Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
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Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch das National Key R & D Program of China (2021YFD1400805), das Major Science and Technology R & D Program der Provinz Jiangxi (20194ABC28007), Projects of Jiangxi Education Department (GJJ201449) und die Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research in Jiangxi Province (JXXTCX2015002(3+2)-003).

1. Aufbau des CLas-DETECTR
HINWEIS: Die Konstruktion von CLas-DETECTR ist ein vierstufiger Prozess: Lösungsvorbereitung, Gesamt-DNA-Isolierung von Zitrusfrüchten, isotherme DNA-Amplifikation und Ergebnisvisualisierung. Das Schema des CLas-DETECTR-Assays ist in Abbildung 1A dargestellt.
<ol><li>Lösungsvorbereitung<ol><li>Puffer A: 20 mM NaOH in 6% PEG 200 vorbereiten. Für 100 ml 113 mg NaOH und 6 g PEG 200 in 80 mlH2Oin einer Flasche geben. Die Fla...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. 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G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

Diese Studie stellt eine schnelle und tragbare Methode zum Nachweis von CLas namens CLas-DETECTR vor, die die Systeme RPA und CRISPR-Cas12a kombiniert. Der Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. CLas-DETECTR erkennt CLas mit Spezifität und Sensitivität (Abbildung 2 und Abbildung 3). Darüber hinaus detektiert CLas-DETECTR mithilfe von Newhall-Blattproben CLas mit der gleichen Empfindlichkeit wie qPCR (<strong cl...

Huanglongbing (HLB) ist eine der problematischsten Zitruskrankheiten weltweit1. HLB wird durch die phloemkolonisierenden und anspruchsvollen Bakterien Candidatus Liberibacter spp. verursacht, einschließlich Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus und Ca. L. americanus 2. Die häufigste HLB-assoziierte Art in China und den USA ist CLas, die durch asiatische Zitruspsylliden (Diaphorina citri) oder durch Pfropfen übertragenwird 3. Nach der Infektion mit CLas zeigen Zitrusbäume einen Wachstumsrückgang bis zum Tod2. Die häufigsten Symptome von Zitrusblättern, die mit CLas infiziert sind, sind fleckige Flecken, grüne Inseln (kleine kreisförmige dunkelgrüne Punkte), erhöhte korkige Adern auf dickeren und ledrigen Blättern und ungleichmäßige vergilbte Triebe2. Darüber hinaus erscheinen mit CLas infizierte Früchte klein und schief2.
Da keine Zitrussorte gegen HLB resistent ist und es keine therapeutische Heilung für HLB gibt, erfordert die Prävention von HLB die Quarantäne und Isolierung von CLas-positiven Zitrusbäumen 2,3. Daher ist die Früherkennung entscheidend für die Überwachung und Quarantäne, um die Ausbreitung von CLas zu verhindern und wirtschaftliche Verluste zu minimieren3. Darüber hinaus ist ein empfindlicher CLas-Nachweis aufgrund des niedrigen Titers von CLas in Pflanzen im frühen Stadium der Infektion erforderlich3. In China wird die CLas-Erkennung in der Regel von bestimmten zertifizierten Testzentren durchgeführt. Der Erkennungsprozess dauert jedoch in der Regel mindestens 1 Woche und die Erkennungsgebühr ist teuer. Um die HLB-Inzidenz zu überwachen,
Verschiedene Technologien wurden angewendet, um HLB 4,5,6,7,8,9 zu diagnostizieren. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und quantitative PCR (qPCR) sind aufgrund ihrer hohen Sensitivität und Spezifität die am häufigsten verwendeten Werkzeuge für den CLas-Nachweis 4,5. Diese Technologien hängen jedoch stark von teuren Instrumenten und hochqualifiziertem Personal ab. Darüber hinaus wurden mehrere isotherme Amplifikationsmethoden, wie die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP), aufgrund ihrer Einfachheit, Schnelligkeit und niedrigen Kosten als attraktive Alternativen zu herkömmlichen PCR-Methoden entwickelt 8,9,10. Es ist jedoch schwierig, sie anzuwenden, um CLas aufgrund der unspezifischen Verstärkungssignale genau zu erkennen, was zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann.
RNA-gesteuerter CRISPR/Cas (Clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-assoziierter) Endonuklease-basierter Nukleinsäurenachweis wurde aufgrund seiner hohen Sensitivität, Spezifität und Zuverlässigkeit als molekulardiagnostische Technologie der nächsten Generation entwickelt11,12,13,14. Diese CRISPR/Cas-Diagnostiktechnologien beruhen auf der kollateralen Nukleaseaktivität von Cas-Proteinen, um einzelsträngige DNA (ssDNA) zu spalten, die mit einem fluoreszierenden Reporter und einem Fluoreszenzlöscher an jedem Ende der Oligonukleotide modifiziert wurde, sowie einer Fluoreszenzdetektionsvorrichtung zur Erfassung des freigesetzten Fluoreszenzreporters11,12 . Die Nukleaseaktivität mehrerer Cas-Effektoren, die durch den CRISPR-RNA (crRNA)-Zielduplex aktiviert werden, kann die umgebende Nicht-Ziel-ssDNA11 wahllos spalten. CRISPR-Cas12a (auch Cpf 1 genannt), ein CRISPR/Cas-System der Klasse 2 Typ V-A, weist im Vergleich zu Cas9 mehrere Vorteile auf, wie z. B. eine geringere Fehlanpassungstoleranz und eine größere Spezifität13. Das Cas12a/crRNA-System wurde für den sensitiven und spezifischen Nachweis der Nukleinsäuren humanpathogener und phytopathogener 14,15,16,17,18 eingesetzt. Daher sollte die Verwendung des Cas12a/crRNA-Systems den genauen und empfindlichen Nachweis der Nukleinsäure von CLas ermöglichen.
Cas12a allein ist theoretisch nicht empfindlich genug, um niedrige Konzentrationen von Nukleinsäuren nachzuweisen. Um seine Detektionsempfindlichkeit zu verbessern, wird der CRISPR-Cas12a-Nachweis daher typischerweise mit einem isothermen Amplifikationsschritt14,15 kombiniert. Die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) ermöglicht eine empfindliche und schnelle isotherme DNA-Amplifikation in einem Temperaturbereich von 37 °C bis 42 °C19.
Eine Detektionsplattform namens DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), die die DNase-Aktivität von Cas12a mit RPA und einer Fluoreszenzanzeige kombiniert, wurde kürzlich entwickelt12 und es wurde gezeigt, dass sie Nukleinsäure mit höherer Empfindlichkeit detektiert20. Darüber hinaus kann das von den positiven Proben emittierte Fluoreszenzsignal durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld beobachtet werden.
Da wir DNA mit RPA amplifizierten, crRNA entwickelten, die auf das CLas-21-spezifische Gen nrdB (Ribonukleotidreduktase β-Untereinheit) abzielt, und die DNase-Aktivität des Cas12a-Proteins verwendeten, nannten wir diese CLas-Nachweismethode CLas-DETECTR. Im Vergleich zu bestehenden CLas-Erkennungsmethoden ist CLas-DETECTR schnell, genau, empfindlich und einsetzbar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

Die Früherkennung von Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) durch Zitrusbauern erleichtert ein frühzeitiges Eingreifen und verhindert die Ausbreitung von Krankheiten. Eine einfache Methode zur schnellen und tragbaren Huanglongbing (HLB) -Diagnose wird hier vorgestellt, die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation und einen Fluoreszenzreporter kombiniert, der die Nukleaseaktivität des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a) -Systems nutzt. Die Sensitivität dieser Technik ist viel höher als die PCR. Darüber hinaus zeigte diese Methode ähnliche Ergebnisse wie qPCR, wenn Blattproben verwendet wurden. Im Vergleich zu herkömmlichen CLas-Nachweismethoden kann das hier vorgestellte Nachweisverfahren in 90 min abgeschlossen werden und arbeitet in einem isothermen Zustand, der den Einsatz von PCR-Geräten nicht erfordert. Darüber hinaus können die Ergebnisse durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld visualisiert werden.

Hier haben wir eine tragbare Plattform, CLas-DETECTR, beschrieben, die die RPA- und CRISPR-Cas12a-Systeme kombiniert, um HLB im Feld zu diagnostizieren. Das Schema von CLas-DETECTR ist in Abbildung 1A dargestellt.
Wenn Blattproben von HLB-infizierten und HLB-nicht infizierten Newhall-Bäumen (Abbildung 1B), für die das Vorhandensein von CLas durch PCR bestätigt wurde (Abbildung 1C), dem CLas-DETECTR-Test unterzogen wurden, wurde ein grünes Fluoreszenzsignal in ...

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Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

In dieser Arbeit wurde eine schnelle, empfindliche und tragbare Nachweismethode für Candidatus Liberibacter asiaticus entwickelt, die auf Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a basiert.

Freilandfähiger Candidatus liberibacter asiaticus-Nachweis mittels Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, abgekürzt als HLB. Es ist eine verheerende Zitruskrankheit weltweit. In den meisten Zitrusländern wie China und den USA wird HLB durch das phloembeschränkte Bakterium Candidatus Liberibacter asiaticus, abgekürzt CLas, verursacht.Die Früherkennung von CLas war wichtig für Züchter, um frühzeitig eingreifen und die Ausbreitung von Krankheiten zu verhindern. Hier haben wir eine neue Methode für die schnelle und portable HLB-Diagnose entwickelt, die mit der Rekombinase-Polymerase-Amplifikation und dem CRISPR-Cas12a-System kombiniert wird. Wir nannten es CLas-DETECTR.Die Sensitivität unserer Plattform ist viel höher als die PCR. Darüber hinaus zeigt es ein ähnliches Ergebnis mit qPCR, wenn die Blattproben verwendet wurden. Im Vergleich zu den herkömmlichen CLas-Detektionen kann unsere Methode in 90 Minuten fertiggestellt werden und arbeitet in einem isothermen Zustand.Das Ergebnis kann auch durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld visualisiert werden. Der CLas-DETECTR enthält vier Schritte: Lösungsvorbereitung, Gesamt-DNA-Isolierung von Zitrusfrüchten, isotherme DNA-Amplifikation und die Ergebnisse der Visualisierung. Das Schema des CLas-DETECTR-Assays ist hier dargestellt.Puffer A, Lösung B und Lösung C werden wie im Protokoll beschrieben vorbereitet. Um Zeit zu sparen und diese Methode für den CLas-Nachweis im Feld geeignet zu machen, wurde der E.coli-Polyethylenglykol-basierte Ansatz verwendet, um rohe Pflanzenextrakte für die DNA-Amplifikation zu erhalten. Zitrusblätter werden im Werkzeug verwendet.Stanzen Sie die wenigen Blattscheiben aus dem Blatt. Legen Sie die Blattscheiben in ein 1,5-Milliliter-Eppendorf-Rohr. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Puffer A in das Röhrchen hinzu.Die Blattscheiben manuell mit einem Kunststoffstab glatt schleifen. Lassen Sie die Röhre 10 Minuten ungestört. Der Überstand wird anschließend zur DNA-Amplifikation aufgebracht.Für die isotherme DNA-Amplifikation einen Mikroliter Überstand aus Schritt 2.3 und einen Mikroliter Magnesiumacetat in Lösung B geben und gut mischen. Im Labor inkubieren Sie sie in einem einfachen Inkubator bei 37 Grad für 15 Minuten. Um die Ergebnisse zu visualisieren, fügen Sie 10 Mikroliter der Mischung aus Schritt 3.2 in Lösung C hinzu und mischen Sie gut.Inkubieren Sie sie im 37-Grad-Inkubator für 60 Minuten. Tragen Sie eine Schutzbrille und beobachten Sie das grüne Fluoreszenzsignal durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät. Um die Spezifität von CLas-DETECTR zu testen, wurden zunächst reine Kolonien von Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.Citri, der Erreger des Zitruskrebses, und Burkholderia stabilis Stamm 1440, der in unserem Labor isoliert wurde, wurden verwendet, um ihre genomische DNA zu extrahieren. Dann wurden diese drei Bakterien genomische DNA und die CLas-positive Newhall-Blätter genomische DNA dem CLas-DETECTR-Test unterzogen. Um die Sensitivität von CLas-DETECTR zu testen, wurde eine Reihe von CLas-DNA-Fragmentverdünnungen mittels PCR, CLas-DETECTR und qPCR nachgewiesen, wie im Protokoll beschrieben. Nach dem Spezifitäts- und dem Sensitivitätstest wurde die CLas-DETECTR-Methode verwendet, um das Vorhandensein der CLas im Feld nachzuweisen.Blattproben von Newhall Süßorangenbaum, der in der Keimplasma-Ressourcengärtnerei auf dem Campus der Gannan Normal University, Jiangxi, China, angebaut wurde. qPCR, eine überzeugende CLas-Nachweismethode, die üblicherweise im Labor verwendet wird, wurde ebenfalls angewendet. Die Blattproben von HLB-infizierten und HLB-nicht infizierten Newhall-Bäumen, bei denen das Vorhandensein der CLas in unserem Labor bestätigt wurde, wurden dem CLas-DETECTR-Test unterzogen.Das grüne Fluoreszenzsignal wurde in der HLB-infizierten Probe erfasst, nicht jedoch in der HLB-nicht infizierten und negativen Kontrolle. Wir bestimmten die Spezifität von CLas-DETECTR mit Nukleinsäuren, die aus anderen Bakterien extrahiert wurden. Im CLas-DETECTR-Assay zeigten nur gDNA, die aus CLas-positiven Newhall-Blättern extrahiert wurde, grün fluoreszierende Signale.gDNA, extrahiert aus Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri und Burkholderia stabilis Stamm 1440 nicht, was bedeutet, dass der CLas-DETECTR CLas spezifisch nachweisen kann. Wir testeten auch die Empfindlichkeit von CLas-DETECTR mit einer Reihe von CLas-DNA-Verdünnungen, die im Protokoll aufgeführt sind.PCR kann 201 Kopien pro Megaliter nachweisen. Auf der anderen Seite kann CLas-DETECTR 2,01 Kopien pro Megaliter detektieren, was auf seine Verfügbarkeit als empfindliche Felddiagnose hindeutet. qPCR kann 0,201 Kopien pro Megaliter nachweisen und der Ct-Wert ist höher als 36.CLas-DETECTR ist also zwei Größenordnungen empfindlicher als herkömmliche PCR und eine Größenordnung weniger empfindlich als qPCR, wenn verdünnte CLas-spezifische Amplicons verwendet wurden. Schließlich wurde die Machbarkeit des CLas-DETECTR für Feldproben erneut untersucht und seine Empfindlichkeit mit qPCR verglichen. In Zahlen, sehen wir.Wir können sehen, dass der Ct-Wert höher als 36 ist, wenn die CLas-Konzentration weniger als 0,2 Kopien pro Megaliter beträgt, was eine sehr niedrige Konzentration ist. Unter den 15 Proben betrug der Ct-Wert der mittels qPCR nachgewiesenen Proben 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 und 14 weniger als 36. Ein scheinbares grünes Fluoreszenzsignal wurde beobachtet.Wenn andererseits der Ct-Wert der mittels qPCR nachgewiesenen Proben 6, 7, 9, 12 und 15 unbestimmt war, wurden keine grün fluoreszierenden Signale beobachtet. Darüber hinaus wurden schwache grün fluoreszierende Signale beobachtet, wenn der CT-Wert der Probe 5 und 11, die durch qPCR detektiert wurden, höher als 36 war. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass unsere Plattform ein schnelles, robustes und empfindliches Werkzeug für die HLB-Diagnose im Feld ist.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologie

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