Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
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Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Programa Nacional de P & D da China (2021YFD1400805), o Programa de P & D de Ciência e Tecnologia da Província de Jiangxi (20194ABC28007), Projetos do Departamento de Educação de Jiangxi (GJJ201449) e a Inovação Colaborativa da Pesquisa Científica Agrícola Moderna na Província de Jiangxi (JXXTCX2015002(3+2)-003).

1. Construção do CLas-DETECTR
NOTA: A construção do CLas-DETECTR é um processo de quatro etapas: preparação da solução, isolamento do DNA total dos citros, amplificação isotérmica do DNA e visualização dos resultados. O esquema do ensaio CLas-DETECTR é ilustrado na Figura 1A.
<ol><li>Preparação da solução<ol><li>Preparar tampão A: 20 mM de NaOH em 6% de PEG 200. Para 100 ml, adicione 113 mg de NaOH e 6 g de PEG 200 em 80 ml de H2O ...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+from+Murraya+paniculata+in+Guandong,+China.">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).</li><li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+in+citrus,+and+identification+by+GeLC-MS/MS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens.">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272 (2016).</li><li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+solanacearum'+in+potatoes+and+psyllids.">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li><li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+diagnostics+with+CRISPR.">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13,+Cas12a,+and+Csm6.">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay.">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).</li><li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics.">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568 (2021).</li><li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV,+TEV,+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13.">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay.">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li><li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+amplification:+Basics,+applications+and+recent+advances.">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules.">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;:+Biological+implications+and+PCR+detection+application.">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020 (2016).</li><li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria,+eukaryotic+tissue+samples,+and+whole+blood.">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li><li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

Este estudo apresenta um método rápido e portátil para detecção de CLas denominado CLas-DETECTR, que combina os sistemas RPA e CRISPR-Cas12a. O fluxo de trabalho é ilustrado na Figura 1. O CLas-DETECTR detecta CLas com especificidade e sensibilidade (Figura 2 e Figura 3). Além disso, usando amostras de folhas de Newhall, o CLas-DETECTR detecta CLas com a mesma sensibilidade que a qPCR (Fi...

O Huanglongbing (HLB) é uma das doenças cítricas mais problemáticas do mundo1. O HLB é causado pela bactéria colonizadora de floemas e fastidiosa Candidatus Liberibacter spp., incluindo Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus e Ca. L. americanus 2. A espécie associada ao HLB mais prevalente na China e nos EUA é a CLas, que é transmitida por psilídeos cítricos asiáticos (Diaphorina citri) ou por enxerto3. Após serem infectadas por CLas, as árvores cítricas demonstram declínio de crescimento até a morte2. Os sintomas comuns das folhas cítricas infectadas com CLas são manchas manchadas, ilhas verdes (pequenos pontos circulares verde-escuros), veias de cortiça levantadas em folhas mais grossas e coriáceas e brotos amarelados não uniformes2. Além disso, os frutos infectados com CLas parecem pequenos e desequilibrados2.
Como nenhuma variedade cítrica é resistente ao HLB e não há cura terapêutica para o HLB, a prevenção do HLB requer a quarentena e o isolamento de citros CLas-positivos 2,3. Portanto, a detecção precoce é fundamental para o monitoramento e a quarentena para evitar a disseminação de CLas e minimizar as perdas econômicas3. Além disso, a detecção de CLas sensíveis é necessária devido ao baixo título de CLas em plantas durante o estágio inicial da infecção3. Na China, a detecção de CLas é geralmente conduzida por certos centros de teste certificados. No entanto, o processo de detecção geralmente leva pelo menos 1 semana, e a taxa de detecção é cara. Portanto, para ajudar a monitorar a incidência de HLB
Diversas tecnologias têm sido aplicadas para diagnosticar o HLB 4,5,6,7,8,9. A reação em cadeia da polimerase (PCR) e a PCR quantitativa (qPCR) são as ferramentas mais utilizadas para a detecção de CLas devido à sua alta sensibilidade e especificidade 4,5. No entanto, essas tecnologias dependem fortemente de instrumentos caros e pessoal altamente qualificado. Além disso, vários métodos de amplificação isotérmica, como a amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), têm sido desenvolvidos como alternativas atraentes aos métodos convencionais de PCR devido à sua simplicidade, rapidez e baixo custo 8,9,10. No entanto, é um desafio aplicá-los para detectar com precisão CLas devido aos sinais de amplificação não específicos, o que pode causar resultados falso-positivos.
A detecção de ácido nucleico à base de endonuclease CRISPR/Cas guiada por RNA (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas/associadas a CRISPR) foi desenvolvida como uma tecnologia de diagnóstico molecular de última geração devido à sua alta sensibilidade, especificidade e confiabilidade 11,12,13,14. Essas tecnologias de diagnóstico CRISPR/Cas dependem da atividade nuclease colateral das proteínas Cas para clivar o DNA de fita simples (ssDNA) modificado com um repórter fluorescente e um quencher de fluorescência em cada extremidade dos oligonucleotídeos, bem como um dispositivo de detecção de fluorescência para capturar o repórter fluorescente liberado11,12 . A atividade nuclease de vários efetores de Cas ativados pelo duplex alvo de RNA CRISPR (crRNA) pode clivar indiscriminadamente o ssDNA não-alvo circundante11. O CRISPR-Cas12a (também chamado de Cpf 1), um sistema CRISPR/CAS tipo classe 2 do tipo 2, demonstra diversas vantagens em relação ao Cas9, como menor tolerância à incompatibilidade e maior especificidade13. O sistema Cas12a/crRNA tem sido aplicado para a detecção sensível e específica dos ácidos nucleicos de patógenos e fitopatógenos humanos 14,15,16,17,18. Portanto, a utilização do sistema Cas12a/crRNA deve permitir a detecção precisa e sensível do ácido nucleico de CLas.
Cas12a sozinho não é teoricamente sensível o suficiente para detectar baixos níveis de ácidos nucleicos. Portanto, para melhorar sua sensibilidade de detecção, a detecção de CRISPR-Cas12a é tipicamente combinada com uma etapa de amplificação isotérmica14,15. A amplificação da recombinase polimerase (RPA) permite a amplificação sensível e rápida do DNA isotérmico em uma faixa de temperatura de 37 °C a 42 °C19.
Uma plataforma de detecção chamada DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) que combina a atividade da DNase de Cas12a com RPA e uma leitura de fluorescência foi recentemente concebida12 e demonstrou detectar ácido nucleico com maior sensibilidade20. Além disso, o sinal de fluorescência emitido pelas amostras positivas pode ser observado através de um dispositivo portátil de detecção de fluorescência no campo.
Como amplificamos o DNA com RPA, projetamos crRNA visando o gene nrdB de cinco cópias (ribonucleotídeo redutase β- subunidade) específico para CLas21 e empregamos a atividade DNase da proteína Cas12a, chamamos esse método de detecção de CLas de CLas-DETECTR. Em comparação com os métodos de detecção CLas existentes, o CLas-DETECTR é rápido, preciso, sensível e implantável.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

A detecção precoce de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) por citricultores facilita a intervenção precoce e previne a propagação da doença. Um método simples para o diagnóstico rápido e portátil de Huanglongbing (HLB) é apresentado aqui que combina amplificação da recombinase polimerase e um repórter fluorescente utilizando a atividade nuclease do sistema palindrômico curto agrupado regularmente interespaçado/CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a). A sensibilidade desta técnica é muito maior do que a PCR. Além disso, este método mostrou resultados semelhantes à qPCR quando as amostras foliares foram utilizadas. Em comparação com os métodos convencionais de detecção de CLas, o método de detecção aqui apresentado pode ser concluído em 90 min e funciona em uma condição isotérmica que não requer o uso de máquinas de PCR. Além disso, os resultados podem ser visualizados através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente no campo.

Aqui, descrevemos uma plataforma portátil, CLas-DETECTR, que vasculha os sistemas RPA e CRISPR-Cas12a para diagnosticar o HLB em campo. O esquema do CLas-DETECTR é ilustrado na Figura 1A.
Quando amostras foliares das árvores de Newhall infectadas e não infectadas por HLB (Figura 1B), para as quais a presença de CLas foi confirmada por PCR (Figura 1C), foram submetidas ao teste CLas-DETECTR, observou-se sinal de fluorescência verde na amostra infectada por HL...

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Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Neste trabalho, foi desenvolvido um método de detecção rápido, sensível e portátil de Candidatus Liberibacter asiaticus baseado na amplificação da recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a.

Detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus implantável em campo usando amplificação de recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, abreviado como HLB. É uma doença cítrica devastadora em todo o mundo. Nos países mais produtores de citros, como a China e os EUA, o HLB é causado pela bactéria restrita ao floema Candidatus Liberibacter asiaticus, abreviada como CLas.A detecção precoce de CLas foi importante para os produtores, facilitando a intervenção precoce e prevenindo a propagação da doença. Então, aqui desenvolvemos um novo método para o diagnóstico rápido e portátil de HLB, combinando com a amplificação da recombinase polimerase e o sistema CRISPR-Cas12a. Nós o chamamos de CLas-DETECTR.A sensibilidade da nossa plataforma é muito maior do que a PCR. Além disso, apresenta resultado semelhante com qPCR quando as amostras foliares foram utilizadas. Comparando com as detecções CLas convencionais, nosso método pode ser concluído em 90 minutos e funciona em uma condição isotérmica.O resultado também pode ser visualizado através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente no campo. O CLas-DETECTR contém quatro etapas: preparação da solução, isolamento do DNA total dos citros, amplificação isotérmica do DNA e os resultados da visualização. O esquema do ensaio CLas-DETECTR é ilustrado aqui.O buffer A, a solução B e a solução C são preparados conforme descrito no protocolo. Para economizar tempo e tornar este método adequado para a detecção de CLas de campo, a abordagem à base de polietilenoglicol E.coli foi usada para obter extratos brutos de plantas para amplificação de DNA. As folhas cítricas são usadas na ferramenta.Soque os poucos pedaços de discos de folha de folha. Coloque os discos de folha em um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão A no tubo.Moer os discos foliares até ficarem lisos com uma haste de plástico manualmente. Deixe o tubo intacto por 10 minutos. O sobrenadante é subsequentemente aplicado à amplificação do DNA.Para amplificação isotérmica do DNA, adicione um microlitro de sobrenadante da etapa 2.3 e um microlitro de acetato de magnésio na Solução B e misture bem. No laboratório, incube-os em uma incubadora simples a 37 graus por 15 minutos. Para visualizar os resultados, adicione 10 microlitros da mistura da etapa 3.2 na Solução C e misture bem.Incube-os na incubadora de 37 graus por 60 minutos. Use um óculos e observe o sinal de fluorescência verde através de um dispositivo de detecção fluorescente portátil. Para testar a especificidade do CLas-DETECTR, primeiras colônias puras de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.citri que é o patógeno do cancro cítrico e Burkholderia stabilis cepa 1440 isolada em nosso laboratório foram utilizados para extrair seu DNA genômico. Em seguida, este DNA genômico de três bactérias e o DNA genômico de folhas de Newhall CLas positivo foram submetidos ao teste CLas-DETECTR. Para testar a sensibilidade do CLas-DETECTR, uma série de diluições de fragmentos de DNA de CLas foram detectadas usando PCR, CLas-DETECTR e qPCR, conforme descrito no protocolo Após o teste de especificidade e sensibilidade, o método CLas-DETECTR foi usado para detectar a presença do CLas em campo.Amostras de folhas coletadas da laranjeira doce Newhall cultivada no viveiro de recursos de germoplasma no campus da Universidade Normal de Gannan, Jiangxi, China. qPCR, um método convincente de detecção de CLas geralmente usado no laboratório também foi aplicado. As amostras foliares da árvore de Newhall infectada e não infectada pelo HLB, nas quais a presença do CLas foi confirmada em nosso laboratório, foram submetidas ao teste CLas-DETECTR.O sinal de fluorescência verde foi capturado na amostra infectada pelo HLB, mas não no controle negativo e não infectado pelo HLB. Determinamos a especificidade do CLas-DETECTR utilizando ácidos nucleicos extraídos de outras bactérias. No ensaio CLas-DETECTR, apenas o gDNA extraído de folhas de Newhall CLas-positivas demonstrou sinais fluorescentes verdes.gDNA extraído de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri e Burkholderia stabilis cepa 1440 não, o que significa que o CLas-DETECTR pode detectar CLas especificamente. Também testamos a sensibilidade do CLas-DETECTR usando uma série de diluições de DNA CLas, listadas no protocolo.PCR pode detectar 201 cópias por megalitro. Por outro lado, o CLas-DETECTR pode detectar 2,01 cópias por megalitro, sugerindo sua disponibilidade como um diagnóstico de campo sensível. qPCR pode detectar 0,201 cópias por megalitro e o valor de Ct é superior a 36.Assim, o CLas-DETECTR é duas ordens de magnitude mais sensível que a PCR tradicional e uma ordem de magnitude menos sensível que a qPCR quando foram utilizados amplificadores específicos de CLas diluídos. Finalmente, reexaminou a viabilidade do CLas-DETECTR para amostras de campo e comparou sua sensibilidade com a qPCR. Em números, vemos.Podemos ver que o valor de Ct é superior a 36 quando a concentração de CLas é inferior a 0,2 cópias por megalitro, o que é uma concentração muito baixa. Dentre as 15 amostras, o valor de Ct das amostras 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 e 14 detectadas por qPCR foi inferior a 36. Observou-se um sinal de fluorescência verde aparente.Por outro lado, quando o valor de Ct das amostras 6, 7, 9, 12 e 15 detectado por qPCR foi indeterminado, não foram observados sinais fluorescentes verdes. Além disso, sinais fluorescentes verdes fracos foram observados quando o valor da TC das amostras 5 e 11 detectado pela qPCR foi superior a 36. Os resultados sugerirão que nossa plataforma é uma ferramenta rápida, robusta e sensível para o diagnóstico de HLB no campo.

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