشارات فلورية خضراء. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت إشارات فلورية خضراء ضعيفة عندما كانت قيمة التصوير المقطعي المحوسب للعينة 5 و 11 المكتشفة بواسطة qPCR أعلى من 36. ستشير النتائج إلى أن منصتنا هي أداة سريعة وقوية وحساسة لتشخيص HLB في هذا المجال.

Research

JoVE Journal

Biology

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

مبادئ في مواقع محددة التكنولوجيا (SSR) Recombinase

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

الجزيئية تطور Recombinase تري

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

مقابلة : HIV - 1 الحمض النووي الختان Proviral باستخدام تطورت Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

التوقيت كروموسوم النسخ المتماثل جنبا إلى جنب مع نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

عزل الحمض النووي الريبي من خلية مجموعات سكانية فرعية محددة عن طريق الليزر والتقاط تسليخ مجهري جنبا إلى جنب مع رابيد Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

تطوير الكمية Recombinase البلمرة التضخيم الفحص مع الرقابة الداخلية إيجابي

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...