Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet økonomisk af Kinas nationale centrale F & U-program (2021YFD1400805), det store F & U-program for videnskab og teknologi i Jiangxi-provinsen (20194ABC28007), projekter fra Jiangxi Education Department (GJJ201449) og samarbejdsinnovation inden for moderne landbrugsvidenskabelig forskning i Jiangxi-provinsen (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).

1. Konstruktion af CLas-DETECTR
BEMÆRK: Konstruktionen af CLas-DETECTR er en fire-trins proces: opløsningsforberedelse, citrus total DNA-isolering, isotermisk DNA-amplifikation og resultatvisualisering. Skemaet for CLas-DETECTR-analysen er illustreret i figur 1A.
<ol><li>Forberedelse af opløsning<ol><li>Forbered buffer A: 20 mM NaOH i 6% PEG 200. Til 100 ml tilsættes 113 mg NaOH og 6 g PEG 200 i 80 ml H2O i en flaske. Inkuber flasken i et vandbad ...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR.">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37 (2009).</li><li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR.">Multiplex detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).</li><li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+from+Murraya+paniculata+in+Guandong,+China.">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).</li><li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+in+citrus,+and+identification+by+GeLC-MS/MS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens.">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272 (2016).</li><li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus,+a+causal+agent+of+citrus+Huanglongbing.">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing.</a> The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).</li><li>Ghosh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+recombinase+polymerase+based+isothermal+amplification+combined+with+lateral+flow+assay+(HLB-RPA-LFA)+for+rapid+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;.">Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;.</a> PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).</li><li>Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+solanacearum'+in+potatoes+and+psyllids.">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li><li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+diagnostics+with+CRISPR.">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13,+Cas12a,+and+Csm6.">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay.">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).</li><li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics.">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568 (2021).</li><li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV,+TEV,+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13.">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay.">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li><li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+amplification:+Basics,+applications+and+recent+advances.">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules.">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;:+Biological+implications+and+PCR+detection+application.">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020 (2016).</li><li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria,+eukaryotic+tissue+samples,+and+whole+blood.">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li><li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

Denne undersøgelse præsenterer en hurtig og bærbar metode til at detektere CLas ved navn CLas-DETECTR, som kombinerer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemerne. Arbejdsgangen er illustreret i figur 1. CLas-DETECTR registrerer CLas med specificitet og følsomhed (figur 2 og figur 3). Ved hjælp af Newhall-bladprøver registrerer CLas-DETECTR desuden CLas med samme følsomhed som qPCR (figur 4)...

Huanglongbing (HLB) er en af de mest problematiske citrussygdomme på verdensplan1. HLB er forårsaget af de phloem-koloniserende og kræsne bakterier Candidatus Liberibacter spp., herunder Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus og Ca. L. americanus 2. Den mest udbredte HLB-associerede art i Kina og USA er CLas, som overføres af asiatiske citruspsyllider (Diaphorina citri) eller gennem podning3. Efter at være blevet inficeret af CLas viser citrustræer vækstfald indtil døden2. De almindelige symptomer på citrusblade inficeret med CLas er plettet mottle, grønne øer (små cirkulære mørkegrønne prikker), hævede korkede vener på tykkere og læderagtige blade og ikke-ensartede gulningsskud2. Derudover forekommer frugter inficeret med CLas små og skæve2.
Da ingen citrussort er resistent over for HLB, og der ikke findes nogen terapeutisk kur mod HLB, kræver forebyggelse af HLB karantæne og isolering af CLas-positive citrustræer 2,3. Derfor er tidlig påvisning afgørende for overvågning og karantæne for at forhindre spredning af CLas og minimere økonomiske tab3. Derudover er følsom CLas-detektion nødvendig på grund af den lave titer af CLas i planter i det tidlige stadium af infektion3. I Kina udføres CLas-detektion normalt af visse certificerede testcentre. Detektionsprocessen tager dog normalt mindst 1 uge, og detektionsgebyret er dyrt. Derfor for at hjælpe med at overvåge HLB-forekomsten
Forskellige teknologier er blevet anvendt til at diagnosticere HLB 4,5,6,7,8,9. Polymerasekædereaktion (PCR) og kvantitativ PCR (qPCR) er de mest anvendte værktøjer til CLas-detektion på grund af deres høje følsomhed og specificitet 4,5. Disse teknologier er imidlertid stærkt afhængige af dyre instrumenter og højt kvalificeret personale. Derudover er flere isotermiske forstærkningsmetoder, såsom loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP), blevet udviklet som attraktive alternativer til konventionelle PCR-metoder på grund af deres enkelhed, hurtighed og lave omkostninger 8,9,10. Det er dog udfordrende at anvende dem til nøjagtigt at detektere CLas på grund af de ikke-specifikke forstærkningssignaler, hvilket kan forårsage falske positive resultater.
RNA-guidet CRISPR / Cas (grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser / CRISPR-associerede) endonukleasebaseret nukleinsyredetektion er udviklet som en næste generations molekylær diagnostikteknologi på grund af dens høje følsomhed, specificitet og pålidelighed11,12,13,14. Disse CRISPR/Cas-diagnosticeringsteknologier er afhængige af cas-proteiners sikkerhedsnukleaseaktivitet til at spalte enkeltstrenget DNA (ssDNA) modificeret med en fluorescerende reporter og en fluorescensquencher i hver ende af oligonukleotiderne samt en fluorescensdetekteringsanordning til at fange den frigivne fluorescerende reporter11,12 . Nukleaseaktiviteten af flere Cas-effektorer aktiveret af CRISPR RNA (crRNA) target duplex kan vilkårligt spalte det omgivende ikke-mål ssDNA11. CRISPR-Cas12a (også kaldet Cpf 1), et klasse 2 type V-A CRISPR/CAS-system, viser flere fordele sammenlignet med Cas9, såsom en lavere mismatchtolerance og større specificitet13. Cas12a /crRNA-systemet er blevet anvendt til følsom og specifik påvisning af nukleinsyrer af humane patogener og phytopathogener 14,15,16,17,18. Derfor bør anvendelse af Cas12a / crRNA-systemet muliggøre nøjagtig og følsom påvisning af nukleinsyren af CLas.
Cas12a alene er ikke teoretisk følsom nok til at detektere lave niveauer af nukleinsyrer. For at forbedre detektionsfølsomheden kombineres CRISPR-Cas12a-detektion derfor typisk med et isotermisk forstærkningstrin14,15. Rekombinasepolymeraseamplifikation (RPA) muliggør følsom og hurtig isotermisk DNA-amplifikation i et temperaturområde fra 37 °C til 42 °C19.
En detektionsplatform kaldet DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), der kombinerer DNase-aktiviteten af Cas12a med RPA og en fluorescensaflæsning, er for nylig blevet udtænkt12 og har vist sig at detektere nukleinsyre med højere følsomhed20. Desuden kan fluorescenssignalet, der udsendes fra de positive prøver, observeres gennem en håndholdt fluorescensdetektionsanordning i marken.
Da vi amplificerede DNA med RPA, designede crRNA rettet mod det fem-kopierede nrdB (ribonukleotidreduktase β- underenhed) gen, der er specifikt for CLas21, og anvendte DNase-aktiviteten af Cas12a-proteinet, kaldte vi denne CLas-detektionsmetode CLas-DETECTR. Sammenlignet med eksisterende CLas-detektionsmetoder er CLas-DETECTR hurtig, præcis, følsom og kan implementeres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

Citrusavlernes tidlige påvisning af Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) letter tidlig indgriben og forhindrer spredning af sygdomme. En simpel metode til hurtig og bærbar Huanglongbing (HLB) diagnose præsenteres her, der kombinerer rekombinasepolymeraseforstærkning og en fluorescerende reporter ved hjælp af nukleaseaktiviteten af det grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser / CRISPR-associerede 12a (CRISPR-Cas12a) system. Følsomheden af denne teknik er meget højere end PCR. Desuden viste denne metode lignende resultater som qPCR, når bladprøver blev brugt. Sammenlignet med konventionelle CLas-detektionsmetoder kan detektionsmetoden, der præsenteres her, afsluttes på 90 minutter og fungerer i en isotermisk tilstand, der ikke kræver brug af PCR-maskiner. Derudover kan resultaterne visualiseres gennem en håndholdt fluorescerende detektionsanordning i marken.

Her har vi beskrevet en bærbar platform, CLas-DETECTR, der finkæmmer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemerne for at diagnosticere HLB i marken. Skemaet for CLas-DETECTR er illustreret i figur 1A.
Da bladprøver fra de HLB-inficerede og HLB-uinficerede Newhall-træer (figur 1B), for hvilke tilstedeværelsen af CLas blev bekræftet af PCR (figur 1C), blev udsat for CLas-DETECTR-testen, blev der set et grønt fluorescenssignal i den HLB-inficerede prøve, men ikke i den H...

Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

I dette arbejde blev der udviklet en hurtig, følsom og bærbar detektionsmetode til Candidatus Liberibacter asiaticus baseret på rekombinasepolymeraseforstærkning kombineret med CRISPR-Cas12a.

Feltimplementerbar Candidatus Liberibacter asiaticus detektion ved hjælp af rekombinasepolymeraseforstærkning kombineret med CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, forkortet HLB. Det er en ødelæggende citrussygdom verden over. I de mest citrusproducerende lande, såsom Kina og USA, er HLB forårsaget af den phloem-begrænsede bakterie Candidatus Liberibacter asiaticus, forkortet CLas.Tidlig påvisning af CLas var vigtig for avlerne, hvilket lettede tidlig indgriben og forhindrede sygdomsspredning. Så her udviklede vi en ny metode til hurtig og bærbar HLB-diagnose, kombineret med rekombinasepolymeraseforstærkning og CRISPR-Cas12a-systemet. Vi kaldte det CLas-DETECTR.Følsomheden af vores platform er meget højere end PCR. Desuden viser det lignende resultat med qPCR, da bladprøverne blev brugt. Sammenlign med de konventionelle CLas-detektioner, vores metode kan være færdig på 90 minutter og fungerer i en isotermisk tilstand.Resultatet kan også visualiseres gennem en håndholdt fluorescerende detektionsanordning i marken. CLas-DETECTR indeholder fire trin: opløsningsforberedelse, citrus total DNA-isolering, isotermisk DNA-amplifikation og resultaterne af visualisering. Skemaet for CLas-DETECTR-analysen er illustreret her.Buffer A, opløsning B og opløsning C fremstilles som beskrevet i protokollen. For at spare tid og gøre denne metode egnet til felt-CLas-detektion blev E.coli-polyethylenglycolbaseret tilgang brugt til at opnå rå planteekstrakter til DNA-amplifikation. Citrusblade bruges i værktøjet.Stans de få stykker bladskiver fra bladet. Sæt bladskiver i et 1,5 ml Eppendorf-rør. Tilsæt derefter 200 mikroliter buffer A i røret.Slib bladskiverne, indtil de er glatte med en plastikstang manuelt. Lad røret stå uforstyrret i 10 minutter. Supernatanten påføres efterfølgende DNA-amplifikation.Til isotermisk DNA-amplifikation tilsættes en mikroliter supernatant fra trin 2.3 og en mikroliter magnesiumacetat i opløsning B og blandes godt. I laboratoriet inkuberes dem i en simpel inkubator ved 37 grader i 15 minutter. For at visualisere resultaterne tilsættes 10 mikroliter af blandingen fra trin 3.2 til opløsning C og blandes godt.Inkuber dem i 37 graders inkubator i 60 minutter. Brug en brille, og observer det grønne fluorescenssignal gennem en håndholdt fluorescerende detektionsanordning. For at teste specificiteten af CLas-DETECTR, første rene kolonier af Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.citri, som er patogenet af citrus canker og Burkholderia stabilis stamme 1440 isoleret i vores laboratorium blev brugt til at ekstrahere deres genomiske DNA. Derefter blev disse tre bakterier genomisk DNA og det CLas-positive Newhall efterlader genomisk DNA udsat for CLas-DETECTR-testen. For at teste følsomheden af CLas-DETECTR blev en række CLas DNA-fragmentfortyndinger detekteret ved hjælp af PCR, CLas-DETECTR og qPCR som beskrevet i protokollen Efter specificiteten og følsomhedstesten blev CLas-DETECTR-metoden brugt til at detektere tilstedeværelsen af CLas i marken.Bladprøver indsamlet fra Newhall søde appelsintræ dyrket i germplasm ressource planteskole på campus ved Gannan Normal University, Jiangxi, Kina. qPCR, en overbevisende CLas-detektionsmetode, der normalt anvendes i laboratoriet, blev også anvendt. Bladprøverne fra HLB-inficeret og HLB-uinficeret Newhall-træ, hvor tilstedeværelsen af CLas blev bekræftet i vores laboratorium, blev udsat for CLas-DETECTR-testen.Det grønne fluorescenssignal blev fanget i den HLB-inficerede prøve, men ikke i HLB-uinficeret og negativ kontrol. Vi bestemte specificiteten af CLas-DETECTR ved hjælp af nukleinsyrer ekstraheret fra andre bakterier. I CLas-DETECTR-analysen viste kun gDNA ekstraheret fra CLas-positive Newhall-blade grønne fluorescerende signaler.gDNA ekstraheret fra Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri og Burkholderia stabilis stamme 1440 gjorde det ikke, hvilket betyder, at CLas-DETECTR kan detektere CLas specifikt. Vi testede også følsomheden af CLas-DETECTR ved hjælp af en række CLas DNA-fortyndinger, der er anført i protokollen.PCR kan registrere 201 kopier pr. megaliter. På den anden side kan CLas-DETECTR registrere 2,01 kopier pr. megaliter, hvilket tyder på, at det er tilgængeligt som en følsom feltdiagnostik. qPCR kan registrere 0,201 kopier pr. megaliter, og Ct-værdien er højere end 36.Så CLas-DETECTR er to størrelsesordener mere følsom end traditionel PCR og en rækkefølge af en størrelsesorden mindre følsom end qPCR, når fortyndede CLas-specifikke ampliconer blev brugt. Endelig undersøgte man muligheden for CLas-DETECTR for feltprøver igen og sammenlignede dens følsomhed med qPCR. I tal ser vi.Vi kan se, at Ct-værdien er højere end 36, når CLas-koncentrationen er mindre end 0,2 kopier pr. megaliter, hvilket er en meget lav koncentration. Blandt de 15 prøver var Ct-værdien af prøverne 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 og 14 påvist ved qPCR mindre end 36. Et tilsyneladende grønt fluorescenssignal blev observeret.På den anden side, da Ct-værdien af prøverne 6, 7, 9, 12 og 15 detekteret af qPCR var ubestemt, blev der ikke observeret grønne fluorescerende signaler. Derudover blev der observeret svage grønne fluorescerende signaler, når CT-værdien af prøve 5 og 11 detekteret ved qPCR var højere end 36. Resultaterne tyder på, at vores platform er et hurtigt, robust og følsomt værktøj til HLB-diagnose på området.

Research

JoVE Journal

Biology

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Kromosom Replikerer Timing Kombineret med Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Hurtig og effektiv zebrafisk Genotypebestemmelse Brug PCR med høj opløsning Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolation fra celle specielle befolkningsgrupper ved hjælp af laser-capture mikrodissektion Kombineret med Rapid immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Udvikling af en kvantitativ rekombinase Polymerase amplifikationsanalyse med et indre Positiv kontrol

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...