Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Эта работа была финансово поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2021YFD1400805), Программой исследований и разработок в области науки и техники провинции Цзянси (20194ABC28007), проектами Департамента образования Цзянси (GJJ201449) и Совместными инновациями современных сельскохозяйственных научных исследований в провинции Цзянси (JXXTCX2015002(3 +2)-003).

1. Конструкция CLas-DETECTR
ПРИМЕЧАНИЕ: Построение CLas-DETECTR представляет собой четырехэтапный процесс: приготовление раствора, полная изоляция ДНК цитрусовых, изотермическая амплификация ДНК и визуализация результатов. Схема анализа CLas-DETECTR проиллюстрирована на рис?...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR.">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37 (2009).</li><li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR.">Multiplex detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).</li><li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+from+Murraya+paniculata+in+Guandong,+China.">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).</li><li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+in+citrus,+and+identification+by+GeLC-MS/MS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens.">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272 (2016).</li><li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus,+a+causal+agent+of+citrus+Huanglongbing.">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing.</a> The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).</li><li>Ghosh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+recombinase+polymerase+based+isothermal+amplification+combined+with+lateral+flow+assay+(HLB-RPA-LFA)+for+rapid+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;.">Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;.</a> PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).</li><li>Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+solanacearum'+in+potatoes+and+psyllids.">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li><li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+diagnostics+with+CRISPR.">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13,+Cas12a,+and+Csm6.">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay.">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).</li><li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics.">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568 (2021).</li><li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV,+TEV,+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13.">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay.">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li><li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+amplification:+Basics,+applications+and+recent+advances.">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules.">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;:+Biological+implications+and+PCR+detection+application.">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020 (2016).</li><li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria,+eukaryotic+tissue+samples,+and+whole+blood.">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li><li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

Это исследование представляет собой быстрый и портативный метод обнаружения CA под названием CLas-DETECTR, который сочетает в себе системы RPA и CRISPR-Cas12a. Рабочий процесс показан на рисунке 1. CLas-DETECTR обнаруживает CA со специфичностью и чувствительностью (рисунок 2 ...

Хуанлунбин (HLB) является одним из самых проблемных цитрусовых заболеваний во всем мире1. HLB вызывается флоэмно-колонизирующими и привередливыми бактериями Candidatus Liberibacter spp., включая Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus и Ca. L. americanus2. Наиболее распространенным HLB-ассоциированным видом в Китае и США является CLas, который передается азиатскими цитрусовыми псиллидами (Diaphorina citri) или через прививку3. После заражения CLas цитрусовые деревья демонстрируют снижение роста до смерти2. Общими симптомами листьев цитрусовых, инфицированных CLas, являются пятнистая пятнистость, зеленые островки (маленькие круглые темно-зеленые точки), приподнятые пробковые прожилки на более толстых и кожистых листьях и неоднородные желтеющие побеги2. Кроме того, плоды, зараженные КЛА, кажутся мелкими и однобокими2.
Поскольку ни один сорт цитрусовых не устойчив к HLB и нет терапевтического лечения HLB, профилактика HLB требует карантина и изоляции CLas-положительных цитрусовых деревьев 2,3. Поэтому раннее выявление имеет решающее значение для мониторинга и карантина, чтобы предотвратить распространение CLas и минимизировать экономические потери3. Кроме того, необходимо обнаружение чувствительных CLas из-за низкого титра CLas у растений на ранней стадии инфекции3. В Китае обнаружение CLas обычно проводится определенными сертифицированными испытательными центрами. Тем не менее, процесс обнаружения обычно занимает не менее 1 недели, а плата за обнаружение стоит дорого. Таким образом, чтобы помочь контролировать заболеваемость HLB
Для диагностики HLB 4,5,6,7,8,9 были применены различные технологии. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественная ПЦР (qPCR) являются наиболее используемыми инструментами для обнаружения CLas из-за их высокой чувствительности и специфичности 4,5. Однако эти технологии в значительной степени зависят от дорогостоящих инструментов и высококвалифицированного персонала. Кроме того, несколько методов изотермической амплификации, таких как петлевая изотермическая амплификация (LAMP), были разработаны в качестве привлекательных альтернатив традиционным методам ПЦР из-за их простоты, быстроты и низкой стоимости 8,9,10. Тем не менее, трудно применить их для точного обнаружения CA из-за неспецифических сигналов усиления, которые могут привести к ложноположительным результатам.
РНК-управляемый CRISPR/Cas (кластеризованный регулярно чередующийся короткие палиндромные повторы/CRISPR-ассоциированный) обнаружение нуклеиновых кислот на основе эндонуклеазы было разработано как технология молекулярной диагностики следующего поколения благодаря своей высокой чувствительности, специфичности и надежности 11,12,13,14. Эти технологии диагностики CRISPR/Cas основаны на коллатеральной нуклеазной активности белков Cas для расщепления одноцепочечной ДНК (ssDNA), модифицированной флуоресцентным репортером и флуоресцентным гасителем на каждом конце олигонуклеотидов, а также на устройстве обнаружения флуоресценции для захвата выпущенного флуоресцентного репортера11,12 . Нуклеазная активность нескольких эффекторов Cas, активированных дуплексом-мишенью CRISPR РНК (crRNA), может без разбора расщеплять окружающую нецелевую ssDNA11. CRISPR-Cas12a (также называемая Cpf 1), система V-A CRISPR/Cas типа класса 2, демонстрирует несколько преимуществ по сравнению с Cas9, таких как более низкий допуск на несоответствие и большая специфичность13. Система Cas12a/crRNA была применена для чувствительного и специфического обнаружения нуклеиновых кислот патогенов человека и фитопатогенов 14,15,16,17,18. Поэтому использование системы Cas12a/crRNA должно обеспечить точное и чувствительное обнаружение нуклеиновой кислоты CLas.
Cas12a сам по себе недостаточно теоретически чувствителен для обнаружения низких уровней нуклеиновых кислот. Поэтому, чтобы улучшить чувствительность обнаружения, обнаружение CRISPR-Cas12a обычно сочетается с изотермической стадией усиления14,15. Амплификация рекомбиназы полимеразы (RPA) обеспечивает чувствительную и быструю изотермическую амплификацию ДНК в диапазоне температур от 37 °C до 42 °C19.
Недавно была разработана платформа обнаружения под названием DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), которая сочетает в себе активность ДНКазы Cas12a с RPA и флуоресцентным считыванием12 и, как было показано, обнаруживает нуклеиновые кислоты с более высокой чувствительностью20. Кроме того, флуоресцентный сигнал, излучаемый положительными образцами, можно наблюдать через портативное устройство обнаружения флуоресценции в полевых условиях.
Поскольку мы амплировали ДНК с помощью RPA, разработали crRNA, нацеленную на пятикопийный ген nrdB (рибонуклеотидредуктаза β-субъединица), специфичный для CLas21, и использовали активность ДНКазы белка Cas12a, мы назвали этот метод обнаружения CLas CLas-DETECTR. По сравнению с существующими методами обнаружения CA, CLas-DETECTR является быстрым, точным, чувствительным и развертываемым.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

Раннее выявление Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) производителями цитрусовых облегчает раннее вмешательство и предотвращает распространение заболевания. Здесь представлен простой метод быстрой и портативной диагностики Huanglongbing (HLB), который сочетает в себе амплификацию полимеразы рекомбиназы и флуоресцентный репортер, использующий нуклеазную активность кластеризованной регулярно интерраспространенной короткой палиндромной системы / CRISPR-ассоциированных 12a (CRISPR-Cas12a). Чувствительность этой методики намного выше, чем ПЦР. Кроме того, этот метод показал результаты, аналогичные qPCR, когда использовались образцы листьев. По сравнению с обычными методами обнаружения CLas, метод обнаружения, представленный здесь, может быть завершен за 90 мин и работает в изотермическом состоянии, не требующем использования аппаратов ПЦР. Кроме того, результаты могут быть визуализированы с помощью портативного флуоресцентного устройства обнаружения в полевых условиях.

Здесь мы описали портативную платформу CLas-DETECTR, объединяющую системы RPA и CRISPR-Cas12a для диагностики HLB в полевых условиях. Схема CLas-DETECTR проиллюстрирована на рисунке 1A.
Когда образцы листьев из деревьев Ньюхолла, инфицированных HLB и HLB-неинфицированных (<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

В этой работе был разработан быстрый, чувствительный и портативный метод обнаружения Candidatus Liberibacter asiaticus на основе амплификации полимеразы рекомбиназы в сочетании с CRISPR-Cas12a.

Полевое развертывание Candidatus Liberibacter asiaticus Detection с использованием амплификации полимеразы рекомбиназы в сочетании с CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Хуан Лонг Бин, сокращенно HLB. Это разрушительная болезнь цитрусовых во всем мире. В большинстве стран-производителей цитрусовых, таких как Китай и США, HLB вызывается бактериями, ограниченными флоэмой, Candidatus Liberibacter asiaticus, сокращенно CLas.Раннее выявление CLas имеет важное значение для производителей, способствующих раннему вмешательству и предотвращению распространения болезни. Поэтому здесь мы разработали новый метод быстрой и портативной диагностики HLB, в сочетании с рекомбиназной полимеразной амплификацией и системой CRISPR-Cas12a. Мы назвали его CLas-DETECTR.Чувствительность нашей платформы намного выше, чем у ПЦР. Кроме того, он показывает аналогичный результат с qPCR, когда использовались образцы листьев. По сравнению с обычными обнаружениями CLas, наш метод может быть завершен за 90 минут и работает в изотермическом состоянии.Результат также может быть визуализирован с помощью портативного флуоресцентного устройства обнаружения в полевых условиях. CLas-DETECTR содержит четыре этапа: приготовление раствора, полная изоляция ДНК цитрусовых, изотермическая амплификация ДНК и результаты визуализации. Схема анализа CLas-DETECTR проиллюстрирована здесь.Буфер A, раствор B и раствор C готовятся так, как описано в протоколе. Чтобы сэкономить время и сделать этот метод пригодным для обнаружения полевых CLas, для получения сырых растительных экстрактов для амплификации ДНК был использован подход на основе полиэтиленгликоля E.coli. В средстве используются листья цитрусовых.Выбейте несколько кусочков листовых дисков из листа. Поместите листовые диски в 1,5-миллилитровую трубку Эппендорфа. Затем добавьте 200 микролитр буфера А в трубку.Измельчите листовые диски до однородной массы с помощью пластикового стержня вручную. Оставьте тюбик нетронутым в течение 10 минут. Супернатант впоследствии применяют для амплификации ДНК.Для изотермической амплификации ДНК добавьте один микролитр супернатанта со стадии 2.3 и один микролитр ацетата магния в раствор B и хорошо перемешайте. В лаборатории инкубируют их в простом инкубаторе при 37 градусах в течение 15 минут. Чтобы визуализировать результаты, добавьте 10 микролитров смеси со стадии 3.2 в раствор С и хорошо перемешайте.Высиживайте их в инкубаторе 37 градусов в течение 60 минут. Наденьте очки и наблюдайте за зеленым флуоресцентным сигналом через портативное флуоресцентное устройство обнаружения. Для проверки специфичности CLas-DETECTR используются первые чистые колонии Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.Citri, который является патогеном цитрусовой язвы и штамма Burkholderia stabilis 1440, выделенных в нашей лаборатории, были использованы для извлечения их геномной ДНК. Затем эти три бактерии геномной ДНК и CLas-положительная геномная ДНК листьев Ньюхолла были подвергнуты тесту CLas-DETECTR. Для проверки чувствительности CLas-DETECTR была обнаружена серия разбавлений фрагментов ДНК CLas с использованием PCR, CLas-DETECTR и qPCR, как описано в протоколе После теста на специфичность и чувствительность был использован метод CLas-DETECTR для обнаружения присутствия CLas в поле.Образцы листьев, собранные из сладкого апельсинового дерева Ньюхолла, выращенного в питомнике ресурсов зародышевой плазмы в кампусе Ганнаньского педагогического университета, Цзянси, Китай. qPCR, убедительный метод обнаружения CA, обычно используемый в лаборатории, также был применен. Образцы листьев из HLB-инфицированного и HLB-неинфицированного дерева Ньюхолла, в которых присутствие CLas было подтверждено в нашей лаборатории, были подвергнуты тесту CLas-DETECTR.Зеленый флуоресцентный сигнал был захвачен в образце, инфицированном HLB, но не в HLB-неинфицированном и отрицательном контроле. Мы определили специфичность CLas-DETECTR с помощью нуклеиновых кислот, извлеченных из других бактерий. В анализе CLas-DETECTR только гДНК, извлеченная из CLas-положительных листьев Ньюхолла, продемонстрировала зеленые флуоресцентные сигналы.гДНК, извлеченная из Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri и Burkholderia stabilis штамма 1440, этого не сделала, что означает, что CLas-DETECTR может специфически обнаруживать CLas. Мы также проверили чувствительность CLas-DETECTR с использованием серии разбавлений ДНК CLas, перечисленных в протоколе.ПЦР может обнаружить 201 копию на мегалитр. С другой стороны, CLas-DETECTR может обнаруживать 2,01 копии на мегалитр, что свидетельствует о его доступности в качестве чувствительной полевой диагностики. qPCR может обнаруживать 0,201 копии на мегалитр, а значение Ct выше 36.Таким образом, CLas-DETECTR на два порядка более чувствителен, чем традиционная ПЦР, и на один порядок менее чувствителен, чем qPCR, когда использовались разбавленные специфические ампликоны CLas. Наконец, пересмотрена осуществимость CLas-DETECTR для полевых образцов и проведено сравнение его чувствительности с qPCR. В цифрах мы видим.Мы видим, что значение Ct выше 36, когда концентрация CLas составляет менее 0,2 копий на мегалитр, что является очень низкой концентрацией. Среди 15 образцов значение Ct образцов 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 и 14, обнаруженных qPCR, было менее 36. Наблюдались явные зеленые флуоресцентные сигналы.С другой стороны, когда значение Ct образцов 6, 7, 9, 12 и 15, обнаруженных qPCR, было неопределенным, зеленых флуоресцентных сигналов не наблюдалось. Кроме того, слабые зеленые флуоресцентные сигналы наблюдались, когда значение КТ образцов 5 и 11, обнаруженных qPCR, было выше 36. Результаты будут свидетельствовать о том, что наша платформа является быстрым, надежным и чувствительным инструментом для диагностики HLB в полевых условиях.

Research

JoVE Journal

Biology

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Маркировка стволовых клеток с флуоресцентными красителями для неинвазивного обнаружения оптических изображений с

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Принципы сайт-специфического рекомбиназы (SSR) Технология

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Молекулярная эволюция Tre рекомбиназы

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Интервью: ВИЧ-1 провирусной Иссечение ДНК Использование Evolved рекомбиназы

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Хромосома Репликация времени в сочетании с Флуоресцентные<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Быстрое и эффективное данио рерио Генотипирование Использование ПЦР с высоким разрешением расплава анализа

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Выделение РНК из клеточных конкретные подгруппы с помощью лазера захвата микродиссекции в сочетании с быстрым иммунноокрашивания

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Развитие количественной рекомбиназу полимеразной амплификации с внутреннего положительного контроля

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...