Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal National Key R & S Program of China (2021YFD1400805), dal Major Science and Technology R & S Program della provincia di Jiangxi (20194ABC28007), dai progetti del Dipartimento dell'istruzione di Jiangxi (GJJ201449) e dall'innovazione collaborativa della moderna ricerca scientifica agricola nella provincia di Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2)-003).

1. Costruzione del CLas-DETECTR
NOTA: La costruzione di CLas-DETECTR è un processo in quattro fasi: preparazione della soluzione, isolamento totale del DNA degli agrumi, amplificazione isotermica del DNA e visualizzazione dei risultati. Lo schema del test CLas-DETECTR è illustrato nella Figura 1A.
<ol><li>Preparazione della soluzione<ol><li>Preparare il tampone A: 20 mM NaOH in PEG 200 al 6%. Per 100 ml, aggiungere 113 mg di NaOH e 6 g di PEG 200 in 80 ml di H...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+in+citrus,+and+identification+by+GeLC-MS/MS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens.">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272 (2016).</li><li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. 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G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

Questo studio presenta un metodo rapido e portatile per rilevare CLas chiamato CLas-DETECTR, che combina i sistemi RPA e CRISPR-Cas12a. Il flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1. CLas-DETECTR rileva CLas con specificità e sensibilità (Figura 2 e Figura 3). Inoltre, utilizzando campioni di foglie di Newhall, CLas-DETECTR rileva CLas con la stessa sensibilità della qPCR (Figura 4</strong...

Huanglongbing (HLB) è una delle malattie degli agrumi più problematiche in tutto il mondo1. L'HLB è causata dai batteri filocolonizzatori e fastidiosi Candidatus Liberibacter spp., tra cui Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus e Ca. L. americanus 2. La specie associata all'HLB più diffusa in Cina e negli Stati Uniti è CLas, che viene trasmessa dalle psillidi asiatiche degli agrumi (Diaphorina citri) o attraverso l'innesto3. Dopo essere stati infettati da CLas, gli alberi di agrumi mostrano un declino della crescita fino alla morte2. I sintomi comuni delle foglie di agrumi infettate da CLas sono chiazze chiazzate, isole verdi (piccoli punti circolari verde scuro), vene di sughero sollevate su foglie più spesse e coriacee e germogli ingialliti non uniformi2. Inoltre, i frutti infetti da CLas appaiono piccoli e sbilenchi2.
Poiché nessuna varietà di agrumi è resistente all'HLB e non esiste una cura terapeutica per l'HLB, la prevenzione dell'HLB richiede la quarantena e l'isolamento degli alberi di agrumi CLas-positivi 2,3. Pertanto, la diagnosi precoce è fondamentale per il monitoraggio e la quarantena per prevenire la diffusione di CLas e ridurre al minimo le perdite economiche3. Inoltre, è necessario rilevare CLas sensibili a causa del basso titolo di CLas nelle piante durante la fase iniziale dell'infezione3. In Cina, il rilevamento di CLas viene solitamente condotto da alcuni centri di test certificati. Tuttavia, il processo di rilevamento richiede in genere almeno 1 settimana e la tassa di rilevamento è costosa. Pertanto, per aiutare a monitorare l'incidenza di HLB
Varie tecnologie sono state applicate per diagnosticare HLB 4,5,6,7,8,9. La reazione a catena della polimerasi (PCR) e la PCR quantitativa (qPCR) sono gli strumenti più utilizzati per la rilevazione di CLas grazie alla loro elevata sensibilità e specificità 4,5. Tuttavia, queste tecnologie si basano fortemente su strumenti costosi e personale altamente qualificato. Inoltre, diversi metodi di amplificazione isotermica, come l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP), sono stati sviluppati come alternative interessanti ai metodi PCR convenzionali grazie alla loro semplicità, rapidità e basso costo 8,9,10. Tuttavia, è difficile applicarli per rilevare con precisione i CLas a causa dei segnali di amplificazione non specifici, che possono causare risultati falsi positivi.
Il rilevamento dell'acido nucleico basato su endonucleasi CRISPR / Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) guidato da RNA è stato sviluppato come tecnologia di diagnostica molecolare di nuova generazione grazie alla sua elevata sensibilità, specificità e affidabilità11,12,13,14. Queste tecnologie diagnostiche CRISPR/Cas si basano sull'attività di nucleasi collaterale delle proteine Cas per scindere il DNA a singolo filamento (ssDNA) modificato con un reporter fluorescente e un quencher di fluorescenza a ciascuna estremità degli oligonucleotidi, nonché un dispositivo di rilevamento della fluorescenza per catturare il reporter fluorescente rilasciato11,12 . L'attività nucleasica di diversi effettori Cas attivati dal duplex bersaglio dell'RNA CRISPR (crRNA) può scindere indiscriminatamente il circostante ssDNA11 non bersaglio. CRISPR-Cas12a (chiamato anche Cpf 1), un sistema CRISPR/Cas di classe 2 di tipo V-A, dimostra diversi vantaggi rispetto a Cas9, come una minore tolleranza al mismatch e una maggiore specificità13. Il sistema Cas12a/crRNA è stato applicato per la rilevazione sensibile e specifica degli acidi nucleici di patogeni umani e fitopatogeni 14,15,16,17,18. Pertanto, l'utilizzo del sistema Cas12a/crRNA dovrebbe consentire la rilevazione accurata e sensibile dell'acido nucleico di CLas.
Cas12a da solo non è teoricamente abbastanza sensibile da rilevare bassi livelli di acidi nucleici. Pertanto, per migliorare la sua sensibilità di rilevamento, il rilevamento CRISPR-Cas12a è tipicamente combinato con un passo di amplificazione isoterma14,15. L'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) consente un'amplificazione del DNA isoterma sensibile e rapida in un intervallo di temperatura da 37 °C a 42 °C19.
Una piattaforma di rilevamento chiamata DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) che combina l'attività DNasi di Cas12a con RPA e una lettura della fluorescenza è stata recentemente ideata12 e ha dimostrato di rilevare l'acido nucleico con una maggiore sensibilità20. Inoltre, il segnale di fluorescenza emesso dai campioni positivi può essere osservato attraverso un dispositivo portatile di rilevamento della fluorescenza sul campo.
Poiché abbiamo amplificato il DNA con RPA, progettato crRNA mirato al gene nrdB (subunità della ribonucleotide reduttasi β-subunità) a cinque copie specifico di CLas21 e impiegato l'attività DNasi della proteina Cas12a, abbiamo chiamato questo metodo di rilevamento CLas CLas-DETECTR. Rispetto ai metodi di rilevamento CLas esistenti, CLas-DETECTR è veloce, accurato, sensibile e implementabile.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

La diagnosi precoce di Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) da parte degli agrumicoltori facilita l'intervento precoce e previene la diffusione della malattia. Qui viene presentato un semplice metodo per la diagnosi rapida e portatile di Huanglongbing (HLB) che combina l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e un reporter fluorescente che utilizza l'attività nucleasica del sistema 12a (CRISPR-Cas12a) associato a CRISPR regolarmente intervallato. La sensibilità di questa tecnica è molto più alta della PCR. Inoltre, questo metodo ha mostrato risultati simili alla qPCR quando sono stati utilizzati campioni di foglie. Rispetto ai metodi di rilevamento CLas convenzionali, il metodo di rilevamento qui presentato può essere completato in 90 minuti e funziona in una condizione isotermica che non richiede l'uso di macchine PCR. Inoltre, i risultati possono essere visualizzati attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile sul campo.

Qui, abbiamo descritto una piattaforma portatile, CLas-DETECTR, che combina i sistemi RPA e CRISPR-Cas12a per diagnosticare HLB sul campo. Lo schema di CLas-DETECTR è illustrato nella Figura 1A.
Quando campioni di foglie provenienti dagli alberi di Newhall infetti da HLB e non infetti da HLB (Figura 1B), per i quali la presenza di CLas è stata confermata dalla PCR (Figura 1C), sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR, è stato osservato un segnale di fluoresce...

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Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

In questo lavoro, è stato sviluppato un metodo di rilevamento rapido, sensibile e portatile per Candidatus Liberibacter asiaticus basato sull'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a.

Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, abbreviato in HLB. È una malattia degli agrumi devastante in tutto il mondo. Nei paesi più produttori di agrumi, come la Cina e gli Stati Uniti, l'HLB è causata dal batterio limitato al floema Candidatus Liberibacter asiaticus, abbreviato in CLas.La diagnosi precoce delle CLa è stata importante per i coltivatori che facilitano l'intervento precoce e prevengono la diffusione della malattia. Quindi qui abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la diagnosi rapida e portatile di HLB, combinato con l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e il sistema CRISPR-Cas12a. L'abbiamo chiamato CLas-DETECTR.La sensibilità della nostra piattaforma è molto più alta della PCR. Inoltre, mostra risultati simili con qPCR quando sono stati utilizzati i campioni di foglie. Confronta con i rilevamenti CLas convenzionali, il nostro metodo può essere completato in 90 minuti e funziona in una condizione isotermica.Il risultato può anche essere visualizzato attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile sul campo. Il CLas-DETECTR contiene quattro fasi: preparazione della soluzione, isolamento totale del DNA degli agrumi, amplificazione isotermica del DNA e risultati della visualizzazione. Lo schema del test CLas-DETECTR è illustrato qui.Il buffer A, la soluzione B e la soluzione C vengono preparati come descritto nel protocollo. Per risparmiare tempo e rendere questo metodo adatto per il rilevamento di CLas sul campo, è stato utilizzato l'approccio basato sul glicole polietilenico E.coli per ottenere estratti vegetali grezzi per l'amplificazione del DNA. Le foglie di agrumi sono utilizzate nello strumento.Perforare i pochi pezzi di dischi fogliari dalla foglia. Mettere i dischi fogliari in un tubo Eppendorf da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere 200 microlitri di Buffer A nel tubo.Macinare manualmente i dischi fogliari fino a lisci con un'asta di plastica. Lasciare il tubo indisturbato per 10 minuti. Il surnatante viene successivamente applicato all'amplificazione del DNA.Per l'amplificazione isotermica del DNA, aggiungere un microlitro di surnatante dal punto 2.3 e un microlitro di acetato di magnesio nella soluzione B e mescolare bene. In laboratorio, incubarli in una semplice incubatrice a 37 gradi per 15 minuti. Per visualizzare i risultati, aggiungere 10 microlitri della miscela dal punto 3.2 nella soluzione C e mescolare bene.Incubali nell'incubatore a 37 gradi per 60 minuti. Indossare una maschera e osservare il segnale di fluorescenza verde attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile. Per testare la specificità di CLas-DETECTR, prime colonie pure di Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.Citri, che è il patogeno del cancro degli agrumi, e Burkholderia stabilis ceppo 1440 isolato nel nostro laboratorio sono stati utilizzati per estrarre il loro DNA genomico. Quindi questo DNA genomico di tre batteri e il DNA genomico delle foglie di Newhall CLas-positive sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR. Per testare la sensibilità di CLas-DETECTR, sono state rilevate una serie di diluizioni di frammenti di DNA CLas utilizzando PCR, CLas-DETECTR e qPCR come descritto nel protocollo Dopo la specificità e il test di sensibilità, è stato utilizzato il metodo CLas-DETECTR per rilevare la presenza di CLas in campo.Campioni di foglie raccolti dall'albero di arancio dolce di Newhall coltivato nel vivaio di risorse di germoplasma nel campus della Gannan Normal University, Jiangxi, Cina. È stato applicato anche qPCR, un convincente metodo di rilevamento CLas solitamente utilizzato in laboratorio. I campioni di foglie dell'albero Newhall infetto da HLB e non infetto da HLB, in cui è stata confermata la presenza di CLas nel nostro laboratorio, sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR.Il segnale di fluorescenza verde è stato catturato nel campione infetto da HLB, ma non nel controllo HLB-non infetto e negativo. Abbiamo determinato la specificità di CLas-DETECTR utilizzando acidi nucleici estratti da altri batteri. Nel test CLas-DETECTR, solo il gDNA estratto dalle foglie di Newhall CLas-positive ha dimostrato segnali fluorescenti verdi.Il gDNA estratto da Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri e Burkholderia stabilis ceppo 1440 non lo ha fatto, il che significa che CLas-DETECTR può rilevare CLas in modo specifico. Abbiamo anche testato la sensibilità di CLas-DETECTR utilizzando una serie di diluizioni del DNA CLas, elencate nel protocollo.La PCR può rilevare 201 copie per megalitro. D'altra parte, CLas-DETECTR può rilevare 2,01 copie per megalitro, suggerendo la sua disponibilità come diagnostica di campo sensibile. qPCR può rilevare 0,201 copie per megalitro e il valore Ct è superiore a 36.Quindi CLas-DETECTR è due ordini di grandezza più sensibile della PCR tradizionale e un ordine di grandezza meno sensibile della qPCR quando sono stati utilizzati ampliconi specifici CLas diluiti. Infine, ha riesaminato la fattibilità del CLas-DETECTR per i campioni sul campo e ha confrontato la sua sensibilità con la qPCR. In cifre, vediamo.Possiamo vedere che il valore Ct è superiore a 36 quando la concentrazione di CLas è inferiore a 0,2 copie per megalitro, che è una concentrazione molto bassa. Tra i 15 campioni, il valore Ct dei campioni 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 e 14 rilevati da qPCR era inferiore a 36. È stato osservato un apparente segnale di fluorescenza verde.D'altra parte, quando il valore Ct dei campioni 6, 7, 9, 12 e 15 rilevati da qPCR era indeterminato, non è stato osservato alcun segnale fluorescente verde. Inoltre, sono stati osservati deboli segnali fluorescenti verdi quando il valore CT dei campioni 5 e 11 rilevati dalla qPCR era superiore a 36. I risultati suggeriscono che la nostra piattaforma è uno strumento rapido, robusto e sensibile per la diagnosi HLB sul campo.

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