Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
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Ce travail a été soutenu financièrement par le programme national de R & D clé de Chine (2021YFD1400805), le programme majeur de R & D scientifique et technologique de la province du Jiangxi (20194ABC28007), les projets du Département de l’éducation du Jiangxi (GJJ201449) et l’innovation collaborative de la recherche scientifique agricole moderne dans la province du Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).

1. Construction du CLas-DETECTR
REMARQUE: La construction de CLas-DETECTR est un processus en quatre étapes: préparation de la solution, isolement de l’ADN total des agrumes, amplification isotherme de l’ADN et visualisation des résultats. Le schéma du test CLas-DETECTR est illustré à la figure 1A.
<ol><li>Préparation de la solution<ol><li>Préparer le tampon A : 20 mM de NaOH dans du PEG 200 à 6 %. Pour 100 mL, ajouter 113 mg de NaOH et 6 g de PEG 2...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR.">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37 (2009).</li><li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR.">Multiplex detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).</li><li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+in+citrus,+and+identification+by+GeLC-MS/MS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens.">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272 (2016).</li><li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+recombinase+polymerase+based+isothermal+amplification+combined+with+lateral+flow+assay+(HLB-RPA-LFA)+for+rapid+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;.">Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;.</a> PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).</li><li>Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+solanacearum'+in+potatoes+and+psyllids.">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li><li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+diagnostics+with+CRISPR.">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13,+Cas12a,+and+Csm6.">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay.">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).</li><li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics.">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568 (2021).</li><li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV,+TEV,+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13.">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay.">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li><li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+amplification:+Basics,+applications+and+recent+advances.">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules.">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;:+Biological+implications+and+PCR+detection+application.">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020 (2016).</li><li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria,+eukaryotic+tissue+samples,+and+whole+blood.">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li><li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

Cette étude présente une méthode rapide et portable de détection des CLas nommée CLas-DETECTR, qui combine les systèmes RPA et CRISPR-Cas12a. Le flux de travail est illustré à la figure 1. CLas-DETECTR détecte les CLas avec spécificité et sensibilité (Figure 2 et Figure 3). De plus, en utilisant des échantillons de feuilles de Newhall, CLas-DETECTR détecte les CLas avec la même sensibilité que la qPC...

Huanglongbing (HLB) est l’une des maladies d’agrumes les plus problématiques au monde1. Le HLB est causé par les bactéries fastidieuses et colonisatrices du phloème Candidatus Liberibacter spp., y compris Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus et Ca. L. americanus2 . L’espèce associée au HLB la plus répandue en Chine et aux États-Unis est CLas, qui est transmise par les psylles asiatiques des agrumes (Diaphorina citri) ou par greffe3. Après avoir été infectés par CLas, les agrumes montrent un déclin de croissance jusqu’à la mort2. Les symptômes courants des feuilles d’agrumes infectées par les CLas sont des marbrures tachetées, des îles vertes (petits points circulaires vert foncé), des nervures liégeuses surélevées sur des feuilles plus épaisses et coriaces et des pousses jaunissantes non uniformes2. De plus, les fruits infectés par CLas apparaissent petits et déséquilibrés2.
Étant donné qu’aucune variété d’agrumes n’est résistante au HLB et qu’il n’existe pas de remède thérapeutique pour le HLB, la prévention du HLB nécessite la mise en quarantaine et l’isolement des agrumes CLas positifs 2,3. Par conséquent, la détection précoce est essentielle pour la surveillance et la quarantaine afin de prévenir la propagation des NCas et de minimiser les pertes économiques3. En outre, la détection sensible de CLas est nécessaire en raison du faible titre de CLas dans les plantes au début de l’infection3. En Chine, la détection CLas est généralement effectuée par certains centres de test certifiés. Cependant, le processus de détection prend généralement au moins 1 semaine et les frais de détection sont coûteux. Par conséquent, pour aider à surveiller l’incidence de la HLB
Diverses technologies ont été appliquées pour diagnostiquer HLB 4,5,6,7,8,9. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) et la PCR quantitative (qPCR) sont les outils les plus utilisés pour la détection de CLas en raison de leur sensibilité et de leur spécificitéélevées 4,5. Cependant, ces technologies reposent fortement sur des instruments coûteux et un personnel hautement qualifié. En outre, plusieurs méthodes d’amplification isotherme, telles que l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP), ont été développées comme alternatives attrayantes aux méthodes conventionnelles de PCR en raison de leur simplicité, de leur rapidité et de leur faible coût 8,9,10. Cependant, il est difficile de les appliquer pour détecter avec précision les CLas en raison des signaux d’amplification non spécifiques, ce qui peut entraîner des résultats faussement positifs.
La détection d’acides nucléiques à base d’endonucléase guidée par ARN CRISPR/Cas (clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) a été développée en tant que technologie de diagnostic moléculaire de nouvelle génération en raison de sa sensibilité, de sa spécificité et de sa fiabilitéélevées 11,12,13,14. Ces technologies de diagnostic CRISPR/Cas reposent sur l’activité nucléase collatérale des protéines Cas pour cliver l’ADN simple brin (ADNss) modifié avec un rapporteur fluorescent et un quencher de fluorescence à chaque extrémité des oligonucléotides, ainsi qu’un dispositif de détection de fluorescence pour capturer le rapporteur fluorescent libéré11,12 . L’activité nucléase de plusieurs effecteurs Cas activés par le duplex cible de l’ARN CRISPR (ARNcr) peut cliver sans discernement l’ADNssnon cible environnant 11. CRISPR-Cas12a (également appelé Cpf 1), un système CRISPR/Cas de type V-A de classe 2, présente plusieurs avantages par rapport au Cas9, tels qu’une tolérance aux incompatibilités plus faible et une plus grande spécificité13. Le système Cas12a/ARNcr a été appliqué pour la détection sensible et spécifique des acides nucléiques des pathogènes humains et des phytopathogènes 14,15,16,17,18. Par conséquent, l’utilisation du système Cas12a/crRNA devrait permettre la détection précise et sensible de l’acide nucléique de CLas.
Cas12a seul n’est pas théoriquement assez sensible pour détecter de faibles niveaux d’acides nucléiques. Par conséquent, pour améliorer sa sensibilité de détection, la détection CRISPR-Cas12a est généralement combinée avec une étape d’amplification isotherme14,15. L’amplification de la polymérase recombinase (RPA) permet une amplification sensible et rapide de l’ADN isotherme dans une plage de température de 37 °C à 42 °C19.
Une plate-forme de détection appelée DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) qui combine l’activité DNase de Cas12a avec RPA et une lecture de fluorescence a été récemment conçue12 et a montré qu’elle détectait les acides nucléiques avec une sensibilité plus élevée20. De plus, le signal de fluorescence émis par les échantillons positifs peut être observé grâce à un dispositif portatif de détection de fluorescence sur le terrain.
Puisque nous avons amplifié l’ADN avec la RPA, conçu l’ARNcr ciblant le gène nrdB (ribonucléotide réductase β sous-unité) en cinq copies spécifique de CLas21, et utilisé l’activité DNase de la protéine Cas12a, nous avons appelé cette méthode de détection CLas CLas-DETECTR. Comparé aux méthodes de détection CLas existantes, CLas-DETECTR est rapide, précis, sensible et déployable.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

La détection précoce de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) par les producteurs d’agrumes facilite l’intervention précoce et prévient la propagation de la maladie. Une méthode simple pour le diagnostic rapide et portable de Huanglongbing (HLB) est présentée ici qui combine l’amplification de la polymérase recombinase et un rapporteur fluorescent utilisant l’activité nucléase du système grappé régulièrement espacé de courtes répétitions palindromiques / 12a associé à CRISPR (CRISPR-Cas12a). La sensibilité de cette technique est beaucoup plus élevée que la PCR. De plus, cette méthode a donné des résultats similaires à la qPCR lorsque des échantillons de feuilles ont été utilisés. Par rapport aux méthodes de détection CLas conventionnelles, la méthode de détection présentée ici peut être complétée en 90 minutes et fonctionne dans un état isotherme qui ne nécessite pas l’utilisation de machines PCR. De plus, les résultats peuvent être visualisés à l’aide d’un dispositif portatif de détection fluorescente sur le terrain.

Ici, nous avons décrit une plate-forme portable, CLas-DETECTR, combinant les systèmes RPA et CRISPR-Cas12a pour diagnostiquer HLB sur le terrain. Le schéma de CLas-DETECTR est illustré à la figure 1A.
Lorsque des échantillons de feuilles provenant d’arbres de Newhall infectés et non infectés par HLB (figure 1B), pour lesquels la présence de CLas a été confirmée par PCR (figure 1C), ont été soumis au test CLas-DETECTR, un signal de fluorescence vert...

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Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Dans ce travail, une méthode de détection rapide, sensible et portable pour Candidatus Liberibacter asiaticus basée sur l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a a été développée.

Détection de Candidatus liberibacter asiaticus déployable sur le terrain à l’aide de l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, abrégé en HLB. C’est une maladie des agrumes dévastatrice dans le monde entier. Dans les pays les plus producteurs d’agrumes, tels que la Chine et les États-Unis, le HLB est causé par la bactérie restreinte au phloème Candidatus Liberibacter asiaticus, abrégée en CLas.La détection précoce des NCas était importante pour les producteurs, facilitant l’intervention précoce et prévenant la propagation des maladies. Nous avons donc développé ici une nouvelle méthode pour le diagnostic rapide et portable du HLB, combinant avec l’amplification de la polymérase recombinase et le système CRISPR-Cas12a. Nous l’avons appelé CLas-DETECTR.La sensibilité de notre plateforme est beaucoup plus élevée que la PCR. De plus, il montre un résultat similaire avec la qPCR lorsque les échantillons de feuilles ont été utilisés. Comparez avec les détections CLas conventionnelles, notre méthode peut être terminée en 90 minutes et fonctionne dans un état isotherme.Le résultat peut également être visualisé à l’aide d’un dispositif de détection fluorescent portatif sur le terrain. Le CLas-DETECTR contient quatre étapes: la préparation de la solution, l’isolement de l’ADN total des agrumes, l’amplification isotherme de l’ADN et les résultats de la visualisation. Le schéma du test CLas-DETECTR est illustré ici.Les tampons A, B et C sont préparés comme décrit dans le protocole. Pour gagner du temps et rendre cette méthode adaptée à la détection de CLas sur le terrain, l’approche à base de polyéthylèneglycol E. coli a été utilisée pour obtenir des extraits bruts de plantes pour l’amplification de l’ADN. Les feuilles d’agrumes sont utilisées dans l’outil.Poinçonner les quelques morceaux de disques de feuilles de la feuille. Mettez les disques foliaires dans un tube d’Eppendorf de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon A dans le tube.Broyer manuellement les disques de feuilles jusqu’à consistance lisse. Laissez le tube intact pendant 10 minutes. Le surnageant est ensuite appliqué à l’amplification de l’ADN.Pour l’amplification isotherme de l’ADN, ajouter un microlitre de surnageant de l’étape 2.3 et un microlitre d’acétate de magnésium dans la solution B et bien mélanger. En laboratoire, incuberez-les dans un simple incubateur à 37 degrés pendant 15 minutes. Pour visualiser les résultats, ajoutez 10 microlitres du mélange de l’étape 3.2 dans la solution C et mélangez bien.Incuberez-les dans l’incubateur à 37 degrés pendant 60 minutes. Portez un masque de protection et observez le signal de fluorescence verte à l’aide d’un dispositif de détection fluorescent portatif. Pour tester la spécificité de CLas-DETECTR, premières colonies pures d’Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.citri qui est l’agent pathogène du chancre des agrumes et Burkholderia stabilis souche 1440 isolé dans notre laboratoire ont été utilisés pour extraire leur ADN génomique. Ensuite, cet ADN génomique de trois bactéries et l’ADN génomique des feuilles de Newhall CLas positives ont été soumis au test CLas-DETECTR. Pour tester la sensibilité de CLas-DETECTR, une série de dilutions de fragments d’ADN CLas a été détectée par PCR, CLas-DETECTR et qPCR comme décrit dans le protocole Après le test de spécificité et de sensibilité, la méthode CLas-DETECTR a été utilisée pour détecter la présence des CLas sur le terrain.Échantillons de feuilles prélevés sur l’oranger doux de Newhall cultivé dans la pépinière de ressources en germoplasme sur le campus de l’Université normale de Gannan, Jiangxi, Chine. qPCR, une méthode convaincante de détection CLas habituellement utilisée en laboratoire, a également été appliquée. Les échantillons de feuilles de l’arbre de Newhall infecté et non infecté par HLB, dans lesquels la présence du CLas a été confirmée dans notre laboratoire, ont été soumis au test CLas-DETECTR.Le signal de fluorescence verte a été capturé dans l’échantillon infecté par HLB, mais pas dans le témoin HLB non infecté et négatif. Nous avons déterminé la spécificité de CLas-DETECTR en utilisant des acides nucléiques extraits d’autres bactéries. Dans le test CLas-DETECTR, seul l’ADNg extrait des feuilles de Newhall CLas positives a démontré des signaux fluorescents verts.L’ADNg extrait d’Agrobacterium tumefaciens GV3101, de Xanthomonas citri subsp. citri et de la souche 1440 de Burkholderia stabilis ne l’a pas fait, ce qui signifie que le CLas-DETECTR peut détecter spécifiquement les CLas. Nous avons également testé la sensibilité de CLas-DETECTR en utilisant une série de dilutions d’ADN CLas, énumérées dans le protocole.La PCR peut détecter 201 copies par mégalitre. D’autre part, CLas-DETECTR peut détecter 2,01 copies par mégalitre, ce qui suggère sa disponibilité en tant que diagnostic de terrain sensible. qPCR peut détecter 0,201 copie par mégalitre et la valeur Ct est supérieure à 36.Ainsi, CLas-DETECTR est deux ordres de grandeur plus sensible que la PCR traditionnelle et un ordre de grandeur moins sensible que qPCR lorsque des amplicons spécifiques CLas dilués ont été utilisés. Enfin, nous avons réexaminé la faisabilité du CLas-DETECTR pour les échantillons de terrain et comparé sa sensibilité à la qPCR. En chiffres, on le voit.Nous pouvons voir que la valeur Ct est supérieure à 36 lorsque la concentration CLas est inférieure à 0,2 copie par mégalitre, ce qui est une concentration très faible. Parmi les 15 échantillons, la valeur Ct des échantillons 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 et 14 détectés par qPCR était inférieure à 36. Un signal de fluorescence vert apparent a été observé.D’autre part, lorsque la valeur Ct des échantillons 6, 7, 9, 12 et 15 détectés par qPCR était indéterminée, aucun signal fluorescent vert n’a été observé. De plus, de faibles signaux fluorescents verts ont été observés lorsque la valeur CT des échantillons 5 et 11 détectés par qPCR était supérieure à 36. Les résultats suggèrent que notre plateforme est un outil rapide, robuste et sensible pour le diagnostic HLB sur le terrain.

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