Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av National Key R &D Program of China (2021YFD1400805), Major Science and Technology R &&D-programmet i Jiangxi-provinsen (20194ABC28007), Prosjekter av Jiangxi Education Department (GJJ201449), og Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research i Jiangxi-provinsen (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).

1. Konstruksjon av CLas-DETECTR
MERK: Konstruksjonen av CLas-DETECTR er en fire-trinns prosess: løsningsforberedelse, sitrus total DNA-isolasjon, isotermisk DNA-amplifisering og resultatvisualisering. Skjemaet til CLas-DETECTR-analysen er illustrert i figur 1A.
<ol><li>Løsning forberedelse<ol><li>Forbered buffer A: 20 mM NaOH i 6% PEG 200. For 100 ml, tilsett 113 mg NaOH og 6 g PEG 200 i 80 ml H2O i en flaske. Inkuber flasken i et vannbad ved 60 °C...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR.">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37 (2009).</li><li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR.">Multiplex detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).</li><li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+from+Murraya+paniculata+in+Guandong,+China.">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).</li><li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+in+citrus,+and+identification+by+GeLC-MS/MS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens.">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272 (2016).</li><li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus,+a+causal+agent+of+citrus+Huanglongbing.">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing.</a> The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).</li><li>Ghosh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+recombinase+polymerase+based+isothermal+amplification+combined+with+lateral+flow+assay+(HLB-RPA-LFA)+for+rapid+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;.">Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;.</a> PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).</li><li>Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+solanacearum'+in+potatoes+and+psyllids.">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li><li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+diagnostics+with+CRISPR.">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13,+Cas12a,+and+Csm6.">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay.">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).</li><li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics.">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568 (2021).</li><li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV,+TEV,+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13.">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay.">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li><li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+amplification:+Basics,+applications+and+recent+advances.">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules.">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;:+Biological+implications+and+PCR+detection+application.">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020 (2016).</li><li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria,+eukaryotic+tissue+samples,+and+whole+blood.">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li><li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

Denne studien presenterer en rask og bærbar metode for å oppdage CLas kalt CLas-DETECTR, som kombinerer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemene. Arbeidsflyten er illustrert i figur 1. CLas-DETECTR detekterer CLas med spesifisitet og følsomhet (figur 2 og figur 3). Ved bruk av Newhall-bladprøver detekterer CLas-DETECTR CLas med samme følsomhet som qPCR (figur 4). Spesielt kan deteksjonsresu...

Huanglongbing (HLB) er en av de mest problematiske sitrussykdommene i verden1. HLB er forårsaket av de floemkoloniserende og kresne bakteriene Candidatus Liberibacter spp., inkludert Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus og Ca. L. americanus 2. Den mest utbredte HLB-assosierte arten i Kina og USA er CLas, som overføres av asiatiske sitruspsyllider (Diaphorina citri) eller gjennom podning3. Etter å ha blitt smittet av CLas, viser sitrustrær vekstnedgang tildøden 2. De vanlige symptomene på sitrusblader infisert med CLas er flekkete mottle, grønne øyer (små sirkulære mørkegrønne prikker), hevede korketårer på tykkere og skinnende blader og nonuniform gulningsskudd2. I tillegg virker frukt smittet med CLas liten og skjev2.
Siden ingen sitrussort er motstandsdyktig mot HLB og det ikke finnes noen terapeutisk kur for HLB, krever forebygging av HLB karantene og isolering av CLas-positive sitrustrær 2,3. Derfor er tidlig deteksjon avgjørende for overvåking og karantene for å forhindre spredning av CLas og minimere økonomiske tap3. I tillegg er sensitiv CLas-deteksjon nødvendig på grunn av den lave titeren av CLas i planter i det tidlige infeksjonsstadiet3. I Kina utføres CLas-deteksjon vanligvis av visse sertifiserte testsentre. Imidlertid tar deteksjonsprosessen vanligvis minst 1 uke, og deteksjonsgebyret er dyrt. Derfor, for å bidra til å overvåke forekomsten av HLB
Ulike teknologier har blitt brukt til å diagnostisere HLB 4,5,6,7,8,9. Polymerasekjedereaksjon (PCR) og kvantitativ PCR (qPCR) er de mest brukte verktøyene for CLas-deteksjon på grunn av deres høye følsomhet og spesifisitet 4,5. Imidlertid er disse teknologiene avhengige av dyre instrumenter og høyt kvalifisert personell. I tillegg har flere isotermiske amplifikasjonsmetoder, som sløyfemediert isotermisk forsterkning (LAMP), blitt utviklet som attraktive alternativer til konvensjonelle PCR-metoder på grunn av deres enkelhet, hurtighet og lave kostnader 8,9,10. Det er imidlertid utfordrende å bruke dem til å nøyaktig oppdage CLas på grunn av de ikke-spesifikke forsterkningssignalene, noe som kan forårsake falske positive resultater.
RNA-guidet CRISPR / Cas (gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner / CRISPR-assosiert) endonukleasebasert nukleinsyredeteksjon er utviklet som en neste generasjons molekylær diagnostikkteknologi på grunn av sin høye følsomhet, spesifisitet og pålitelighet11,12,13,14. Disse CRISPR / Cas-diagnostikkteknologiene er avhengige av sikkerhetskjerneaktiviteten til Cas-proteiner for å spalte enkeltstrenget DNA (ssDNA) modifisert med en fluorescerende reporter og en fluorescensslukker i hver ende av oligonukleotidene, samt en fluorescensdeteksjonsenhet for å fange den frigjorte fluorescerende reporteren11,12 . Nukleaseaktiviteten til flere Cas-effektorer aktivert av CRISPR RNA (crRNA) måldupleks kan ukritisk spalte det omkringliggende ikke-mål ssDNA11. CRISPR-Cas12a (også kalt Cpf 1), et klasse 2 type V-A CRISPR/Cas-system, demonstrerer flere fordeler sammenlignet med Cas9, for eksempel lavere mismatchtoleranse og større spesifisitet13. Cas12a / crRNA-systemet har blitt brukt for sensitiv og spesifikk påvisning av nukleinsyrene til humane patogener og fytopatogener 14,15,16,17,18. Derfor bør bruk av Cas12a / crRNA-systemet muliggjøre nøyaktig og sensitiv deteksjon av nukleinsyren av CLas.
Cas12a alene er ikke teoretisk følsomt nok til å oppdage lave nivåer av nukleinsyrer. Derfor, for å forbedre deteksjonsfølsomheten, kombineres CRISPR-Cas12a-deteksjon vanligvis med et isotermisk forsterkningstrinn14,15. Rekombinase polymeraseforsterkning (RPA) muliggjør sensitiv og rask isotermisk DNA-amplifisering i et temperaturområde fra 37 °C til 42 °C19.
En deteksjonsplattform kalt DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) som kombinerer DNase-aktiviteten til Cas12a med RPA og en fluorescensavlesning, er nylig utviklet12 og har vist seg å oppdage nukleinsyre med høyere følsomhet20. Videre kan fluorescenssignalet som sendes ut fra de positive prøvene observeres gjennom en håndholdt fluorescensdeteksjonsanordning i feltet.
Siden vi forsterket DNA med RPA, designet crRNA rettet mot fem-kopi nrdB (ribonukleotidreduktase β- subenhet) -genet spesifikt for CLas21, og benyttet DNase-aktiviteten til Cas12a-proteinet, kalte vi denne CLas-deteksjonsmetoden CLas-DETECTR. Sammenlignet med eksisterende CLas-deteksjonsmetoder er CLas-DETECTR rask, nøyaktig, sensitiv og distribuerbar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

Tidlig påvisning av Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) av sitrusdyrkere letter tidlig intervensjon og forhindrer spredning av sykdom. En enkel metode for rask og bærbar Huanglongbing (HLB) diagnose presenteres her som kombinerer rekombinase polymeraseforsterkning og en fluorescerende reporter som benytter nukleaseaktiviteten til det grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner / CRISPR-assosiert 12a (CRISPR-Cas12a) system. Følsomheten til denne teknikken er mye høyere enn PCR. Videre viste denne metoden lignende resultater som qPCR når bladprøver ble brukt. Sammenlignet med konvensjonelle CLas-deteksjonsmetoder, kan deteksjonsmetoden som presenteres her fullføres på 90 minutter og fungerer i en isotermisk tilstand som ikke krever bruk av PCR-maskiner. I tillegg kan resultatene visualiseres gjennom en håndholdt fluorescerende deteksjonsenhet i feltet.

Her har vi beskrevet en bærbar plattform, CLas-DETECTR, som kombinerer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemene for å diagnostisere HLB i felten. Skjemaet til CLas-DETECTR er illustrert i figur 1A.
Når bladprøver fra de HLB-infiserte og HLB-infiserte Newhall-trærne (figur 1B), der tilstedeværelsen av CLas ble bekreftet av PCR (figur 1C), ble utsatt for CLas-DETECTR-testen, ble det sett et grønt fluorescenssignal i den HLB-infiserte prøven, men ikke i den HLB-infise...

Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

I dette arbeidet ble det utviklet en rask, sensitiv og bærbar deteksjonsmetode for Candidatus Liberibacter asiaticus basert på rekombinasepolymeraseforsterkning kombinert med CRISPR-Cas12a.

Felt-deployerbar Candidatus Liberibacter asiaticus deteksjon ved bruk av rekombinase polymeraseforsterkning kombinert med CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, forkortet til HLB. Det er en ødeleggende sitrus sykdom over hele verden. I de mest sitrusproduserende landene, som Kina og USA, er HLB forårsaket av den floembegrensede bakterien Candidatus Liberibacter asiaticus, forkortet CLas.Tidlig påvisning av CLas var viktig for dyrkere som letter tidlig intervensjon og forhindrer sykdomsspredning. Så her utviklet vi en ny metode for rask og bærbar HLB-diagnose, kombinert med rekombinasepolymeraseforsterkning og CRISPR-Cas12a-systemet. Vi kalte det CLas-DETECTR.Følsomheten til plattformen vår er mye høyere enn PCR. Videre viser det lignende resultat med qPCR når bladprøvene ble brukt. Sammenlign med de konvensjonelle CLas-deteksjonene, vår metode kan være ferdig på 90 minutter, og fungerer i isotermisk tilstand.Resultatet kan også visualiseres gjennom en håndholdt fluorescerende deteksjonsenhet i feltet. CLas-DETECTR inneholder fire trinn: løsningsforberedelse, sitrus total DNA-isolasjon, isotermisk DNA-amplifisering og resultatene av visualisering. Skjemaet for CLas-DETECTR-analysen er illustrert her.Buffer A, løsning B og løsning C fremstilles som beskrevet i protokollen. For å spare tid og gjøre denne metoden egnet for felt-CLas-deteksjon, ble E.coli-polyetylenglykolbasert tilnærming brukt til å oppnå rå planteekstrakter for DNA-amplifisering. Sitrusblader brukes i verktøyet.Punch de få bitene av bladskiver fra blad. Sett bladskiver i et 1,5 milliliter Eppendorf-rør. Tilsett deretter 200 mikroliter buffer A i røret.Mal bladskivene til de er glatte med en plaststang manuelt. La røret stå uforstyrret i 10 minutter. Supernatanten blir deretter påført DNA-amplifisering.For isotermisk DNA-amplifisering, tilsett en mikroliter supernatant fra trinn 2.3 og en mikroliter magnesiumacetat i løsning B og bland godt. I laboratoriet, inkuberer dem i en enkel inkubator ved 37 grader i 15 minutter. For å visualisere resultatene, tilsett 10 mikroliter av blandingen fra trinn 3,2 til løsning C og bland godt.Inkuber dem i 37 graders inkubator i 60 minutter. Bruk en vernebriller, og observer det grønne fluorescenssignalet gjennom en håndholdt fluorescerende deteksjonsenhet. For å teste spesifisiteten til CLas-DETECTR, første rene kolonier av Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.citri som er patogenet til sitrus canker og Burkholderia stabilis stamme 1440 isolert i vårt laboratorium ble brukt til å trekke ut deres genomiske DNA. Deretter ble dette tre bakteriegenomiske DNA og CLas-positive Newhall-bladene genomisk DNA utsatt for CLas-DETECTR-testen. For å teste følsomheten til CLas-DETECTR ble det påvist en serie CLas DNA-fragmentfortynninger ved hjelp av PCR, CLas-DETECTR og qPCR som beskrevet i protokollen Etter spesifisiteten og følsomhetstesten ble CLas-DETECTR-metoden brukt til å oppdage tilstedeværelsen av CLas i feltet.Bladprøver samlet fra Newhall søt appelsintre dyrket i germplasm ressurs barnehage på campus av Gannan Normal University, Jiangxi, Kina. qPCR, en overbevisende CLas-deteksjonsmetode som vanligvis brukes i laboratoriet, ble også brukt. Bladprøvene fra HLB-infiserte og HLB-uinfiserte Newhall-treet, der tilstedeværelsen av CLas ble bekreftet i laboratoriet vårt, ble utsatt for CLas-DEECTR-testen.Det grønne fluorescenssignalet ble fanget opp i den HLB-infiserte prøven, men ikke i den HLB-infiserte og negative kontrollen. Vi bestemte spesifisiteten til CLas-DETECTR ved bruk av nukleinsyrer ekstrahert fra andre bakterier. I CLas-DETECTR-analysen viste bare gDNA ekstrahert fra CLas-positive Newhall-blader grønne fluorescerende signaler.gDNA ekstrahert fra Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri og Burkholderia stabilis stamme 1440 gjorde det ikke, noe som betyr at CLas-DETECTR kan oppdage CLas spesifikt. Vi testet også følsomheten til CLas-DETECTR ved hjelp av en serie CLas DNA-fortynninger, oppført i protokollen.PCR kan oppdage 201 kopier per megaliter. På den annen side kan CLas-DETECTR oppdage 2,01 kopier per megaliter, noe som tyder på tilgjengeligheten som en sensitiv feltdiagnostikk. qPCR kan oppdage 0,201 kopier per megaliter og Ct-verdien er høyere enn 36.Så CLas-DETECTR er to størrelsesordener mer følsomme enn tradisjonell PCR og en størrelsesorden mindre følsom enn qPCR når fortynnede CLas-spesifikke amplikoner ble brukt. Til slutt undersøkte du muligheten for CLas-DETECTR for feltprøver, og sammenlignet følsomheten med qPCR. I tall ser vi.Vi kan se at Ct-verdien er høyere enn 36 når CLas-konsentrasjonen er mindre enn 0.2 kopier per megaliter, noe som er en veldig lav konsentrasjon. Blant de 15 prøvene var Ct-verdien av prøvene 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 og 14 påvist av qPCR mindre enn 36. En tilsynelatende grønn fluorescenssignaler ble observert.På den annen side, da Ct-verdien av prøvene 6, 7, 9, 12 og 15 oppdaget av qPCR var ubestemt, ble det ikke observert grønne fluorescerende signaler. I tillegg ble det observert svake grønne fluorescerende signaler når CT-verdien av prøve 5 og 11 påvist ved qPCR var høyere enn 36. Resultatene vil tyde på at plattformen vår er et raskt, robust og følsomt verktøy for HLB-diagnostikk i felt.

Research

JoVE Journal

Biology

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Kromosom Replikere Timing Kombinert med fluoriserende<em&gt; I situ</em&gt; Hybridisering

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rask og effektiv Sebrafisk Genotyping Bruke PCR med høy oppløsning Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolasjon fra Cell spesifikke subpopulasjoner Bruke Laser-fangst mikrodisseksjon Kombinert med Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Utvikling av en kvantitativ rekombinase Polymerase Amplification analysen med en intern positiv kontroll

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...