Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी आर एंड डी कार्यक्रम (2021वाईएफडी 1400805), जियांग्शी प्रांत के प्रमुख विज्ञान और प्रौद्योगिकी आर एंड डी कार्यक्रम (20194 एबीसी 28007), जियांग्शी शिक्षा विभाग की परियोजनाओं (जीजेजे 201449), और जियांग्शी प्रांत में आधुनिक कृषि वैज्ञानिक अनुसंधान के सहयोगी नवाचार (जेएक्सएक्सटीसीएक्स 2015002 (3 + 2) -003 द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।

1. CLas-DETECTR का निर्माण
नोट: CLas-DETECTR का निर्माण एक चार-चरण यी प्रक्रिया है: समाधान तैयार करना, साइट्रस कुल डीएनए अलगाव, इज़ोटेर्मल डीएनए प्रवर्धन, और परिणाम विज़ुअलाइज़ेशन। CLas-DETECTR परख की योजनाबद्धता <strong c...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR.">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37 (2009).</li><li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR.">Multiplex detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).</li><li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+from+Murraya+paniculata+in+Guandong,+China.">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).</li><li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+in+citrus,+and+identification+by+GeLC-MS/MS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens.">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272 (2016).</li><li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus,+a+causal+agent+of+citrus+Huanglongbing.">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing.</a> The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).</li><li>Ghosh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+recombinase+polymerase+based+isothermal+amplification+combined+with+lateral+flow+assay+(HLB-RPA-LFA)+for+rapid+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;.">Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;.</a> PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).</li><li>Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+solanacearum'+in+potatoes+and+psyllids.">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li><li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+diagnostics+with+CRISPR.">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13,+Cas12a,+and+Csm6.">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay.">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).</li><li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics.">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568 (2021).</li><li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV,+TEV,+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13.">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay.">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li><li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+amplification:+Basics,+applications+and+recent+advances.">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules.">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;:+Biological+implications+and+PCR+detection+application.">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020 (2016).</li><li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria,+eukaryotic+tissue+samples,+and+whole+blood.">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li><li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

यह अध्ययन CLas-DETECTR नामक CLas का पता लगाने के लिए एक तेज़ और पोर्टेबल विधि प्रस्तुत करता है, जो RPA और CRISPR-Cas12a सिस्टम को जोड़ता है। वर्कफ़्लो चित्र 1 में चित्रित किया गया है। CLas-DETECTR विशिष्टता और संवेदनशीलत?...

हुआंगलोंगबिंग (एचएलबी) दुनिया भर में सबसे अधिक समस्याग्रस्त साइट्रस रोगों में से एक है। एचएलबी फ्लोएम-कोलोनाइजिंग और फास्टिड बैक्टीरिया कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एसपीपी के कारण होता है, जिसमें कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एशियाटिकस (सीएलएएस), सीए एल अफ्रीकनस और सीए एल अमेरिकनस2 शामिल हैं। चीन और संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे प्रचलित एचएलबी से जुड़ी प्रजाति सीएलएएस है, जो एशियाई साइट्रस साइलिड्स (डायफोरिना सिट्री) या ग्राफ्टिंग3 के माध्यम से प्रेषित होती है। क्लैस से संक्रमित होने के बाद, साइट्रस पेड़ मृत्यु तक विकास में गिरावट का प्रदर्शन करतेहैं। क्लैस से संक्रमित साइट्रस पत्तियों के सामान्य लक्षण हैं धब्बेदार मोटल, हरे द्वीप (छोटे गोलाकार गहरे हरे बिंदु), मोटी और चमड़े की पत्तियों पर उभरी हुई कॉर्की नसें, और गैर-समान पीले रंग के अंकुर2। इसके अलावा, क्लैस से संक्रमित फल छोटे और एकतरफा2 दिखाई देते हैं।
चूंकि कोई साइट्रस किस्म एचएलबी के लिए प्रतिरोधी नहीं है और एचएलबी के लिए कोई चिकित्सीय इलाज नहीं है, इसलिए एचएलबी की रोकथाम के लिए सीएलएएस-पॉजिटिव साइट्रस पेड़ों के संगरोध और अलगाव की आवश्यकता होती है। इसलिए, सीएएस के प्रसार को रोकने औरआर्थिक नुकसान को कम करने के लिए निगरानी और संगरोध के लिए प्रारंभिक पहचान महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, संक्रमण के प्रारंभिक चरण के दौरान पौधों में सीएलएएस के कम टिटर के कारण संवेदनशील सीएलएएस का पता लगाने की आवश्यकता होती है। चीन में, CLas का पता लगाना आमतौर पर कुछ प्रमाणित परीक्षण केंद्रों द्वारा आयोजित किया जाता है। हालांकि, पहचान प्रक्रिया में आमतौर पर कम से कम 1 सप्ताह लगते हैं, और पहचान शुल्क महंगा है। इसलिए, एचएलबी घटनाओं की निगरानी में मदद करने के लिए
एचएलबी 4,5,6,7,8,9 के निदान के लिए विभिन्न तकनीकों को लागू किया गया है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) उनकी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता 4,5 के कारण सीएलएएस का पता लगाने के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं। हालांकि, वे प्रौद्योगिकियां महंगे उपकरणों और अत्यधिक कुशल कर्मियों पर बहुत अधिक निर्भर करती हैं। इसके अलावा, कई इज़ोटेर्मल प्रवर्धन विधियाँ, जैसे लूप-मध्यस्थता इज़ोटेर्मल प्रवर्धन (एलएएमपी), को उनकी सादगी, तेजी और कम लागत 8,9,10 के कारण पारंपरिक पीसीआर विधियों के आकर्षक विकल्पके रूप में विकसित किया गया है। हालांकि, गैर-विशिष्ट प्रवर्धन संकेतों के कारण सीएलएएस का सटीक रूप से पता लगाने के लिए उन्हें लागू करना चुनौतीपूर्ण है, जो गलत-सकारात्मक परिणाम पैदा कर सकता है।
आरएनए-निर्देशित सीआरआईएसपीआर/सीएएस (नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट/सीआरआईएसपीआर-संबद्ध) एंडोन्यूक्लिज़-आधारित न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन को इसकी उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता और विश्वसनीयता 11,12,13,14 के कारण अगली पीढ़ी की आणविक निदान तकनीक के रूप में विकसित किया गया है। ये CRISPR/Cas निदान प्रौद्योगिकियां CAS प्रोटीन की संपार्श्विक न्यूक्लियस गतिविधि पर भरोसा करती हैं ताकि ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के प्रत्येक छोर पर एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और एक फ्लोरेसेंस बुझाने वाले के साथ संशोधित एकल-फंसे हुए डीएनए (ssDNA) को छोड़ दिया जा सके, साथ ही जारी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर11,12 को पकड़ने के लिए एक फ्लोरेसेंस डिटेक्शन डिवाइस भी। . सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरआरएनए) टारगेट डुप्लेक्स द्वारा सक्रिय कई कैस प्रभावकों की न्यूक्लियस गतिविधि अंधाधुंध रूप से आसपास के गैर-लक्ष्य एसएसडीएनए11 को छोड़ सकती है। CRISPR-Cas12a (जिसे Cpf 1 भी कहा जाता है), एक वर्ग 2 प्रकार V-A CRISPR / Cas प्रणाली, Cas9 की तुलना में कई फायदे प्रदर्शित करती है, जैसे कि कम बेमेल सहिष्णुता और अधिक विशिष्टता13। कैस 12 ए / सीआरआरएनए प्रणाली को मानव रोगजनकों और फाइटोपैथोजेन्स 14,15,16,17,18 के न्यूक्लिक एसिड की संवेदनशील और विशिष्ट पहचान के लिए लागू किया गया है। इसलिए, Cas12a / crRNA प्रणाली का उपयोग करने से CLas के न्यूक्लिक एसिड का सटीक और संवेदनशील पता लगाने में सक्षम होना चाहिए।
अकेले Cas12a सैद्धांतिक रूप से न्यूक्लिक एसिड के निम्न स्तर का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं है। इसलिए, इसकी पहचान संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए, CRISPR-Cas12a का पता लगाने को आमतौर पर एक इज़ोटेर्मल प्रवर्धन चरण14,15 के साथ जोड़ा जाता है। रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ प्रवर्धन (आरपीए) संवेदनशील और तेजी से इज़ोटेर्मल डीएनए प्रवर्धन को 37 डिग्री सेल्सियस से 42 डिग्री सेल्सियस19 तक के तापमान सीमा में सक्षम बनाता है।
डिटेक्टर (डीएनए एंडोन्यूक्लिज़ टारगेटेड सीआरआईएसपीआर ट्रांस रिपोर्टर) नामक एक डिटेक्शन प्लेटफॉर्म जो सीएएस 12 ए की डीएनएस गतिविधि को आरपीए और फ्लोरेसेंस रीडआउट के साथ जोड़ता है, हाल ही में12 तैयार किया गया है और इसे उच्च संवेदनशीलता20 के साथ न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, सकारात्मक नमूनों से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेत को क्षेत्र में एक हैंडहेल्ड फ्लोरेसेंस डिटेक्शन डिवाइस के माध्यम से देखा जा सकता है।
चूंकि हमने आरपीए के साथ डीएनए को प्रवर्धित किया, सीएलएस21 के लिए विशिष्ट पांच-कॉपी एनआरडीबी (राइबोन्यूक्लियोटाइड रिडक्टेस β-सबयूनिट) जीन को लक्षित करने वाले सीआरआरएनए को डिजाइन किया, और कैस 12 ए प्रोटीन की डीनेस गतिविधि को नियोजित किया, इसलिए हमने इस क्लैस डिटेक्शन विधि को सीएलएएस-डिटेक्टर कहा। मौजूदा CLas डिटेक्शन विधियों की तुलना में, CLas-DETECTR तेज, सटीक, संवेदनशील और तैनात करने योग्य है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

साइट्रस उत्पादकों द्वारा कैंडिडाटस लाइबेरिबैक्टर एशियाटिकस (सीएलएएस) का प्रारंभिक पता लगाने से प्रारंभिक हस्तक्षेप की सुविधा मिलती है और बीमारी के प्रसार को रोका जा सकता है। तेजी से और पोर्टेबल हुआंगलोंगबिंग (एचएलबी) निदान के लिए एक सरल विधि यहां प्रस्तुत की गई है जो रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ प्रवर्धन और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को जोड़ती है जो नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट / सीआरआईएसपीआर-संबद्ध 12 ए (सीआरआईएसपीआर-सीएएस 12 ए) प्रणाली की न्यूक्लियस गतिविधि का उपयोग करती है। इस तकनीक की संवेदनशीलता पीसीआर की तुलना में बहुत अधिक है। इसके अलावा, इस विधि ने क्यूपीसीआर के समान परिणाम दिखाए जब पत्ती के नमूनों का उपयोग किया गया था। पारंपरिक सीएलएएस डिटेक्शन विधियों की तुलना में, यहां प्रस्तुत पहचान विधि 90 मिनट में पूरी की जा सकती है और एक इज़ोटेर्मल स्थिति में काम करती है जिसे पीसीआर मशीनों के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, परिणामों को क्षेत्र में एक हैंडहेल्ड फ्लोरोसेंट डिटेक्शन डिवाइस के माध्यम से देखा जा सकता है।

यहां, हमने एक पोर्टेबल प्लेटफॉर्म, CLas-DETECTR का वर्णन किया है, जो क्षेत्र में एचएलबी का निदान करने के लिए आरपीए और CRISPR-Cas12a सिस्टम को कंघी करता है। CLas-DETECTR की स्कीमा चित्रा 1 ए में चित्रित की गई है।
<p class="jove...

Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

इस काम में, सीआरआईएसपीआर-सीएएस 12 ए के साथ संयुक्त रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ प्रवर्धन के आधार पर कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एशियाटिकस के लिए एक तेजी से, संवेदनशील और पोर्टेबल पहचान विधि विकसित की गई थी।

सीआरआईएसपीआर-सीएएस 12 ए के साथ संयुक्त रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ एम्प्लीफिकेशन का उपयोग करके फील्ड-तैनाती योग्य कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एशियाटिकस डिटेक्शन

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

हुआंग लॉन्ग बिंग, एचएलबी के रूप में संक्षिप्त। यह दुनिया भर में एक विनाशकारी साइट्रस बीमारी है। चीन और संयुक्त राज्य अमेरिका जैसे सबसे अधिक साइट्रस उत्पादक देशों में, एचएलबी फ्लोएम-प्रतिबंधित बैक्टीरिया कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एशियाटिकस के कारण होता है, जिसे क्लैस के रूप में संक्षिप्त किया जाता है।ग् ला का शीघ्र पता लगाना उत्पादकों के लिए महत्वपूर्ण था ताकि वे शीघ्र हस्तक्षेप कर सकें और रोग के प्रसार को रोक सकें। तो यहां हमने तेजी से और पोर्टेबल एचएलबी निदान के लिए एक नई विधि विकसित की, जो रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ प्रवर्धन और सीआरआईएसपीआर-सीएएस 12 ए प्रणाली के साथ संयोजन है। हमने इसे CLas-DETECTR कहा।हमारे प्लेटफॉर्म की संवेदनशीलता पीसीआर की तुलना में बहुत अधिक है। इसके अलावा, यह क्यूपीसीआर के साथ समान परिणाम दिखाता है जब पत्ती के नमूनों का उपयोग किया गया था। पारंपरिक सीएलएएस डिटेक्शन के साथ तुलना करें, हमारी विधि 90 मिनट में समाप्त हो सकती है, और एक इज़ोटेर्मल स्थिति में काम करती है।परिणाम को क्षेत्र में एक हैंडहेल्ड फ्लोरोसेंट डिटेक्शन डिवाइस के माध्यम से भी देखा जा सकता है। क्लैस-डिटेक्टर में चार चरण होते हैं: समाधान तैयार करना, साइट्रस कुल डीएनए अलगाव, इज़ोटेर्मल डीएनए प्रवर्धन, और विज़ुअलाइज़ेशन के परिणाम। CLas-DETECTR परख की योजनाबद्धता यहां सचित्र है।बफर ए, समाधान बी, और समाधान सी प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में तैयार किए जाते हैं। समय बचाने और इस विधि को फील्ड क्लैस का पता लगाने के लिए उपयुक्त बनाने के लिए, डीएनए प्रवर्धन के लिए कच्चे पौधे के अर्क प्राप्त करने के लिए ई.कोलाई पॉलीथीन ग्लाइकोल-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। उपकरण में खट्टे पत्तों का उपयोग किया जाता है।पत्ती से पत्ती डिस्क के कुछ टुकड़ों को पंच करें। पत्ती डिस्क को 1.5 मिलीलीटर एपेंडोर्फ ट्यूब में डालें। फिर, ट्यूब में बफर ए के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।पत्ती डिस्क को मैन्युअल रूप से प्लास्टिक रॉड के साथ चिकना होने तक पीस लें। ट्यूब को 10 मिनट के लिए अबाधित छोड़ दें। सुपरनैटेंट को बाद में डीएनए प्रवर्धन पर लागू किया जाता है।आइसोथर्मल डीएनए प्रवर्धन के लिए, चरण 2.3 से सतह पर तैरने वाला एक माइक्रोलीटर और मैग्नीशियम एसीटेट का एक माइक्रोलीटर घोल बी में जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं। प्रयोगशाला में, उन्हें 15 मिनट के लिए 37 डिग्री पर एक साधारण इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। परिणामों की कल्पना करने के लिए, चरण 3.2 से मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर को समाधान सी में जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।उन्हें 60 मिनट के लिए 37 डिग्री इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। एक चश्मा पहनें, और हैंडहेल्ड फ्लोरोसेंट डिटेक्शन डिवाइस के माध्यम से हरे रंग के प्रतिदीप्ति संकेत का निरीक्षण करें। क्लैस-डिटेक्टर की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसियन्स जीवी 3101, ज़ैंथोमोनास सिट्री सबएसपी की पहली शुद्ध कॉलोनियां।सिट्री जो साइट्रस कैंकर और बर्कहोल्डरिया स्टेबलाइज़ स्ट्रेन 1440 का रोगज़नक़ है, हमारी प्रयोगशाला में पृथक उनके जीनोमिक डीएनए को निकालने के लिए उपयोग किया गया था। फिर इस तीन बैक्टीरिया जीनोमिक डीएनए और सीएलएएस-पॉजिटिव न्यूहॉल पत्तियों जीनोमिक डीएनए को क्लैस-डिटेक्टर परीक्षण के अधीन किया गया था। CLas-DETECTR की संवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए, पीसीआर, CLas-DETECTR और QPCR का उपयोग करके CLas DNA टुकड़ा कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला का पता लगाया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है विशिष्टता और संवेदनशीलता परीक्षण के बाद, क्षेत्र में CLas की उपस्थिति का पता लगाने के लिए CLas-DETECTR विधि का उपयोग किया गया था।चीन के जियांग्शी स्थित गन्नान नॉर्मल यूनिवर्सिटी के परिसर में जर्मप्लाज्म रिसोर्स नर्सरी में उगाए गए न्यूहॉल मीठे नारंगी पेड़ से लीप के नमूने एकत्र किए गए। क्यूपीसीआर, आमतौर पर प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली एक ठोस सीएलएएस पहचान विधि भी लागू की गई थी। एचएलबी-संक्रमित और एचएलबी-असंक्रमित न्यूहॉल पेड़ से पत्ती के नमूने, जिसमें हमारी प्रयोगशाला में सीएलएएस की उपस्थिति की पुष्टि की गई थी, को क्लैस-डिटेक्टर परीक्षण के अधीन किया गया था।हरे रंग के प्रतिदीप्ति संकेत को एचएलबी-संक्रमित नमूने में कैप्चर किया गया था, लेकिन एचएलबी-असंक्रमित और नकारात्मक नियंत्रण में नहीं। हमने अन्य बैक्टीरिया से निकाले गए न्यूक्लिक एसिड का उपयोग करके क्लैस-डिटेक्टर की विशिष्टता निर्धारित की। CLas-DETECTR परख में, CLas-पॉजिटिव न्यूहॉल पत्तियों से निकाले गए केवल gDNA ने हरे फ्लोरोसेंट संकेतों का प्रदर्शन किया।एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसियंस जीवी 3101, ज़ैंथोमोनास सिट्री सबएसपी सिट्री और बर्कहोल्डरिया स्टेबलाइज़िंग स्ट्रेन 1440 से निकाले गए जीडीएनए ने ऐसा नहीं किया, जिसका अर्थ है कि क्लैस-डिटेक्टर विशेष रूप से सीएलएएस का पता लगा सकता है। हमने प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध सीएलएएस डीएनए कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला का उपयोग करके क्लैस-डिटेक्टर की संवेदनशीलता का भी परीक्षण किया।पीसीआर प्रति मेगालीटर 201 प्रतियों का पता लगा सकता है। दूसरी ओर, CLas-DETECTR प्रति मेगालीटर 2.01 प्रतियों का पता लगा सकता है, जो एक संवेदनशील क्षेत्र निदान के रूप में इसकी उपलब्धता का सुझाव देता है। क्यूपीसीआर प्रति मेगालीटर 0.201 प्रतियों का पता लगा सकता है और सीटी मान 36 से अधिक है।इसलिए CLas-DETECTR पारंपरिक पीसीआर की तुलना में अधिक संवेदनशील परिमाण के दो आदेश हैं और क्यूपीसीआर की तुलना में कम संवेदनशील परिमाण का एक क्रम है जब पतला CLas विशिष्ट एम्प्लिकॉन का उपयोग किया गया था। अंत में, क्षेत्र के नमूनों के लिए सीएलएएस-डिटेक्टर की व्यवहार्यता की फिर से जांच की गई, और क्यूपीसीआर के साथ इसकी संवेदनशीलता की तुलना की गई। आंकड़ों में, हम देखते हैं।हम देख सकते हैं कि सीटी मान 36 से अधिक है जब सीएलएएस एकाग्रता प्रति मेगालीटर 0.2 प्रतियों से कम है, जो बहुत कम एकाग्रता है। 15 नमूनों में से, क्यूपीसीआर द्वारा पता लगाए गए नमूने 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 और 14 का सीटी मान 36 से कम था। एक स्पष्ट हरे रंग के प्रतिदीप्ति संकेत देखे गए थे।दूसरी ओर, जब क्यूपीसीआर द्वारा पता लगाए गए नमूने 6, 7, 9, 12 और 15 का सीटी मान अनिर्धारित था, तो कोई हरे फ्लोरोसेंट सिग्नल नहीं देखे गए थे। इसके अलावा, कमजोर हरे फ्लोरोसेंट सिग्नल तब देखे गए जब क्यूपीसीआर द्वारा पता लगाए गए नमूना 5 और 11 का सीटी मान 36 से अधिक था। परिणाम सुझाव देंगे कि हमारा मंच क्षेत्र में एचएलबी निदान के लिए एक तेज़, मजबूत और संवेदनशील उपकरण है।

Research

JoVE Journal

Biology

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

गैर इनवेसिव पता लगाने के लिए प्रतिदीप्त रंगों के साथ ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ स्टेम सेल लेबल

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

साइट विशिष्ट Recombinase प्रौद्योगिकी (SSR) के सिद्धांतों

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Tre Recombinase के आण्विक विकास

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

साक्षात्कार: एचआईवी-1 Proviral डीएनए एक विकसित Recombinase का उपयोग छांटना

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

क्रोमोजोम नकल फ्लोरोसेंट के साथ संयुक्त समय<em&gt; सीटू में</em&gt; संकरण

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

उच्च संकल्प पिघल विश्लेषण के साथ पीसीआर का उपयोग तेजी से और कुशल Zebrafish जीनोटाइपिंग

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

सेल विशिष्ट उप-जनसंख्या से शाही सेना अलगाव रैपिड immunolabeling के साथ संयुक्त लेजर कब्जा Microdissection का प्रयोग

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के साथ एक मात्रात्मक recombinase पोलीमरेज़ प्रवर्धन परख के विकास

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...